Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

Summary

Questo lavoro descrive un protocollo semi-alto-velocità che consente l'imaging simultaneo 3D time-lapse di embriogenesi in 80-100 C. elegans embrioni in un singolo periodo notturno. Inoltre, sono inclusi strumenti di elaborazione e visualizzazione delle immagini per semplificare l'analisi dei dati. La combinazione di questi metodi con ceppi di reporter personalizzati consente un monitoraggio dettagliato dell'embriogenesi.

Abstract

C. elegans è il sistema principale per l'analisi sistematica delle specifiche del destino cellulare e degli eventi morfogenetici durante lo sviluppo embrionale. Una sfida è che l'embriogenesi si sviluppa dinamicamente in un periodo di circa 13 h; questa scala cronologica di mezza giornata ha limitato la portata degli esperimenti limitando il numero di embrioni che possono essere immagine. Qui, descriviamo un protocollo semi-alto-velocità che consente l'imaging time-lapse 3D simultaneo dello sviluppo in 80-100 embrioni a risoluzione temporale moderata, da un massimo di 14 condizioni diverse, in una singola esecuzione notturna. Il protocollo è semplice e può essere implementato da qualsiasi laboratorio con accesso a un microscopio con capacità di visita del punto. L'utilità di questo protocollo è dimostrata usandola per immaginare due ceppi personalizzati che esprimono marcatori fluorescenti ottimizzati per visualizzare gli aspetti chiave della specifica e della morfogenesi dello strato germinale. Per analizzare i dati, è stato costruito un programma personalizzato che ritaglia singoli embrioni da un campo visivo più ampio in tutti i canali, i passi z e i punti temporali e salva le sequenze per ogni embrione in una pila tiff separata. Il programma, che include un'interfaccia utente grafica (GUI) intuitiva, semplifica l'elaborazione dei dati isolando, pre-elaborazione e orientando uniformemente i singoli embrioni in preparazione per la visualizzazione o l'analisi automatizzata. Viene fornita anche una macro ImageJ che compila i dati dei singoli embrioni in un file multi-pannello che visualizza la proiezione della fluorescenza massima e immagini del campo luminoso per ogni embrione in ogni punto di tempo. I protocolli e gli strumenti descritti nel presente file sono stati convalidati utilizzandoli per caratterizzare lo sviluppo embrionale a seguito di 40 geni dello sviluppo descritti in precedenza; questa analisi ha visualizzato fenotipi dello sviluppo precedentemente annotati e ne ha rivelato di nuovi. In sintesi, questo lavoro descrive in dettaglio un metodo di imaging semi-alto-velocità accoppiato con un programma di ritaglio e uno strumento di visualizzazione ImageJ che, se combinato con ceppi che esprimono marcatori fluorescenti informativi, accelera notevolmente gli esperimenti da analizzare sviluppo embrionale.

Introduction

L'embrione di C. elegans è un importante sistema modello per la biologia delle cellule meccanicistiche e l'analisi delle specifiche del destino cellulare e degli eventi morfogenetici che guidano lo sviluppo embrionale^{1,2,3,4 ,5,6,7,8,9}. Fino ad oggi, gran parte della caratterizzazione sia degli eventi a livello cellulare che delle specifiche del destino cellul....

Protocol

1. Preparazione di C. elegans Embrioni per l'imaging semi-alto a velocità effettiva

NOT: L'obiettivo di questa parte del protocollo è quello di caricare una popolazione di embrioni C. elegans semi-sincronizzati (da 2 a 8 celle), sezionati da ceppi di pennarelli adatti (Figura 2), in una piastra di 384 pozzetti con fondo di vetro per l'imaging. Anche altri formati di lamiere potrebbero funzionare, ma le 384 lastre di pozzo sono preferite perché le piccole dimensioni del pozzo limitano la diffusione degli embrioni in un'area relativamente piccola, il che facilita l'identificazione ....

Results

Una sfida significativa nel caratterizzare l'effetto delle perturbazioni molecolari sullo sviluppo embrionale di C. elegans è che ci vogliono circa 10 h per gli embrioni per progredire dalla prima scissione alla fine dell'allungamento a 20 .¹⁶. Un metodo semi-alto in cui grandi coorti di embrioni possono essere imagete simultaneamente è utile per gli eventi su questa scala temporale perché consente l'imaging di più condizioni in parallelo con una dimensione sufficiente dell'ensemble per o.......

Discussion

Questo lavoro descrive una suite di strumenti e metodi che sono stati sviluppati per consentire sforzi su larga scala per profilare la funzione dei geni nello sviluppo embrionale in C. elegans. Il nostro metodo semi-alto-velocità consente l'imaging 3D time-lapse dello sviluppo embrionale a 20 minuti di risoluzione per 80-100 embrioni in un unico esperimento. Sebbene questo protocollo possa essere adattato per l'uso con qualsiasi ceppo o ceppo di marcatori desiderato, questo lavoro dimostra il potenziale del meto.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gruppo tubo aspiratore	Drummond Scientific	2-000-000
Pipetta calibrata (25 mL)	Drummond Scientific	2-000-025
Cell Voyager Software	Yokogawa Electric Corp	CV1000
(15 mL)	Microscopio USA Scientific	1475-0501
CV1000	Yokogawa Electric Corp	CV1000
Vetrino di depressione (3 pozzetti)	Erie Scientific	1520-006
Microscopio di dissezione	Nikon	SMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ/FIJI	Open Source	https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer	preparato	in laboratorio https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Provetta per microcentrifuga (1,5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM Piastre	preparate	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Bisturi #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 pozzetti, fondo F, Greiner con fondo in vetro	Bio-One	781855
Tetramisole cloridrato	Sigma Aldirch	T1512-10G
Pinzette, Dumont #3	Microscopia elettronica Scienze	0109-3-PO
Obiettivo U-PlanApo (10&volte; 0,4 NA)	Obiettivo Olympus	1-U2B823
U-PlanApo (60&volte; 1,35 NA)	Olympus	1-U2B832