Articolo metodologico

Analisi del Gruppo IV Viral SSHHPS utilizzando i metodi In Vitro e In Silico

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DOI:

10.3791/60421

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21 dicembre 2019

 ,  , 
1National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, 2United States Naval Research Laboratory

In questo articolo

Sommario

Vi presentiamo un protocollo generale per l'identificazione di brevi distese di sequenze proteiche omologhe ospiti-patogenenze (SSHHPS) incorporate nella poliproteina virale. Gli SSHHPS sono riconosciuti dalle proteasi virali e dirigono la distruzione mirata di specifiche proteine ospiti da parte di diversi virus del Gruppo IV.

Abstract

Gli enzimi alfavirali sono sintetizzati in un singolo polipeptide. La poliproteina non strutturale (NSP) viene elaborata con la proteasi cisteina di nsP2 per produrre enzimi attivi essenziali per la replicazione virale. Le proteasi virali sono molto specifiche e riconoscono le sequenze di motivi di scissione conservate (6-8 aminoacidi). In diversi virus di Gruppo IV, le sequenze di motivi di scissione della proteasi nsP possono essere trovate in specifiche proteine ospiti coinvolte nella generazione delle risposte immunitarie innate e, in alcuni casi, le proteine mirate sembrano essere collegate al fenotipo indotto dal virus. Questi virus utilizzano brevi distese di sequenze omologhe di proteine omologhe ospiti-patogeni (SSHHPS) per la distruzione mirata delle proteine ospiti. Per identificare Gli SSHHPS, le sequenze di motivi del sito della proteasi virale possono essere inserite in BLAST e i genomi ospiti possono essere cercati. Cleavage inizialmente può essere testato utilizzando la proteasi virale nsP purificata e il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) substrati realizzati in E. coli. I substrati FRET contengono proteine fluorescenti ciano e gialle e la sequenza del sito di scissione (CFP-sequence-YFP). Questo saggio proteasi può essere utilizzato continuamente in un lettore di lastre o discontinuo in gel SDS-PAGE. I modelli dei substrati peptidi legati possono essere generati in silico per guidare la selezione del substrato e gli studi di mutagenesi. Anche i substrati CFP/YFP sono stati utilizzati per identificare gli inibitori della proteasi. Questi metodi in vitro e in silico possono essere utilizzati in combinazione con saggi basati sulle cellule per determinare se la proteina ospite mirata influisce sulla replicazione virale.

Introduzione

Le prove di trasferimento genico orizzontale dal virus all'ospite, o host a virus, possono essere trovate in una varietà di genomi1,2,3,4. Esempi di endogenizzazione virale sono le sequenze distanziali CRISPR trovate nei genomi batterici ospiti4. Recentemente, abbiamo trovato prove di sequenze proteiche ospiti incorporate nelle poliproteine non strutturali dei virus del Gruppo IV di ssRNA. Queste sequenze all'interno delle regioni di codifica del genoma virale possono essere propagate generazionalmente. I brevi tratti di sequenze proteiche omologhe ospiti-patogeni (SSHHPS) si trovano nel virus e nell'host5,6. SSHHPS sono le sequenze di motivo sito di scissione conservate riconosciute dalle proteasi virali che hanno l'omologia di specifiche proteine ospiti. Queste sequenze dirigono la distruzione di specifiche proteine ospiti.

Nella nostra precedente pubblicazione6,abbiamo compilato un elenco di tutte le proteine ospiti che sono state prese di mira da proteasi virali e abbiamo scoperto che l'elenco degli obiettivi non era casuale (Tabella 1). Due tendenze erano evidenti. In primo luogo, la maggior parte delle proteasi virali che tagliavano le proteine ospiti apparteneva ai virus del Gruppo IV (24 dei 25 casi coinvolti proteasi virali di gruppo IV), e una proteasi apparteneva ai retrovirus del gruppo VI (HIV, virus dell'immunodeficienza umana)7. In secondo luogo, gli obiettivi proteici ospiti tagliati dalle proteasi virali sono stati generalmente coinvolti nella generazione di risposte immunitarie innate suggerendo che le scissioni erano destinate ad antagonizzare le risposte immunitarie dell'ospite. La metà delle proteine ospiti prese di mira dalle proteasi virali erano componenti noti di cascate di segnalazione che generano interferone (IFN) e citochine infiammatorie (Tabella 1). Altri sono stati coinvolti nella trascrizione delle cellule ospiti8,9,10 o traduzione11. È interessante notare che Shmakov et al.4 hanno dimostrato che molte sequenze di protostring rCRISP corrispondono ai geni coinvolti nella coniugazione o replicazione plasmida4.

Il Gruppo IV comprende, tra gli altri, Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae e Togaviridae. Diversi patogeni nuovi ed emergenti appartengono al Gruppo IV, come il virus del virus zika , il Nilo occidentale (WNV), il Chikungunya (CHIKV), il virus della sindrome respiratoria acuta grave (SARS) e il virus della sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS). Il genoma dello ssRNA è essenzialmente un pezzo di mRNA. Per produrre gli enzimi necessari per la replicazione del genoma, il genoma dello ssRNA deve prima essere tradotto. Negli alfavirus e in altri virus di Gruppo IV, gli enzimi necessari per la replicazione sono prodotti in un unico polibio (ad esempio, nsP1234 per VEEV). La poliproteina non strutturale (nsP) viene elaborata proteolicamente (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) dalla proteasi nsP2 per produrre enzimi attivi12 (Figura 1). La cleavage della poliproteina da parte della proteasi nsP2 è essenziale per la replicazione virale; questo è stato dimostrato dalla cancellazione e dalla mutagenesi diretta al sito del sito attivo cisteina della proteasi nsP213,14. In particolare, la traduzione delle proteine virali precede gli eventi di replicazione del genoma. Ad esempio, nsP4 contiene la polimerasi dell'RNA dipendente dall'RNA necessaria per replicare il genoma dello ssRNA. La replicazione del genoma può produrre intermedi dsRNA; questi intermedi possono innescare le risposte immunitarie innate dell'ospite. Così, questi virus possono fendere ospite proteine di risposta immunitaria innata precoce in infezione al fine di sopprimere i loro effetti15,16,17.

