Isolamento e caratterizzazione delle vescicoli extracellulari prodotti da micobatteri a limite di ferro

Sommario

Mycobacterium tuberculosis mostra un aumento della produzione e del rilascio di vescibole extracellulari in risposta a basse condizioni di ferro. Questo lavoro descrive in dettaglio un protocollo per la generazione di basse condizioni e metodi di ferro per la purificazione e la caratterizzazione delle vesciche extracellulari micobatteriche rilasciate in risposta alla carenza di ferro.

Abstract

I micobatteri, tra cui Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l'agente causale della tubercolosi umana, rilasciano naturalmente vescicoli extracellulari (EV) contenenti molecole immunologicamente attive. La conoscenza dei meccanismi molecolari della biogenesi vescicante, del contenuto delle vescibole e delle loro funzioni nell'interfaccia patogeno-ospite è molto limitata. Per affrontare queste questioni sono necessarie procedure rigorose per l'isolamento, la purificazione e la convalida dei veicoli elettrici. In precedenza, la produzione di vescicola era migliorata quando M. tuberculosis era esposto a restrizione del ferro, una condizione riscontrata da Mtb nell'ambiente host. Presentato qui è un protocollo completo e dettagliato per isolare e purificare i veicoli elettrici dai micobatteri carenti di ferro. I metodi quantitativi e qualitativi vengono applicati per convalidare i VE purificati.

Introduzione

Le vescicole extracellulari micobatteriche (MEV) sono nanoparticelle legate alla membrana, di dimensioni di 60-300 nm, naturalmente rilasciate da micobatteri a crescita rapida e lenta¹. I MEV rilasciati dai micobatteri patogeni costituiscono un meccanismo per interagire con l'ospite tramite proteine immunologicamente attive, lipidi e glicolipidi secreti in modo concentrato e protetto^2,3,4. Per caratterizzare i MEV e comprenderne la biogenesi e le funzioni, sono cruciali metodi rigorosi ed efficienti di purificazione e convalida delle vesciche. Finora, i MEV sono stati isolati dalla coltura filtrati di micobatteri coltivati in un mezzo ricco di ferro^1,5,6,7,8.

Tuttavia, il lavoro precedente ha dimostrato che la limitazione del ferro stimola notevolmente il rilascio di vesciche in Mtb,possibilmente per catturare il ferro tramite mycobactin, un siderophore secreto in MEV⁹. Sebbene siano state descritte le procedure per l'isolamento dei MEV dai Mtb coltivati nell'alto mezzo di ferro, non è stata riportata una metodologia efficiente per ottenere MEV da culture di ferro basso. Pertanto, l'obiettivo di questo metodo è quello di isolare, purificare e quantificare i MEV ottenuti da colture di ferro basse in modo che possano essere utilizzati per saggi biochimici e funzionali e per l'analisi dei determinanti genetici della produzione di vescicoli nei micobatteri.

Protocollo

1. Preparazione del mezzo definito impoverito di ferro

1. Preparare 1 L di mezzo minimo (MM) sciogliendo 5 g di KH₂PO₄, 5 g di L-asparagine, 20 mL di glicerolo e 2 g di dextrose in 900 mL di acqua deionizzata in un contenitore di plastica. Evitare il vetro per evitare la contaminazione da ferro. Regolare il pH a 6,8 con 5 N NaOH e il volume a 1 L con acqua.
2. Aggiungere 50 g di resina metallica chelante (MCR) e agitare delicatamente con una barra di stirazione magnetica per 24 h a 4 gradi centigradi. Sterilizzare e rimuovere l'MCR filtrando attraverso un'unità filtro 0,22 m con un ricevitore di plastica. Per accelerare la filtrazione e prevenire l'intasamento dei filtri, lasciare che il sedimento di resina per circa 30 min prima della filtrazione.
   NOT: Questo mezzo contiene meno di 2 M di ferro residuo, come determinato dalla spettroscopia atomica ad assorbimento.
3. Supplemento MM con 0,5 mg/L di nCl₂, 40 mg/L di MgSO₄e 0,1 mg/L di MnSO₄. Separatamente, preparare le scorte concentrate (1,000x) di ciascuno degli integratori metallici in acqua deionizzata e sterilizzare per filtrazione prima del completamento MM. La MM integrata in metallo eibita al ferro sarà qui chiamata MM a basso ferro (LIMM).
4. Da uno stock di 50 mM di FeCl₃ sciolto in 10 mM HCl, aggiungere 1 mL a 1 L di LIMM (50 m concentrazione finale) per preparare l'alta ferro MM (HIMM).

