Etichettatura e imaging di placche amiloidi nel tessuto cerebrale utilizzando la curcumina polifenolo naturale

Panchanan Maiti; Alexandra Plemmons; Zackary Bowers; Charles Weaver; Gary Dunbar

doi:10.3791/60377

Articolo metodologico

Etichettatura e imaging di placche amiloidi nel tessuto cerebrale utilizzando la curcumina polifenolo naturale

DOI:

10.3791/60377

⸱

1 novembre 2019

Panchanan Maiti¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Alexandra Plemmons¹ , Zackary Bowers²^,³ , Charles Weaver⁵ , Gary Dunbar¹^,²^,³^,⁴

¹Field Neurosciences Institute, Ascension St. Mary's Hospital, ²Field Neurosciences Institute Laboratory for Restorative Neurology, Central Michigan University, ³Program in Neuroscience, Central Michigan University, ⁴Department of Psychology, Central Michigan University, ⁵Department of Health Sciences, Saginaw Valley State University

In questo articolo

Sommario

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La curcumina è un fluoroforo ideale per l'etichettatura e l'imaging di placche proteiche beta amiloidi nel tessuto cerebrale a causa del suo legame preferenziale alla proteina beta amiloide e delle sue somiglianze strutturali con altri coloranti di legame amiloidi tradizionali. Può essere utilizzato per etichettare e immagini placche proteiche beta amiloidi in modo più efficiente ed economico rispetto ai metodi tradizionali.

Abstract

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La deposizione di proteine beta amiloidi (A) in spazi extra e intracellulari è una delle patologie distintive del morbo di Alzheimer (AD). Pertanto, il rilevamento della presenza di A , nel tessuto cerebrale dell'AD, è uno strumento prezioso per lo sviluppo di nuovi trattamenti per prevenire la progressione dell'AD. Diversi coloranti di legame amiloide classici, fluorocro, sonde di imaging e anticorpi specifici per l'AO sono stati utilizzati per rilevare l'A - istochimicamente nel tessuto cerebrale dell'AD. L'uso di questi composti per il rilevamento di A - è costoso e richiede molto tempo. Tuttavia, a causa della sua intensa attività fluorescente, dell'alta affinità e della specificità per l'Az, così come le somiglianze strutturali con i coloranti leganti amiloidi tradizionali, la curcumina (Cur) è un promettente candidato per l'etichettatura e l'imaging delle placche A tessuto cerebrale. È un polifenolo naturale dell'erba Curcuma longa. Nel presente studio, Cur è stato utilizzato per etichettare istochimicamente placche di Az sia da un modello murino genetico della malattia di Alzheimer familiare 5x (5xFAD) e dal tessuto umano AD entro un minuto. La capacità di etichettatura di Cur è stata confrontata con i tradizionali coloranti di legame amiloide, come thioflavin-S (Thio-S), Congo rosso (CR) e Fluoro-jade C (FJC), così come gli anticorpi specifici di Az (6E10 e A11). Abbiamo osservato che Cur è il modo più economico e più veloce per etichettare e immagini le placche DiZ rispetto a questi coloranti convenzionali ed è paragonabile agli anticorpi specifici di A . Inoltre, Cur si lega con la maggior parte delle specie di A, come oligomeri e fibrille. Pertanto, Cur potrebbe essere utilizzato come l'agente di rilevamento fluorocro più conveniente, semplice e veloce per le placche A .

Introduzione

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Il morbo di Alzheimer (AD) è uno dei disturbi neurologici più comuni, legati all'età e progressivi e una delle principali cause di morte in tutto il mondo¹^,². Apprendimento, memoria, e compromissione della cognizione, insieme a disturbi neuropsichiatrici, sono i sintomi comuni manifestati in AD³. Anche se l'eziologia dell'AD non è stata completamente chiarita, le prove genetiche, biochimiche e sperimentali disponibili indicano che la graduale deposizione di Ao è un biomarcatore definitivo per AD⁴. Questa proteina piegata male si accumula negli spazi intracellular....