Il silenziamento può verificarsi a livello di DNA, RNA e proteine. Ciò che è comune a ciascuno dei meccanismi di silenziamento illustrati nella Figura 1 è che brevi sequenze di DNA, RNA o proteine estranee vengono utilizzate per guidare la distruzione di obiettivi specifici per antagonizzare la loro funzione. I meccanismi di silenziamento sono analoghi ai programmi di "ricerca ed eliminazione" scritti in tre lingue diverse. La sequenza del sito di scissione breve è analoga a una "parola chiave". Ogni programma ha un enzima che riconosce la corrispondenza tra la sequenza breve (la "parola chiave") e una parola nel "file" che deve essere eliminato. Una volta trovata una corrispondenza, l'enzima taglia ("elimina") la sequenza bersaglio più grande. I tre meccanismi illustrati nella Figura 1 vengono utilizzati per difendere l'ospite dai virus o per difendere un virus dal sistema immunitario di un ospite.

Le proteasi virali riconoscono brevi sequenze di motivi del sito di scissione tra gli amminoacidi da 2 a 11 dollari; nei nucleotidi, questo corrisponderebbe a 6-33 basi. Per fare un confronto, le sequenze distanziali CRISPR sono i nucleotidi da 26 a 72 dollari e gli RNAi sono due-22 nucleotidi18,19. Sebbene queste sequenze siano relativamente brevi, possono essere riconosciute in modo specifico. Data la maggiore diversità di aminoacidi, la probabilità di un evento di scissione casuale è relativamente bassa per una proteasi virale che riconosce sequenze proteiche di 6-8 aminoacidi o più a lungo. La previsione di SSHHPS nelle proteine ospiti dipenderà in gran parte dalla specificità della proteasi virale esaminata. Se la proteasi ha requisiti di specificità di sequenza rigorosi, la possibilità di trovare una sequenza di sito di scissione è 1/206 - 1 in 64 milioni o 1/208 - 1 in 25,6 miliardi; tuttavia, la maggior parte delle proteasi hanno tolleranze di siti secondari variabili (ad esempio, R o K possono essere tollerate sul sito S1). Di conseguenza, non vi è alcun requisito per l'identità della sequenza tra le sequenze trovate nell'host rispetto al virus. Per le proteasi virali che hanno requisiti di sequenza più sciolti (come quelli appartenenti a Picornaviridae) la probabilità di trovare un sito di scissione in una proteina ospite può essere maggiore. Molte delle voci della Tabella 1 provengono dalla famiglia Picornaviridae.

La notazione Schechter & Berger20 è comunemente usata per descrivere i residui in un substrato proteasi e i siti secondari a cui si legano, utilizziamo questa notazione in tutto. I residui nel substrato che sono N-terminale del legame di scissile sono indicati come P3-P2-P1, mentre quelli che sono C-terminalsono sono indicati come P1'-P2'-P3'. I corrispondenti sottositi della proteasi che legano questi residui di amminoacidi sono rispettivamente S3-S2-S1 e S1'-S2'-S3'.

Per determinare quali proteine ospiti sono presi di mira, possiamo identificare SSHHPS nei siti di scissione della poliproteina virale e cercare le proteine ospiti che le contengono. Qui, illustreremo le procedure per identificare SSHHPS utilizzando sequenze note di scissione proteasi virale. I metodi bioinformatici, i saggi proteasi e nei metodi in silico descritti sono destinati ad essere utilizzati in combinazione con saggi basati sulle cellule.

Gli allineamenti delle sequenze delle proteine ospiti bersaglio delle proteasi virali hanno rivelato differenze specifiche delle specie all'interno di queste brevi sequenze di scissione. Ad esempio, la proteasi del virus dell'encefalite equina venezuelana (VEEV) nsP2 è stata trovata per tagliare l'TRIM14 umano, una proteina tripartita (TRIM)6. Alcune proteine TRIM sono fattori di restrizione virale (ad esempio, TRIM5- 21), la maggior parte sono pensati per essere ligas ubiquitina E3. TRIM14 manca di un dominio RING (davvero interessante nuovo gene) e non è pensato per essere un E3 ligase22. TRIM14 è stato proposto come un adattatore nel signaloso antivirale mitocondriale (MAVS)22, ma può avere altre funzioni antivirali23. L'allineamento delle sequenze di TRIM14 da varie specie mostra che gli equini non hanno il sito di scissione e ospitano una versione troncata di TRIM14 che manca del dominio PRY/SPRY del terminale C. Questo dominio contiene un sito di poliubiquitination (Figura 2). Nell'equino, questi virus sono altamente letali (mortalità del 20-80%), mentre nell'uomo umano solo l'1% muore a seguito di infezioni da VEEV24. La cleavage del dominio PRY/SPRY può cortocircuito transitoriamente cortocircuito della cascata di segnalazione MAVS. Questa cascata può essere innescata da dsRNA e porta alla produzione di interferone e citochine pro-infiammatorie. Pertanto, la presenza del SSHHPS può essere utile per prevedere quali specie hanno sistemi di difesa contro specifici virus di Gruppo IV.

Nei virus di Gruppo IV, i meccanismi di antagonismo IFN sono ritenuti moltiplicare ridondanti25. La scissione delle proteine ospiti può essere transitoria durante l'infezione e le concentrazioni possono recuperare nel tempo. Abbiamo scoperto nelle cellule che i prodotti di scissione TRIM14 potrebbero essere rilevati molto presto dopo la trasfezione (6 h) con un plasmide che codifica la proteasi (promotore di citomegalovirus). Tuttavia, a periodi più lunghi, i prodotti di scissione non sono stati rilevati. Nelle cellule infettate da virus, la cinetica era diversa e i prodotti di scissione potevano essere rilevati tra 6-48 h6. Altri hanno segnalato la comparsa di prodotti di scissione proteica ospite già 3-6 h dopo l'infezione9,11.

