Articolo metodologico
Le colture organoidi derivate dal paziente dell'adenocarcinoma duttale pancreatico sono un modello tridimensionale rapidamente stabilito che rappresenta i compartimenti delle cellule tumorali epiteliali con alta fedeltà, consentendo la ricerca traslazionale in questa malignità letale. Qui, forniamo metodi dettagliati per stabilire e propagare gli organoidi, nonché per eseguire saggi biologici pertinenti utilizzando questi modelli.
L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è tra le neoplasie più letali. Recentemente, sono stati descritti metodi di coltura organoide di nuova generazione che consentono la modellazione tridimensionale (3D) di questa malattia. I modelli organoidi (PDO) derivati dal paziente possono essere isolati sia da campioni chirurgici che da piccole biopsie e si formano rapidamente nella coltura. È importante sottolineare che i modelli organoidi conservano le alterazioni genetiche patogene rilevate nel tumore del paziente e sono predittivi della risposta al trattamento del paziente, consentendo così studi traslazionali. Qui, forniamo protocolli completi per adattare il flusso di lavoro della coltura tissutale per studiare modelli 3D, a matrice incorporata e organoidi. Vengono descritti in dettaglio i metodi e le considerazioni per l'isolamento e la propagazione degli organoid PDAC primari. Inoltre, descriviamo come i supporti organoidi su misura sono preparati e la qualità controllata in laboratorio. Infine, descriviamo i saggi per la caratterizzazione a valle dei modelli organoidi come l'isolamento degli acidi nucleici (DNA e RNA) e il test farmacologico. È importante sottolineare che forniamo considerazioni critiche per l'implementazione della metodologia organoide in un laboratorio di ricerca.
L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è una malattia letale caratterizzata da diagnosi tardiva nella maggior parte dei pazienti, mancanza di terapie efficaci e un basso tasso di sopravvivenza globale a 5 anni che rimane inferiore al 10%1. Solo il 20% dei pazienti viene diagnosticato con una malattia localizzata adatta per l'intervento chirurgico curativo2,3. I restanti pazienti sono tipicamente trattati con una combinazione di agenti chemioterapici che sono efficaci in una minoranza di pazienti4,5. Per rispondere a queste ....
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Tutta la raccolta di tessuti umani per uso di ricerca è stata rivista e approvata dal nostro Internal Review Board (IRB). Tutti i seguenti protocolli vengono eseguiti in condizioni asettiche in un ambiente di laboratorio di coltura dei tessuti mammiferi.
1. Preparazione dei supporti
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Per illustrare le sfide associate all'isolamento degli organoidi dal PDAC, mostriamo la creazione di una coltura organoide derivata dal paziente da un piccolo campione di tumore ipocellulare. Dopo la placcatura iniziale, solo pochi organoidi erano visibili per bene, come mostrato Figura 1. Gli organiidi sono stati autorizzati a crescere più grande nel corso della durata di 2 settimane e sono stati passaggi secondo il nostro protocollo per stabilire una cultura più robusta, come mostrato nel .......
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Qui presentiamo i protocolli attuali per isolare, espandere e caratterizzare gli organoidi PDAC derivati dal paziente. Il nostro attuale tasso di successo nell'stabilire la cultura organoide è superiore al 70%; pertanto, questi metodi non sono ancora stati perfezionati e si prevede che miglioreranno ed evolvono nel tempo. Si dovrebbe considerare importante la dimensione del campione, in quanto il PDAC ha una bassa cellularità neoplastica. Di conseguenza, piccoli esemplari conterranno poche cellule tumorali e genereranno .......
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Siamo grati per il supporto dell'UC San Diego Moores Cancer Center Biorepository and Tissue Technology Shared Resource, membri del laboratorio Lowy, e del Dipartimento di Chirurgia UC San Diego, Divisione di Oncologia Chirurgica. AML è generosamente sostenuta da NIH CA155620, un SU2C CRUK Lustgarten Foundation Pancreatic Cancer Dream Team Award (SU2C-AACR-DT-20-16), e donatori del Fondo per la cura del cancro pancreatico.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pipetta a 12 canali (p20, p100 o p200) con puntali | |||
| piastre a 12 pozzetti | Olympus | 25-106 | |
| Provette coniche LoBind da 15 ml | Eppendorf | EP0030122208 | |
| provetta da 15 ml Rotatore e/o nutatore | |||
| 37 ° C CO2 incubatore | |||
| 37 ° C bagnomaria | |||
| 384 piastre a pozzetti | Corning | 4588 | Attacco ultra basso, nero e otticamente trasparente |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| EGF umano ricombinante senza animali | Peprotech | AF-100-15 | |
| Contatore | |||
| Integratore B27 | ThermoFisher | 17504044 | |
| Soluzione di recupero cellulare | Corning | 354253 | Reagente che depolimerizza l'estratto della membrana basale a 4 gradi C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Reagente per la vitalità delle cellule di luminescenza |
| Cloroformio | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Soluzione di congelamento cellulare |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cellule | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Stampante per farmaci | Tecan | D300e | Questa è la stampante per farmaci che utilizziamo nel nostro laboratorio |
| Excel | per l'analisi dei dati | ||
| Forcipe Graefe extra fine | Strumenti per la scienza fine | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| gastrina I (umana) | TOCRIS | 3006 | |
| Delicata collagenasi/ialuronidasi | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | soluzione di glutammina |
| GraphPad Prisma | Per l'analisi dei dati | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| coltura tissutale a flusso laminare | |||
| Luminometro | |||
| L-Wnt-3A che esprime cellule | ATCC | CRL-2647 | |
| Soluzione di conservazione dei tessuti MACS | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Estratto di membrana basale (BME), fattore di crescita ridotto |
| Mr. Frosty Freezing Contenitore: | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-acetilcisteina | Sigma | A9165 | |
| nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipetta con puntali, | |||
| p200 pipetta con puntali | |||
| PBS, | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillina/Streptomicina | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Unità filtranti a flusso rapido (0,2 & micro; m) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Umano ricombinante FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Noggin murino ricombinante | Peprotech | 250-38 | |
| Bisturi monouso sterili, lama #10 | VWR | 89176-380 | |
| Centrifuga | |||
| tissutali Piatti per colture tissutali 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Soluzione di fenolo acido |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
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