2. Micobatteri in crescita in condizioni limitate di ferro

1. Scongelare 50 lun di uno stock di glicerolo del 15% congelato di Mtb e strisciare una piastra di agar integrata con 10% arricchimento ADN (5 g/L albumina, 2 g/L dextrose, e 0.85 g/L cloruro di sodio, 0.2% glicerol e 0.05% Tween-80)¹⁰. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi fino a quando le colonie sono visibili.
2. Inoculare una singola colonia di Mtb¹⁰ in 2 mL di brodo micobatterico medio (Tabella dei materiali) integrato con arricchimento ADN. Incubare con agitazione a 37 gradi centigradi.
3. Lasciare che la coltura Mtb cresca fino alla fase logaritmica tardiva (OD₅₄₀ è 0,8 dollari). Per verificare questo, misurare l'OD₅₄₀ utilizzando uno spettrometro.
4. Stendere 200 l della coltura logaritmica tardiva sulle piastre di agar micobatteriche (Tabella dei Materiali) completate con 0,2% glicerolo, 0,05% Tween-80 e ADN. Inoculare almeno 5 piatti. Incubare le piastre a 37 gradi centigradi fino a quando la crescita batterica è visibile come strato confluente. Questa operazione richiede 1 settimana per Mtb.
5. In LIMM è stato umido un tampone sterile di cotone. Utilizzare questo tampone per raccogliere i batteri dalle piastre di agar e inoculare 100 mL di LIMM per preparare una sospensione batterica concentrata con un OD₅₄₀ di 1,0 dollari.
6. Diluire questa sospensione 10 a 1 L con LIMM e dividerla in due bottiglie di plastica sterile da 2 L, ognuna contenente 500 mL di coltura.
7. Estrarre 2 mL di cultura e trasferirlo in un tubo di coltura 5 mL. Aggiungete 10 -L del 10% di tintura vol/vol.
8. Incubare le culture a 37 gradi centigradi in piedi per 14 giorni.

3. Collezione di MEV

1. Misurare l'OD₅₄₀ della coltura da 2 mL al momento della raccolta. Effettuare diluizioni seriali 1:10 della coltura e la piastra 100 l di ogni diluizione su piastre di agar con ADN e 0,05% Tween-80.
2. Trasferire la coltura a cinque tubi di centrifuga conica da 225 mL e centrifugare a 2.850 x g per 7 min a 20 gradi centigradi.
3. Raccogliere la coltura supernatant con una pipetta da 50 mL e filtrare sterilizzare attraverso un'unità filtro 0.22 m.

4. Isolamento dei MEV

1. Trasferire la coltura filtrata in un sistema di ultrafiltrazione cellulare agitato posto a 4 gradi centigradi e filtrare il concentrato a <50 psi attraverso una membrana cutoff da 100 kDa a 50 mL.
2. Centrifugare la coltura concentrata filtrare a 15.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi e raccogliere il sovrinnovatore.
3. Centrifugare la coltura filtrare in tubi di ultracentrifugazione policarbonato a 100.000 x g per 2 h a 4 gradi centigradi.
4. Risospendere i pellet membranosi in un totale di 1 mL di fosfato sterile tampinato salina (PBS) con una leggera pipettatura.
5. Mescolare 0,5 mL della sospensione a pellet ottenuta al passo 4.4 con 1,5 mL di soluzione iodixanol 60%, producendo una concentrazione finale di ioxanol del 45% wt/vol.
6. Sovrapporre le sospensioni MEV-iodixanol 45% con 1 mL del 40%, 35%, 30%, 25% e 20% (vol/vol in PBS) soluzioni iodixanolo e 1 mL di PBS in cima.
7. Centrifuga a 100.000 x g per 18 h a 4 gradi centigradi.
8. Raccogliere le frazioni di pendenza di densità di 1 mL a partire dall'alto utilizzando una siringa Hamilton da 1 mL.
9. Diluire ogni frazione raccolta a 20 mL con PBS e centrifuga a 100.000 x g per 2 h a 4 gradi centigradi.
10. Rimuovere il supernatante e sospendere il pellet in 0,5 mL di PBS. Conservare questo pellet a 4 gradi centigradi.

5. Quantificazione dei MEV

1. Misurare la concentrazione proteica in ogni frazione da un saggio di Bradford (Tabella dei materiali), seguendo le linee guida del produttore.
2. Eseguire l'analisi lipidida della membrana.
   1. Incubare 10 l di ogni frazione di pendenza con la sonda a membrana fluorescente 1-(4-Trimethylammoniumphenyyil)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfofonate (TMA-DPH) ad una concentrazione finale di 1 g/mL in un volume finale di 50 gradi di PBS in 96 Piastre.
   2. Incubare le piastre a 33 gradi centigradi per 20 min.
   3. Misurare la fluorescenza a 360 nm eccitazione e 430 nm emissione.