L'attività proteolitica nelle cellule è spesso difficile da catturare; i prodotti di scissione possono variare nella loro solubilità, concentrazione, stabilità e durata. Nei saggi basati sulle cellule, non si può presumere che i prodotti di scissione si accumulino in una cellula o che le intensità della banda delle proteine tagliate e non tagliate mostrino aumenti e diminuzioni compensative in quanto la proteina tagliata può essere degradata molto rapidamente e potrebbe non essere rilevabile in una macchia occidentale a un peso molecolare previsto (MW) (ad esempio, la regione contenente l'epipopo potrebbe essere screpolata da altri protiasi ospiti o potrebbe essere ubichezzata). Se il substrato della proteasi virale è una proteina di risposta immunitaria innata, la sua concentrazione può variare durante l'infezione. Ad esempio, alcune proteine di risposta immunitaria innata sono presenti prima dell'infezione virale e sono indotte ulteriormente dall'interferone26. La concentrazione della proteina bersaglio può quindi variare durante l'infezione e il confronto tra listi cellulari non infetti e listi cellulari infetti può essere difficile da interpretare. Inoltre, tutte le cellule potrebbero non essere trascate o infettate in modo uniforme. I saggi proteasi in vitro che utilizzano proteine purificate di E. coli, d'altra parte, hanno meno variabili per cui controllare e tali saggi possono essere fatti utilizzando SDS-PAGE piuttosto che immunoblot. Le proteasi contaminanti possono essere inibite nei primi passaggi della purificazione delle proteine del substrato CFP/YFP e le proteasi virali mutate possono essere purificate e testate come controlli per determinare se la scissione è dovuta alla proteasi virale o a una proteasi batterica contaminante.

Una limitazione dei saggi proteasi in vitro è che mancano della complessità di una cellula dei mammiferi. Affinché un enzima tagli il suo substrato, i due devono essere co-localizzati. Le proteasi virali del Gruppo IV differiscono nella struttura e nella localizzazione. Ad esempio, la proteasi di Simlasmi è incorporata nella membrana del reticolo endoplasmico (ER) e si affaccia sul citosol, mentre la proteasi VEEV nsP2 è una proteina solubile nel citoplasma e nel nucleo27. Alcune delle sequenze del sito di scissione trovate nell'analisi SSHHPS di IKV erano in peptidi di segnalazione suggerendo che la scissione potrebbe avvenire co-traduzione per alcuni obiettivi. Pertanto, anche la posizione della proteasi e del substrato nella cellula deve essere considerata in queste analisi.

I saggi basati sulle cellule possono essere utili per stabilire un ruolo per le proteine ospiti identificate nell'infezione. I metodi che mirano a fermare la scissione proteasi virale delle proteine ospiti come l'aggiunta di un inibitore della proteasi6 o una mutazione nel bersaglio ospite16 possono essere utilizzati per esaminarne gli effetti sulla replicazione virale. La sovraespressione della proteina mirata può anche influenzare la replicazione virale28. I saggi di placca o altri metodi possono essere utilizzati per quantificare la replicazione virale.

Protocollo

1. Bioinformatica: Identificazione di SSHHPS nel genoma host utilizzando BLAST

NOT: Le proteine BLAST possono essere trovate a blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

  1. Ingresso di 20 aminoacidi da 20 dollari che circondano il legame scissile nella poliproteina virale. Selezionare sequenze proteiche non ridondanti e digitare il genoma ospite in cui eseguire la ricerca (ad esempio, Homo sapiens).
    1. Se necessario, selezionare PHI-BLAST. Digitare una sequenza di ripetizione (ad esempio, per i 25 residui di V12 mostrati di seguito immettere il modello "AG" senza virgolette).

      figure-protocol-1

      NOT: In PHI-BLAST, le parentesi quadre [XY] indicano che l'amminoacido X o Y può trovarsi nella posizione del sito secondario (ad esempio, AG[AC][GAY]).
    2. Esaminare i risultati del BLAST e identificare i colpi con identità ad alta sequenza dei residui conservati nei siti di scissione poliproteica (ad esempio, proteina motivo tripartito 14) (Figura 3).
      NOT: Per le proteasi serine è prevista una maggiore conservazione del residuo di P1, mentre per le proteasi di cisteina è prevista una maggiore conservazione del residuo di P2.
    3. Colorare i residui identici a una sequenza di siti di scissione e sono in ordine sequenziale (senza spazi). Colorare i residui tollerati nel sottosito, ma presenti in un sito di scissione diverso in un secondo colore.
      NOT: Possono essere trovati anche residui che rappresentano sostituzioni conservative (ad esempio, Leu contro Val) che non sono presenti in un sito di scissione virale e possono o non possono essere riconosciuti dalla proteasi virale.
    4. Ordine di classificazione del BLAST colpisce in base al numero di residui identici o tollerati consecutivi che corrispondono a una sequenza di siti di scissione. Dall'elenco, selezionare le proteine contenenti residui identici o simili per l'analisi nei saggi proteasi.
    5. Ripetere la procedura per gli altri siti di scissione (nsP2/3, nsP3/4, ecc.) e rafforzare gradualmente la previsione aggiungendo residui più altamente conservati al modello PHI-BLAST.