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Protocollo

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Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Animal Care and Use Committee (ACUC) della Saginaw Valley State University. Il tessuto umano è stato ottenuto da una banca del cervello stabilito presso lo Banner Sun Health Institute in Arizona¹⁵^,¹⁶.

1. Perfusione degli animali

Preparare i buffer fissativi e perfusione.
1. Preparare il buffer di fosfato di sodio da 0,1 M aggiungendo 80 g di cloruro di sodio (NaCl), 2 g di cloruro di potassio (KCl), 21,7 g di fosfato di idrogeno dissodico (Na₂HPO₄- 7H₂O), 2,59 g di fosfato di diidr....

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Risultati

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La curcumina etichetta le placche di Az entro un minuto. Quando abbiamo macchiato il tessuto 5xFAD con Cur, abbiamo scoperto che le placche Cur az sono all'interno di 1 min. Anche se l'aumento del tempo di incubazione con Cur ha leggermente aumentato l'intensità di fluorescenza delle placche di Ao, il numero di placche di Az osservate non era significativamente diverso tra 1 min e 5 min di colorazione (Figura 1).

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Discussione

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La nostra ipotesi era che Cur potesse essere usato come il modo più veloce, semplice e meno costoso per etichettare e immaginile le placche A e az nel tessuto cerebrale dell'AD postmortem rispetto ad altri coloranti di legame amiloide classici, così come gli anticorpi specifici di Az. Gli obiettivi di questo studio erano determinare il tempo minimo necessario per etichettare e immagini le placche di Az da Cur nel tessuto cerebrale post mortem AD e determinare se Cur può essere utilizzato come alternativa agli anticorpi d.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Il sostegno a questo studio è venuto dal Field Neurosciences Institute di Ascension of St. Mary's.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo
4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)	IHC mondo, Woodstock, MD
Un modello animale del laboratorio di Alzheimer	Jackson, Bar Harbor, ME
Alcool assoluto	VWR, Radnor, PA
Alexa 594	Santacruz Biotech, Dallas, TX
Anticorpo 6E10	Biolegend, San Diego, CA
Anticorpo A11	Millipore, Burlington, MA
Microscopio ottico composto	Olympus, Shinjuku, Giappone	Olympus BX51
Congo rosso	Sigma, St. Louis, MO
Cryostat	GMI, Ramsey, MN	LeicaCM1800
Curcumina	Sigma, St. Louis, MO
Idrogeno disodico fosfato	Sigma, St. Louis, MO
Plastificante disstirene xilene	BDH, Dawsonville, GA
Carte filtranti	Fisher scientific, Pittsburgh, PA
Hoechst-33342	Sigma, St. Louis, MO
Microscopio fluorescente invertito	Leica, Buffalo Grove, IL	Leica DMI 6000B
Fluorescente invertito microscopio	Olympus, Shinjuku, Giappone	Olympus 1x70
Siero di capra normale	Sigma, St. Louis, MO
Paraffina	Sigma, St. Louis, MO
Paraformaldeide	Sigma, St. Louis, MO
Ploy-lisina rivestita vetrino caricato Globe	Scientific Inc, Mahwah, NJ
Cloruro	di potassioSigma, St. Louis, MO
Diidrogeno fosfato di potassio	Sigma, St. Louis, MO
Sodio azide	Sigma, St. Louis, MO
Cloruro di sodio	Sigma, St. Louis, MO
Idrossido di sodio	EMD Millipore, Burlington, MA
Sodio pentobarbital	Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI
Tioflavina-S	Sigma, St. Louis, MO
Triton-X-100	Sigma, St. Louis, MO
Xilene	VWR, Radnor, PA

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cummings, J. L. Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 351 (1), 56-67 (2004).
Jack, C. R., Holtzman, D. M. Biomarker modeling of Alzheimer's disease. Neuron. 80 (6), 1347-1358 (2013).
Tarawneh, R., Holtzman, D. M.

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Marcatura con curcumina microscopia a fluorescenza marcatura istochimica protocollo di perfusione sezionamento al criostato sezionamento in paraffina concentrazione di curcumina malattia di Alzheimer

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