6. Analisi qualitativa dei MEV

1. Eseguire l'elettroforesi proteica.
   1. Mescolare circa 1 g di campioni di MEV in 16 gradi con 4 1l di 5 x di buffer di carico del campione (10% w/v SDS, 10 mM dithiothreitol, 20% v/v glicerol 0,2 M Tris-HCl, pH 6.8 0.05% w/v brofenmol blue) e i campioni di calore in buffer campione a 85 m.
   2. Caricare in un gel 10% Tris/Glycine SDS-polyacrylamide¹¹ e correre a 10 V/cm nel buffer di corsa (25 mM Tris base, 190 mM glicina, 0,1% SDS) fino a quando la parte anteriore colorante blu raggiunge il fondo del gel.
   3. Macchiare il gel con una soluzione di colorazione delle proteine ultrasensibile (Tabella dei materiali).
2. Eseguire la macchia del punto.
   1. Caricare 2 - L di una sospensione MEV con una concentrazione di circa 0,5 g/l, e due diluizioni seriali su una membrana di nitrocellulosa e il processo per una macchia di punti secondo le istruzioni del produttore.
   2. Utilizzare un antisiero sollevato nei topi contro una preparazione di MEV a una diluizione di 1:5.000 come anticorpo primario e una capra anti-torace accoppiato al rafano perossidasi (HRP) ad una diluizione 1:10,000 come anticorpo secondario. Rilevare i complessi antigeni-anticorpi con un reagente di rilevamento del rilevamento del rilevamento del rilevamento del supporto HRP appropriato e un sistema di imaging.
3. Eseguire la colorazione negativa e la microscopia elettronica.
   1. Fissare 250 L di MEV con 2% glutaraldeide in cacodylate 0,1 M a temperatura ambiente per 2 h e incubare durante la notte in 4% formaldeide, 1% glutaraldeide, e 0.1% PBS.
   2. Macchiare i campioni fissi con 2% di tetrossido di osmio per 90 min.
   3. Disidratare serialmente il campione in etanolo e incorporarlo nella resina epossidica di Spurr.
   4. Osservare i MEV al microscopio elettronico a trasmissione.

Risultati

I MEV sono stati purificati dalla sedimentazione differenziale in un gradiente di densità (Figura 1, Figura 2). Nelle condizioni descritte, MEV separati per lo più nella frazione sfumata 3 (F3), che corrisponde al 25% di iodixanol. Questa conclusione si basa sul rilevamento di proteine, lipidi della membrana, visualizzazione microscopica di MEV intatti, distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle e reattività positiva con...

Discussione

Sono stati sviluppati diversi metodi per purificare gli esosomi eucarioti derivati dalle cellule¹². Al contrario, vi sono informazioni limitate sui metodi efficaci per purificare gli EV⁷derivati dai batteri. L'isolamento efficiente dei veicoli elettrici derivati da Mtb deve considerare le difficoltà intrinseche nella coltivazione di questo micatacterio patogeno. Mtb ha un lungo tempo di divisione (24 h) e deve essere gestito in condizioni di biosicurezza di livello tre (BSL...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cella agitata Amicon Modello 108	EMD Milipore	UFSC40001	Sistema di ultrafiltrazione cellulare
BD Polipropilene 225 mL provette coniche	Fisher	05-538-61	Provette da centrifuga coniche
Biomax 100 kDa membrana di ultrafiltrazione cut-off	EMD Milipore	PBHK07610	Membrana di ultrafiltrazione
Resina Chelex-100	Bio-Rad	142-2842	Metallo resina chelante
Middlebrook 7H10 Agar	BD Difco	262710	Piastre di agar micobatteriche
Middlebrook 7H9 Brodo	BD Difco	271310	Brodo micobatterico medio
Membrana assorbente nitrocellulosica	GE Healthcare	10600001	Blotting Membrana
Optiprep	Sigma	D1556	Iodixanolo
Policarbonato ultra centrifugazione provette 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	355618	Provette per ultracentrifugazione in policarbonato 25 mm x 89 mm
Provetta per centrifuga in polipropilene a parete sottile 13 mm x 15 mm	Beckman Coulter	344059	Provetta per centrifuga in polipropilene a parete sottile 13 mm x 15 mm
Colorante per saggi proteici	BioRad	5000006	Bradford Colorazione delle proteine
Sonde molecolari	per rubino SYPRO	S12000	Colorazione proteica ultrasensibile
TMA-DPH	Sonde molecolari	T204	1-(4-Trimetilammoniofenil)-6-Fenil-1,3,5-Esatriene p-Toluensolfonato
Palloni di filtrazione sottovuoto	Unità filtrante	CellPro	V50022