2. Saggi in vitro: Progettare e preparare i substrati Protease

  1. Costruire un plasmide che codifica la proteina cianofluorescente (CFP), 25 aminoacidi della sequenza del sito di scissione, seguita dalla proteina fluorescente gialla (YFP, conosciuta anche come Venere29).
    NOT: Il plasmie può essere costruito utilizzando la clonazione indipendente di sequenza e legatura (SLIC)30 o la sintesi genica commerciale. Un plasmide pet15b contenente la sequenza illustrata nella Figura 4 è stato sintetizzato commercialmente ed è stato utilizzato qui.
    1. Per ottimizzare la lunghezza del substrato, costruire substrati FRET di lunghezza variabile aggiuntivi contenenti 12-25 aminoacidi delle sequenze del sito di scissione poliproteica virale naturale utilizzando una reazione SLIC a 2 frammenti. Analizzare la scissione utilizzando l'analisi a base di gel SDS-PAGE o misurando i parametri cinetici a stato costante utilizzando i metodi riportati di seguito.
      NOT: In alcuni casi, i siti di scissione possono essere identificati per omologia a siti di scissione noti31. Se non si osserva la scissione dei substrati contenenti le sequenze di giunzione poliproteica, può essere necessario residui aggiuntivi o un motivo strutturale (ad esempio, un'elica alfa32). In alternativa, la proteasi virale purificata può essere inattiva. Confermare la scissione delle sequenze di poliproteine virali prima di eseguire l'analisi SSHHPS. Il numero di residui nel substrato è stato ottimizzato per la proteasi VEEV utilizzando substrati di lunghezza variabile (da 12 a 25 aminoacidi) seguita dall'analisi di Vmax e Km32,33. I siti di scissione proteasi del virus zika ns2B/nsB utilizzati negli esempi sono stati pubblicati34,35.
  2. Preparare i substrati CFP/YFP trasformando appena 8-20 gradi centigradi (DE3)E. colicelle competenti con il plasmid CFP-V12-YFP secondo le indicazioni del produttore e la piastra su piastre di agar Luria Bertani (LB) contenenti 50 Ampicillina g/mL (37 gradi centigradi).
    1. Autoclave quattro flaconi da 4 L contenenti supporti LB (1,5 L per fiaschetta) e 100 mL di LB in un flacone da 250 mL. Far capolpare ogni flacone con un foglio di alluminio.
    2. Inoculare la coltura di 100 mL con una colonia di batteri appena trasformati e crescere a 37 gradi centigradi con agitazione (200 giri/m) durante la notte.
    3. Per fare il substrato CFP/YFP, inoculare quattro flaconi 4 L con 25 mL di una cultura notturna. Iniziate a scuotere le colture a 37 gradi centigradi e monitorate la crescita mediante spettroscopia UV-vis a 600 nm all'ora.
    4. Quando i batteri raggiungono un assorbimento di 1,0 usd a 600 nm (circa 3-4 h di crescita) inducono l'espressione della proteina aggiungendo 0,5 mL di 1 M isopropile--d-thiogalactoside (IPTG) per fiaschetta. Dopo l'aggiunta dell'IPTG, abbassare la temperatura dell'incubatrice di agitazione a 17 gradi centigradi e lasciare che l'espressione continui la notte per 17-20 h.
    5. Pellet i batteri utilizzando una centrifuga ad alta velocità a 7.000 x g per 10 min (4 gradi centigradi) e trattenere i pellet. Rimuovere e scartare i supporti liquidi. Conservare immediatamente i pellet a -80 gradi centigradi o lise.
    6. Preparare 100 mL di buffer di lisi contenente 50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 35 mL di reagente di estrazione di proteine batteriche, 30 mg di lismi, 25 U di DNase e 1 compressa inibitore proteasi. Risospendere i pellet nel tampone di lisi con una pipetta e trasferire 25-35 mL in tubi conici usa e getta da 50 mL.
    7. Mettere i tubi in un bicchiere di plastica contenente acqua ghiacciata. Inserire la punta del sonicatore nei tubi in modo che la punta sia di 1 cm dal fondo del tubo e sonicare i lisati 10-20 volte al livello 5 per intervalli di 15 s fino a quando il lisa torto diventa fluido e liquefatto.
      NOT: Utilizzare la protezione dell'udito durante la sonicazione.
    8. Trasferire il lisato ai tubi centrifugaad alta velocità e centrifugare a 20.500 x g per 30 min a 4 gradi centigradi. Dopo lo spin, trattenere il supernatante (100 mL) e trasferirlo in una bottiglia pulita. Scartare i pellet.
    9. Preparare 1 L del buffer A (50 mM Tris pH 7.6, 500 mM NaCl). Preparare 300 mL di buffer B (50 mM Tris pH 7.6, 500 mMM NaCl, 300 mMIdazole).
    10. Eri una colonna di nickel di 100 mL utilizzando 3 volumi di colonna del Buffer A e una portata di 5 mL/min.
    11. Caricare il lisato sulla colonna nichel utilizzando una velocità di flusso da 2 a 5 mL/min. Lavare la colonna con 2 volumi di colonna del buffer A, seguita da volumi di colonna da 5 USD del 20% buffer B. Durante il lavaggio buffer B del 20%, l'assorbimento a 280 nm (A280) aumenterà man mano che i contaminanti si intensificano dalla colonna durante il lavaggio. Continuare a lavare la colonna fino a quando l'A280 del eluato è tornato ai valori della linea di base.
    12. Elutare la proteina con volumi di 2-3 colonne di 100% Buffer B utilizzando una portata di 2-5 mL/min e raccogliere frazioni da 10 mL. Misurare l'A280 di ogni frazione.
    13. Combinare e concentrare le frazioni contenenti A280 > 0.1 utilizzando un'unità di ultrafiltrazione centrifuga da 15 mL. Girare le unità di ultrafiltrazione a 5.000 x g per 15 min e continuare ad aggiungere frazioni fino a quando il volume è stato ridotto a 50-75 mL.
    14. Tagliare un pezzo di 14 pollici di tubi di dialisi con un peso molecolare cut-off (MWCO) di 6-8 kDa. Idratare il tubo di dialisi facendobolizzandolo completamente sommerso in 300 mL di acqua per 10 min. Legare un nodo sicuro ad un'estremità della membrana. Riempire il sacchetto con tampone di dialisi per assicurarsi che non siano presenti crepe o perdite. Rimuovere il buffer dal sacchetto e tenere la borsa immersa nel tampone di dialisi.
    15. Trasferire la proteina concentrata da 2.2.13 nel sacchetto di dialisi con una pipetta di plastica. Rimuovere eventuali bolle d'aria dal sacchetto. Chiudere la borsa con un secondo nodo o una clip di dialisi. Dialisci la proteina contro 500 mL di 50 mM Tris pH 7,6, 5 mM EDTA (acido etilenediamineatraacetic), 250 mM NaCl in un cilindro graduato 500 mL durante la notte a 4 gradi centigradi.
    16. Dialisci la proteina una seconda volta contro 500 mL di 50 mM Tris pH 7,6 a 4 gradi centigradi per 2 h.
  3. Per la colonna di scambio anion preparare 500 mL di buffer A (50 mM Tris pH 7.6) e 500 mL Buffer B (50 mM Tris pH 7.6, 1.0 M NaCl). Eri una colonna di scambio Di 30 mL e 3 colonne di Buffer A (2-5 mL/min).
    1. Rimuovere la proteina dal sacchetto di dialisi e trasferirla in una bottiglia. Tieni la bottiglia sul ghiaccio. Caricare la proteina dialisata sulla colonna (2-5 mL/min).
      NOT: La proteina CFP/YFP legherà la colonna e sarà gialla nell'aspetto.
    2. Lavare la colonna con buffer A fino a quando ilA 280 torna alla linea di base (5 mL/min). Eluire la proteina con un gradiente (0-50% Buffer B, 100 mL) e raccogliere 10 mL di frazioni.
    3. Esaminare le frazioni di colonna utilizzando SDS-PAGE. Combinare quelli che sono >95% puro.
    4. Concentrare la proteina su un A280 -10-20 utilizzando un'unità di ultrafiltrazione centrifuga da 15 mL. Girare il concentratore a 4.500 x g per 10 minuti a 4 gradi centigradi e continuare ad aggiungere proteine fino a quando tutte le frazioni contenenti proteine sono state combinate.
  4. Rimuovere con attenzione la proteina dal concentratore con una pipetta. Aliquota in tubi di microcentrifuga da 1,5 ml e congelo lampo in azoto liquido per una conservazione a lungo termine a -80 gradi centigradi. Tampone scambiare la proteina a temperatura ambiente utilizzando una colonna PD-10 equilibrata con il buffer di analisi appropriato prima dell'uso.
  5. Utilizzando la legge della birra si calcola la concentrazione di proteine utilizzando l'A280 e un coefficiente di estinzione calcolato(ad esempio, per il substrato V12 il .
    NOT: Il coefficiente di estinzione (z) può essere calcolato dalla sequenza proteica nella Figura 4 utilizzando il programma Expasy ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/).

