Questo protocollo descrive come misurare la permeabilità intestinale di Caenorhabditis elegans. Questo metodo è utile per la ricerca biologica di base sulla salute intestinale relativa all'interazione tra i batteri intestinali e il loro ospite e per lo screening per identificare gli agenti probiotici e chimici per curare la sindrome dell'intestino che perde e le malattie infiammatorie intestinali.
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Articolo metodologico
Misurazione degli effetti di batteri e sostanze chimiche sulla permeabilità intestinale della caenorhabditis elegans
In questo articolo
Sommario
Abstract
Negli organismi viventi, l'iperpermescopibilità intestinale è un sintomo grave che porta a molte malattie infiammatorie intestinali (IBD). Caenorhabditis elegans è un modello animale non mammaliano che è ampiamente utilizzato come sistema di analisi a causa della sua breve durata di vita, trasparenza, convenienza e mancanza di questioni etiche degli animali. In questo studio, è stato sviluppato un metodo per studiare gli effetti di diversi batteri e 3,3'-diindolylmethane (DIM) sulla permeabilità intestinale di C. elegans con un sistema di analisi delle immagini ad alto contenuto di velocità. I vermi sono stati infettati da diversi batteri intestinali o cotrattati con DIM per 48 h e alimentati con fluoresceinisocianate (FITC)-dextran durante la notte. Quindi, la permeabilità intestinale è stata esaminata confrontando le immagini di fluorescenza e l'intensità della fluorescenza all'interno dei corpi del verme. Questo metodo può anche avere il potenziale per identificare i batteri intestinali probiotici e patogeni che influenzano la permeabilità intestinale nel modello animale ed è efficace per esaminare gli effetti di sostanze chimiche dannose o che promuovono la salute sulla permeabilità intestinale e salute intestinale. Tuttavia, questo protocollo ha anche alcune notevoli limitazioni a livello genetico, soprattutto per determinare quali geni vengono modificati per controllare la malattia, perché questo metodo è utilizzato principalmente per la determinazione fenotipica. Inoltre, questo metodo si limita a determinare esattamente quali substrati patogeni causano infiammazione o aumentano la permeabilità dell'intestino dei vermi durante l'infezione. Pertanto, ulteriori studi approfonditi, tra cui lo studio del meccanismo genetico molecolare utilizzando batteri mutanti e nematodi, nonché l'analisi dei componenti chimici dei batteri, sono necessari per valutare completamente la funzione dei batteri e sostanze chimiche nel determinare la permeabilità intestinale.
Introduzione
La permeabilità intestinale è considerata come una delle principali barriere legate al microbiota intestinale e all'immunità mucosale ed è probabile che sia influenzata da diversi fattori, come le modifiche del microbiota intestinale, la compromissione epiteliale o le alterazioni dello strato di muco1. Recenti documenti hanno riportato protocolli efficaci per misurare la permeabilità intestinale delle cellule intestinali umane coltivate analizzando i tassi di flusso di fluorescenza attraverso lo strato di cellule intestinali2, ma meno documenti di ricerca presentano una procedura adatta per misurare la permeabilità intes....
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Protocollo
1. Preparazione di P. aeruginosa PAO1 e Escherichia coli OP50 Cultura
- Preparare 500 mL di Luria-Bertani (LB) medio sterilizzato (Tabella 1) e inoculare una singola colonia di P. aeruginosa nel mezzo. Incubare la coltura per 14 a 15 h a 37 gradi centigradi con una velocità di agitazione di 150 giri/min.
- Distribuisci equamente la coltura batterica in due tubi centrifugati da 500 mL e centrifiche i tubi a 3.220 x g a 4 gradi centigradi per 30 min.
- Rimuovere il supernatante fino a quando il volume è di 50 mL (un decimo del volume iniziale) e risospendere il pellet batterico.
- Conse....
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Risultati
Dopo l'incubazione con P. aeruginosa PAO1, C. elegans ha mostrato un aumento significativo della fluorescenza FITC-dextran nel corpo del verme rispetto alla fluorescenza mostrata dopo l'incubazione con gli altri due ceppi batterici (Figura 1). Le intensità di fluorescenza dei vermi alimentati con E. coli OP50, P. aeruginosa PAO1 e E. faecalis KCTC3206 erano rispettivamente 100.0 6.6, 369,7 x 38,9, e 105,6 - 10,6%. I dati sottolineano che P. ae.......
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Discussione
Utilizzando questo nuovo metodo per determinare la permeabilità intestinale in C. elegans, che combina la microscopia a fluorescenza automatizzata e l'analisi quantitativa delle immagini, le differenze causate da microrganismi intestinali o sostanze chimiche possono essere determinate in vivo, in particolare nell'intestino di C. elegans. Questo protocollo è utile per le indagini sulla permeabilità intestinale e applicabile a molti compiti, come la determinazione reattiva delle specie di ossigeno (ROS) i.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione di ricerca intramurale dell'Istituto coreano di scienza e tecnologia (2E29563).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 3,3'-diindolilmetano | Sigma | D9568 | |
| 90&volte; Piastre di Petri da 15 mm | SPL Life Sciences, Corea del Sud | 10090 | |
| 60&volte; Piastre di Petri da 15 mm | SPL Life Sciences, Corea del Sud | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Soluzione di formaldeide | Sigma | F1635 | |
| Infusione di cuore cerebrale (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Tipo selvatico | |
| Piastra per il saggio Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa, 96 pozzetti nera con fondo piatto trasparente Non trattata, senza coperchio Polistirene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimetil solfossido | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Collezione coreana per la coltura di tipo | KCTC NO. 3206 | anaerobico falcuta |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Isotiocianato di fluoresceina - destrano | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medio | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Solfato di magnesio eptaidrato | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Terreno di montaggio acquoso Fluoromount | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS Sistema di analisi ad alto contenuto | PerkinElmer | ||
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Collezione coreana per la coltura di tipo | KCTC NO. 1637 | |
| Cloruro di sodio Fisher | Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereomicroscopio | Nikon, Giappone | SMZ800N | |
| Estratto di lievito | Becton Dickinson | REF. 212750 |
Riferimenti
- Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189(2014).
- Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J.
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Ristampe e permessi
