La ricostruzione esofagea è una procedura impegnativa e lo sviluppo di un esofago tissutale che consente la rigenerazione della mucosa e del muscolo esofageo e che può essere impiantato come un innesto artificiale. Qui, presentiamo il nostro protocollo per generare un esofago artificiale, tra cui la produzione di scaffold, la coltivazione di bioreattori e varie tecniche chirurgiche.
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Articolo metodologico
Innesto ingegnerizzato per la ricostruzione esofagea circonferenza nei ratti
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'uso di materiali biocompatibili per la ricostruzione esofagea circonferenziale è un compito tecnicamente impegnativo nei ratti e richiede una tecnica di impianto ottimale con supporto nutrizionale. Recentemente, ci sono stati molti tentativi di ingegneria dei tessuti esofagei, ma il tasso di successo è stato limitato a causa della difficoltà nell'epitelizzazione precoce nell'ambiente speciale della peristalsi. Qui, abbiamo sviluppato un esofago artificiale che può migliorare la rigenerazione della mucosa esofagea e degli strati muscolari attraverso uno scaffold tubolare a due strati, un sistema di bioreattore basato su cellule staminali mesenchymal, e una tecnica di alimentazione di bypass con modifica Gastrostomy. L'impalcatura è fatta di nanofibre di poliuretano (PU) in forma cilindrica con un filo policaprolactone stampato tridimensionale (3D) avvolto intorno alla parete esterna. Prima del trapianto, le cellule staminali mesenchimale derivate dall'uomo venivano seminata nel lume dell'impalcatura, e la coltivazione del bioreattore è stata eseguita per migliorare la reattività cellulare. Abbiamo migliorato il tasso di sopravvivenza dell'innesto applicando l'anastomosi chirurgica e coprendo la protesi impiantata con un lembo della ghiandola tiroidea, seguita da alimentazione temporanea della gastrostomia non orale. Questi innesti sono stati in grado di ricapitolare i risultati dell'epitelializzazione iniziale e della rigenerazione muscolare intorno ai siti impiantati, come dimostrato dall'analisi istologica. Inoltre, sono state osservate fibre di elastina aumentate e neovascolarizzazione nella periferia dell'innesto. Pertanto, questo modello presenta una nuova potenziale tecnica per la ricostruzione esofagea circonferenziale.
Introduzione
Il trattamento dei disturbi esofagei, come malformazioni congenite e carcinomi esofagei, può portare alla perdita di segmento strutturale dell'esofago. Nella maggior parte dei casi, gli innesti di sostituzione autologia, come condotti gastrici pull-up o interposizioni del colon, sono stati eseguiti1,2. Tuttavia, queste sostituzioni esofagee hanno una varietà di complicazioni chirurgiche e rischi di rioperazione3. Così, l'uso di scaffold di esofago tessuto-ingegnerizzato imitando l'esofago nativo può essere una strategia alternativa promettente per rigenerare i tessuti persi
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Protocollo
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC N. 17-0164-S1A0) del Seoul National University Hospital.
1. Produzione di scaffold
NOTA: gli scaffold esofagei a due strati vengono prodotti combinando l'elettrospinning e la stampa 3D. La membrana interna dell'impalcatura tubolare è stata fabbricata mediante poliuretano elettrostrato (PU) con maciandi rotanti in acciaio inossidabile come i collettori9.
- Per la preparazione di nanofibre tubolari PU, preparare una soluzione del 20% (w/v) di polimero PU mescolando in N,N-dimetil....
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Risultati
La figura 1 mostra un diagramma schematico del processo di produzione dello scaffold tubolare a due strati PU-PCL. La soluzione PU è stata elettrospun da un ago da 18 G per creare una struttura interna cilindrica con uno spessore di 200 m. Quindi, la PCL fusa è stata stampata sulla parete esterna della nanofibra PU a intervalli regolari. La morfologia superficiale delle pareti interne ed esterne dello scaffold tubolare completato può essere vista nelle immagi.......
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Discussione
Gli studi esistenti sugli animali sull'esofago artificiale sono ancora limitati da diversi fattori critici. Lo scaffold esofageo artificiale ideale deve essere biocompatibile e avere eccellenti proprietà fisiche. Dovrebbe essere in grado di rigenerare l'epitelio mucosale nel primo periodo postoperatorio per prevenire perdite anastomiche. La rigenerazione degli strati muscolari longitudinali circolari ed esterni è importante anche per la peristalsi funzionale12,13.......
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Dichiarazioni
Il sistema di bioreattore progettato per questo studio è stato commercializzato (numero di modello: ACBF-100).
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta dal Progetto di R&S della tecnologia sanitaria coreana attraverso il Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finanziato dal Ministero della Salute & Welfare, dalla Repubblica di Corea (numero di sovvenzione: HI16C0362) e dalla Ricerca Scientifica di base Programma attraverso la National Research Foundation of Korea (NRF) finanziato dal Ministero dell'Istruzione (2017R1C1B2011132). Le biocampioni e i dati utilizzati in questo studio sono stati forniti dalla Biobank dell'Ospedale Nazionale dell'Università di Seoul, membro della Korea Biobank Network.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Gabbia metabolica | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (dose da 50 mg/g) | Virbac | 1000000188 | |
| 0,25% Tripsina-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Siringa da 1 mL | BD | 309659 | |
| 2% xilazina cloridrato (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldeide | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotico gentamicina (Settopale). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Tampone citrato, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB KIT SUBSTRATO PEROSSIDASI | VETTORE | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Kit colorante elastico | ScyTeK | ETS-1 | |
| Etanolo | Merck | 100983 | |
| Etanolo | Merck | 64-17-5 | |
| Fetale Bovino Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldeide | Sigma | 354400 | |
| Capra anti-Topo IgG (H+L) Anticorpo secondario | ThermoFisher | A-11001 | |
| Tappo di eparina | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / terreno di crescita (MesenPRO RSTM) | Invitrogen | R7788-110 | |
| Kit coniugato con perossidasi di rafano (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Perossido di idrogeno | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Cheratina13 | Novus | NBP1-97797 | |
| Kit di saggi di vitalità LIVE/DEAD | Sonde molecolari | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimetilformammide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Piastre per coltura tissutale a 24 pozzetti non aderenti . | Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Piastra di Petri | Eppendorf | 3072115 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polimero di policaprolattone (PCL) | Sigma | 440744 | |
| Polimero poliuretanico (PU+A2:A24) | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Alimentatore | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold reagente antidissolvenza con DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Tubo a T in silicone | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Unguento per gli occhi | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamina / Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Kit di colorazione tricromica | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
Riferimenti
- Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
- Flanagan, J. C., et al.
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Ristampe e permessi