3. Preparazione della Proteasi Alphaviral nsP2 Cysteine

  1. Progettare e costruire un plasmid che codifica la proteasi. Per le proteasi di cisteina, utilizzare il plasmide pet32 per costruire una proteina di fusione di tioredossina (Trx).
    Nota:Il plasmidpet pet32 codifica un sito di cleavage di trombina (LVPRGS) per la rimozione della tioredossina e del tag His (Figura 5). Thioredoxin aiuterà a mantenere il cisteino del sito attivo in uno stato ridotto durante l'espressione. Per le proteasi serine, la thioredoxin non è necessaria e le fasi che comportano la sua rimozione per trombina possono essere omesse. La sequenza di proteasi VEEV nsP2 è stata incorporata in un plasmide pet32b preparato commercialmente per evitare di maneggiare agenti Select.
    1. Trasformare di recente il DNA plasmide in BL21(DE3)pLysS E. coli secondo le indicazioni del produttore. Piastrare i batteri su piastre di agar LB contenenti Ampicillina.
      NOT: Il cloramfenicolo viene utilizzato solo per i ceppi di E. coli che trasportano il plasmide plysS e viene omesso se vengono utilizzate cellule BL21(DE3). Non è necessario includere il cloramhenico sulla piastra di agar LB in questo passaggio.
    2. Autoclave quattro flaconi 4 L di 1,5 L di supporti LB (6 L volume totale) e 100 mL di LB in un flacone da 250 mL. Far capolpare ogni flacone con un foglio di alluminio.
    3. Inoculare una coltura notturna di 100 mL di LB/Ampicillin con una colonia dalla piastra e crescere in un'incubatrice tremante (200 giri) a 37 gradi centigradi.
    4. Inoculare i flaconi da 4 L con 25 mL della coltura notturna e aggiungere gli antibiotici appropriati.
      NOT: Il supporto per le cellule BL21(DE3) pLysS che trasportano il plasmide pet32 dovrebbe avere concentrazioni finali di 25 g/mL chloramphenicol e 50 g/mL Ampicillin.
    5. Indurre l'espressione proteica aggiungendo 0,5 mL di IPTG alla coltura quando l'assorbimento a 600 nm raggiunge 1,0. Abbassare la temperatura dell'incubatrice agitazione a 17 gradi centigradi. Consenti all'espressione di continuare l'espressione in una notte (17 h).
    6. Pellet le cellule per centrifugazione (7.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi). Rimuovere e scartare il supporto liquido.
      NOT: I pellet possono essere conservati a -80 gradi centigradi per mesi o lisci viati immediatamente.
    7. Preparare 100 mL di buffer di lisi (50 mM Tris pH 7,6, 500 mL NaCl, 2 mM beta mercaptoetanolo (BME), 30 mg lisozyme, 5% glicerol, 25 U DNase, 35 mL di estrazione di proteine batteriche). Aprire bottiglie di BME in una cappa chimica durante l'aggiunta. Mantenere il lisato batterico sul ghiaccio o a 4 gradi centigradi per questo e tutti i passaggi successivi.
      NOT: Per le proteasi cisteine, 2 mM BME è incluso per mantenere la cisteina nucleofila ridotta. Le colonne possono essere eseguite a temperatura ambiente utilizzando buffer refrigerati. I tamponi devono essere fatti con acqua fredda deionizzata raffreddata a 4 gradi centigradi.
    8. Risospendere i pellet batterici in 25 mL di tampone di lisi e trasferire 25 mL del lisato in 4 x 50 mL di tubi conici usa e getta. Mettere i tubi in bicchieri di plastica contenenti acqua ghiacciata. Sonicare il lisato 10 volte al livello 5 per intervalli di 15 s.
    9. Trasferire il lisato in tubi centrifugati ad alta velocità. Chiarire il lisato con centrifugazione (30 min, 20.500 x g a 4 gradi centigradi).
    10. Preparare 0,5 L del buffer A (50 mM Tris pH 7,6, 500 mMNaCl, 5% glicerolo, 2 mM BME) e raffreddare a 4 mC.
    11. Preparare 250 mL di buffer B (50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 5% glicerolo, 2 mM BME, 300 mM imidazolo) e raffreddare a 4 gradi centigradi.
    12. Evita una colonna di nichel da 50 mL con 3 volumi di buffer Buffer A. Caricare il lisato chiarificato sulla colonna a 2-5 mL/min e scartare i pellet.
    13. Lavare la colonna (2-5 mL/min) con 2 volumi di colonna di buffer A seguiti da 5 volumi di colonna di Buffer A contenenti 20% Buffer B (60 mM Imidazole). Elutare la proteina (5 mL/min) con 100% Buffer B e raccogliere 10 mL frazioni.
    14. Combinare e concentrare le frazioni contenenti la proteasi che hanno A280 x 0,1 utilizzando un'unità di ultrafiltrazione centrifuga di 15 mL e 15 giri min a 5.000 x g a 4 gradi centigradi. Dopo che il volume è stato ridotto a 5 mL, tampone scambiare la proteina nell'unità di concentrazione aggiungendo tampone di dialisi fresco alla proteina (50 mM Tris pH 7.6, 250 mM NaCl, 5 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM EDTA, 5% Glycerol). Girare di nuovo a 5.000 x g a 4 gradi centigradi per 15 min; ripetere il passaggio 2-3 volte di scambio del buffer. Aggiungete la trombina alla proteina (20 -L di 1 unità/L) prima della dialisi per rimuovere la tioredossina e la sua etichetta.
    15. Trasferire la proteina in un sacchetto di dialisi e dialitare contro 500 mL del tampone di dialisi (4 gradi centigradi) in un cilindro graduato da 500 mL durante la notte.
      NOT: Il sistema FPLC (fast protein liquid chromatography) e la colonna di nichel devono essere accuratamente puliti con tampone di stripping (2 M NaCl, 50 mM EDTA) prima di procedere alla colonna di scambio di anioni. Qualsiasi nichel residuo nelle linee FPLC trasformerà le soluzioni tampone contenenti DTT marrone quando mescolato. Lavare la colonna di nichel e il sistema FPLC con 4 volumi di acqua a colonna. Pompa lavare accuratamente il sistema FPLC con acqua. La colonna di nichel può essere rigenerata scorrendo 2 volumi di colonna di 0,2 M di solfato di nichel sopra la resina per le successive purificazioni.
  2. Per la colonna di scambio di anion preparare 1 L di buffer A (50 mM Tris pH 7.6, 5 mM DTT, 5% glicerol).
    1. Preparare 0,5 L del Buffer B (50 mM Tris pH 7,6, 5 mM DTT, 5% glicerolo, 1,25 M NaCl).
    2. E una colonna di scambio Di 30 mL e di scambio con buffer A (3 volumi di colonne, 2-5 mL/min). Posizionare i tubi nel collettore frazione per la raccolta del flusso attraverso.
      NOT: La proteasi VEEV ha un punto isoelettrico calcolato (pI) di 8.7 e legherà colonne di scambio di cation, ma scorrerà attraverso colonne di scambio di anioni. Il pI può essere calcolato dalla sequenza proteica utilizzando il programma Expasy ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/).
    3. Diluire la proteina dialisata 1:3 con il buffer A, quindi caricare la proteina (5 mL/min). Raccogliere il flow-through in frazioni da 10 mL.
  3. Rimuovere la colonna di scambio di anion dal sistema FPLC. Collegare una colonna di scambio cation al sistema FPLC. E una colonna di scambio Equilibrat di 30 mL con 3 volumi di colonna del Buffer A (5 mL/min).
    1. Caricare il flusso attraverso la colonna di scambio di anion sulla colonna di scambio cation a 2-5 mL/min. Lavare la colonna con buffer A fino a quando ilA 280 torna al livello di base. Eluire la proteina con un gradiente di 100 mL (0-50% Buffer B) e raccogliere 10 mL di frazioni.
      NOT: La proteasi VEEV si proluirà a circa 0,6 M NaCl.
    2. Esaminare le frazioni di colonna utilizzando SDS-PAGE. Combina le frazioni che sono >95% pure e concentrati su un A280 x 2 usando unità di ultrafiltrazione centrifuga da 15 mL. L'enzima può essere congelato in azoto liquido e conservato a -80 gradi centigradi.

4. Affermare l'enzima in modo continuo utilizzando un lettore di piastre

  1. Preparare 50 mL di buffer di analisi (50 mM HEPES pH 7.0).
    1. Poiché le proteasi alfavirali hanno valori digatto k relativamente bassi, diluire l'enzima nel buffer di analisi a 4,7 m (questo corrisponderà approssimativamente a un A280 x 0,2 per la proteasi VEEV senza Trx).
    2. Per misurare l'attività dell'enzima, preparare uno stock di substrato nel buffer di analisi con una concentrazione di 185 M; questo corrisponderà approssimativamente a un A280 x 9. In 8 tubi di microcentrifuga, preparare le miscele di reazione mostrate nella tabella 2 combinando i volumi appropriati del brodo di substrato 185 M e del buffer. In un tubo di lamiera nera a 96 pozzetti 45 gradi l della reazione si mescola in 3 pozzetti (colonne 1, 2, 3). La riga A deve contenere il mix di reazione [S] - 5 M, e la riga H deve contenere il mix di reazione [S] - 140 M.
    3. Impostare il lettore di lastre in modo da rilevare simultaneamente la fluorescenza a due lunghezze d'onda con un'impostazione fissa del tubo fotomoltiplicatore (PMT) (ad esempio, bassa):
      Eccitazione a lunghezza d'onda 1 - 434 nm,emissione
      Ontecia 2 eccitazione - 434 nm,emissione - 470 nm
    4. Impostare il tempo di lettura su 20 min (misura 1 lettura al minuto) e selezionare i pozzi da leggere. Inserire la piastra nel lettore di piastre e misurare il tasso spontaneo di idrolisi per 20 min. Monitorare i rapporti di emissione (emissioni a 527/emissioni a 470) nel tempo.
    5. Eseguire un endpoint letto della piastra contenente il substrato "UNCUT".
      NOT: Questi valori verranno utilizzati nei calcoli dei dati successivi. La media dei rapporti di emissione da 3 pozzetti saranno i valori del substrato "UNCUT" a t - 0 nella tabella 3.
    6. Rimuovere la piastra e pipet 5 l di enzima in ogni bene. Leggere di nuovo il piatto per 20 min con 1 lettura al minuto. Impostare il lettore di lastre per emettere valori assoluti.
      NOT: Per questo esempio, le pendenze saranno negative. Ogni pozzo conterrà un volume totale di 50 gradi l.
    7. Alla fine della lettura, sigillare la piastra con pellicola per evitare l'evaporazione. Lasciare la piastra a temperatura ambiente durante la notte per consentire all'enzima di tagliare completamente il substrato.
    8. Dopo 24 h, rimuovere la pellicola di guarnizione ed eseguire una lettura finale della piastra utilizzando lo stesso PMT delle piastre precedenti. Calcolare la media di questi rapporti di emissione e di input nella tabella 3 in base al "CUT". Confermare la scissione del substrato utilizzando l'affermazione discontinua SDS-PAGE descritta di seguito (Passaggio 5.1.).
    9. Esportare i dati in un foglio di calcolo. Emettere le unità di fluorescenza in ogni punto temporale per le 2 lunghezze d'onda (Tabella 4).
    10. Calcolare il nmol del substrato che è stato tagliato al momento t utilizzando l'equazione (1) dove X è il rapporto di emissione (527 nm/470 nm) in un dato momento, neg è il rapporto di emissione del substrato "UNCUT" a t - 0, e pos è il rapporto di emissione del substrato completamente "CUT" misurato dopo 24 h di taglio (Tabella 3).

      figure-protocol-2

      NOT: I dati relativi alla fluorescenza rappresentativa sono mostrati per un pozzo (bene E7) contenente 80 m di substrato (4 nmol di S per pozzo) nella tabella 4. I calcoli sono stati eseguiti per ogni pozzo nella piastra.
    11. Per ogni pozzo, tracciare il nmol rispetto al tempo (min) e ottenere le velocità iniziali (pendenze) adattando i dati a y : mx e b. Per i dati raccolti in 4.1.5, tracciare nmol e tempo (min) per ogni pozzo. La pendenza sarà uguale al prodotto nmol prodotto al minuto. Sottrarre i tassi spontanei di idrolisi misurati in 4,1,5 dai tassi di reazione enzimatici-catalizzati (Tabella 5).
      NOT: La prima lettura può essere ritagliata dai dati se è in realtà alta a causa del movimento della piastra nel lettore di piastre.
    12. Calcolare la quantità di enzima in mg che è stato aggiunto a ogni pozzo (ad esempio, 0.0009 mg). Un'unità è definita come un molo di prodotto prodotto al minuto. Dividere il nmol/min per il mg di enzima presente nel pozzo per ottenere mU/mg; dividere per 1.000 per ottenere U/mg.
    13. Tracciare [S] sull'asse x e U/mg sull'asse y e adattare i dati all'equazione Michaelis-Menten per ottenere Vmax e Km. Questo può essere fatto nel software (ad esempio, GraFit).

5. Affermare l'enzima in modo discontinuo utilizzando l'analisi SDS-PAGE

  1. Preparare una reazione di 50 -L contenente 10 m substrato e tampone al posto dell'enzima ed etichettare come "UNCUT".
    NOT: I volumi di substrato e buffer sono riportati nella tabella 2. Se il test continuo è stato eseguito, i campioni possono essere utilizzati direttamente dalla piastra del pozzo 96.
    1. Preparare una reazione di 50 -L contenente 10 m di substrato e 5 enzimi ed etichettare come "CUT". Avviare il timer quando l'enzima viene aggiunto al substrato.
      NOT: Gli inibitori possono essere aggiunti a tubi aggiuntivi contenenti enzima e substrato. Regolare il volume del buffer aggiunto per compensare il volume aggiunto dell'inibitore. Le concentrazioni di DMSO non devono superare il 2%.
    2. Incubane le reazioni per 15-24 h a temperatura ambiente (22 x 3 gradi centigradi). Interrompere le reazioni aggiungendo 50 luna di 2x buffer Laemelli. Dopo aver fermato l'ebollizione di reazione, ogni tubo per 3-10 min.
    3. Assemblare il serbatoio gel secondo le indicazioni del produttore. Inserire una cassetta di gel poliacrilamide 17-well pre-cast 12% e una diga tampone sull'altro lato. Riempire il serbatoio interno della cella con 1x buffer di esecuzione SDS fino a quando il buffer raggiunge la parte superiore della cassetta. Riempire il serbatoio esterno mezzo pieno con lo stesso buffer.
    4. Per analizzare la scissione utilizzando il saggio discontinuo, caricare 5 luna di ogni miscela di reazione in una corsia di un gel SDS-PAGE che inizia con la reazione "UNCUT". Includere un marcatore di peso molecolare nella prima o nell'ultima corsia.
    5. Attaccare gli elettrodi del serbatoio del gel all'alimentatore e separare i prodotti a 110 V per 60 min. Rimuovere il gel dalla cassetta inserendo lo strumento di fessurazione tra le piastre. Mettere il gel in un vassoio di plastica e immergere il gel in 5-10 mL di soluzione di colorazione gel; le bande saranno visibili entro 30 min. Dopo 1-24 ore rimuovere la macchia in eccesso, immergere il gel in acqua e utilizzare un gel imager per scattare una foto del gel.

6. Docking Substrate Peptidi alla VEEV-nsP2 Cysteinase Protease

  1. Scaricare il file di coordinate per la proteasi cisteina VEEV dal PDB (https://www.rcsb.org/). Il codice PDB è 2HWK. Salvare il file come 2HWK.pdb.
    1. Preparare la struttura proteica utilizzando MOE (https://www.chemcomp.com/). Caricare il file PDB della proteina in MOE. Fare clic su Seleziona e Solvente sulla barra laterale destra ed eliminare il solvente.
    2. Aprire il pannello Preparazione struttura dalla barra dei menu superiore Proteine. Correggere automaticamente tutti gli elementi strutturali facendo clic su Correggi e protona la struttura facendo clic su Protonate3D. Aggiungere cariche parziali alla proteina aprendo il pannello Spese parziali e selezionando Ambra 99 e Regola idrogeno e coppie solitarie come richiesto. Infine, salvare il file di struttura come "2HWK_dock.pdb".
  2. Costruire la struttura per i peptidi del substrato (nsP12, nsP23, nsP34) e TRIM14 utilizzando MOE. Aprire il pannello Generatore di proteine, immettere la sequenza del substrato, impostare la geometria su Estesa e fare clic su Costruisci. La struttura verrà visualizzata nella finestra MOE.
    1. Ridurre al minimo la struttura dei peptidi facendo clic su Riduci a icona sul pannello. Salvare la struttura come file PDB (Figura 6).
  3. Agganciare i peptidi del substrato a VEEV-nsP2 utilizzando PyRx/AutoDock 4.2 (http://autodock.scripps.edu/). Aprire lo strumento PyRx, modificare l'impostazione delle preferenze, disattivare tutte le torsioni per la preparazione del ligando. Caricare la molecola del substrato, fare clic con il pulsante destro del mouse sul nome della molecola nel pannello Navigatore, selezionare Crea ligando per preparare il file di ancoraggio del ligando. Caricare la proteina 2HWK_clean.pdb e selezionare Crea macromolecola per preparare il file di ancoraggio pdbqt (Figura 7).
    1. Avviare autoDock Wizard dal pannello di ancoraggio nella parte inferiore. Selezionare i file di ligando e proteine preparati. Definire la tasca di legatura delle proteine regolando manualmente la dimensione della griglia centrata sul residuo catalitico Cys-477. Utilizzando il parametro di spaziatura di default 0,375 - Fare clic su Esegui autoGrid per generare mappe griglia.
    2. Eseguire AutoDock e selezionare il metodo LGA (Lamarckian Genetic Algorithm). Fare clic su Parametri di ancoraggio e impostare il numero di corse GA su 50. Utilizzare i parametri predefiniti per altri utenti. Fare clic su Avanti per avviare la corsa di ancoraggio.
    3. Aprire il pannello Analizza risultati. Ispezionare tutte le pose di rilegatura previste. Selezionare il modello migliore con l'energia di legame prevista più bassa e le interazioni di legame ragionevoli tra il Cys-477 e il substrato sul sito di scissione. Salvare il modello di associazione come file PDB per ulteriori simulazioni MD.

7. Simulazioni MD di complessi di substrato VEEV ancorati

  1. Preparare i file di input utilizzando Amber (http://ambermd.org/). Seguendo il protocollo standard, vengono eseguite simulazioni MD per i modelli di associazione del substrato previsto utilizzando il pacchetto AMBER e il campo di forza ff99SB.
    NOT: I sistemi solvati sono sottoposti a una riduzione completa dell'energia prima delle simulazioni MD. Le condizioni di contorno periodiche vengono applicate per simulare un sistema continuo. Il metodo della mesh di particelle Ewald (PME) è stato utilizzato per calcolare le interazioni elettrostatiche a lungo raggio. Il sistema simulato è stato inizialmente sottoposto ad un aumento graduale della temperatura da 0 K a 300 K su 100 ps, e poi equilibrato per 500 ps a 300 K, seguito da cicli di produzione di 2 ns di lunghezza in totale.
    1. Eseguire il processo di simulazione in una struttura di elaborazione ad alte prestazioni. Le nostre simulazioni sono state eseguite sul cluster Biowulf (https://hpc.nih.gov/) (Figura 8).
    2. Visualizzare l'output della traiettoria utilizzando il programma VMD (http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/). Analizzare le interazioni di associazione e le modifiche conformazionali dei substrati e TRIM14 all'interno del sito attivo di nsP2 (Figura 9).

Risultati

L'analisi SSHHPS della proteasi di iKV ns2B/3 ha identificato 4 bersagli proteici ospiti: FOXG1, SFRP1, una sottounità alfa Gda una libreria cDNA retinica e il mitocondriale NT5M 5',3'nucleotidase (Figura 10)6. In particolare, nessun altro metodo ha previsto queste proteine come potenziali bersagli della proteasi di IKV. Le mutazioni nel gene FOXG1 sono state collegate a una sindrome congenita caratterizzata da uno sviluppo alterato e da anomalie strutturali del cervello come la microcefalia. SFRP1 è una proteina brizzolata secreta (SFRP); questi recettori solubili possono legare in modo competitivo i ligandi Wnt per antagonizzare e inibire la segnalazione Wnt. Il percorso di segnalazione Wnt è coinvolto nella regolazione della risposta IFN durante l'infezione Flavivirus36. La scissione di SFRP1 dovrebbe migliorare la replicazione del flavivirus. SFRP1 è anche coinvolto nella differenziazione delle cellule Th1737. I allineamenti delle sequenze della SSHHPS hanno mostrato differenze specifiche delle specie nelle sequenze del sito di scissione (Figura 10D). La sequenza del sito di scissione in SFRP1 era identica negli esseri umani e nei polli; La IKV può indurre la mortalità e la microcefalia negli embrioni di pollo38 . Nei roditori, il residuo di P1 altamente conservato (K/R)R-G viene sostituito da una glicina (RGG). I ceppi immunocompetenti di topi sono generalmente resistenti alle infezioni e alla malattia diIKV 39.

I parametri nettici di stato stabile e le costanti di inibizione possono essere misurati per le sequenze di poliproteine virali e per le sequenze proteiche ospiti utilizzando l'analisi continua in un lettore di lamiere31,40,41 ( Figura11A). Per informazioni qualitative sulla scissione, come la scissione di una particolare sequenza o l'inibizione della proteasi da parte di vari composti, è possibile utilizzare il saggio discontinuo (Figura 11B).

Potrebbe essere necessaria l'ottimizzazione del numero di residui tra CFP e YFP. Un modello associato a substrato può essere realizzato utilizzando i metodi in silico. Un modello agganciato rappresentativo del nodo nsP1/nsP2 è illustrato nella figura 9. Per la proteasi VEEV nsP2, era stata segnalata una sequenza di 12 amminoacidi Semliki Forest Virus (SFV) (Km - 0,58 mM). L'allungamento della sequenza di substrati a 19, 22 e 25 residui e la riduzione della forza ionica del buffer ha portato a una significativa riduzione in Km. L'esame della struttura cristallina VEEV nsP2 e dell'imballaggio dei cristalli ha anche mostrato che una parte di una delle giunzioni era imballata contro il dominio della proteasi ed era elicoidale. Pertanto, i substrati VEEV più lunghi possono legarsi meglio a causa del riconoscimento di un motivo strutturale secondario.

Per TRIM14, abbiamo ottenuto un Km - 21 , M6,33. Il Km per il substrato che trasporta la sequenza proteica ospite era paragonabile ai valori Km dei substrati contenenti le sequenze del sito di clevaggio poliproteico virale (Km(V12) - 12 M e Km(V34) - 21 M). Le sequenze del sito di scissione nelle giunzioni nsP1/nsP2, nsP2/nsP3 e nsP3/nsP4 sono state tagliate con diverse efficienze. Nella cellula, questo è pensato per consentire la scissione sequenziale della poliproteina42.

Prestare attenzione nell'interpretare i risultati negativi. Se non si verifica alcuna scissione, il sito di scissione può essere troppo breve o la proteasi purificata può essere inattiva. Per i substrati tagliati, sono necessari ulteriori esperimenti per confermare la scissione della proteina o della scissione a tutta lunghezza nelle cellule infettate da virus. Dovrebbero essere scelti adeguati esperimenti successivi. Gli effetti della sovraespressione o del silenziamento della proteina bersaglio sulla replicazione virale possono anche essere testati.

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Figura 1: Tre meccanismi di silenziamento. Il silenziamento può verificarsi a livello di DNA, RNA o proteina. Questi algoritmi di "ricerca ed eliminazione" utilizzano ciascuno una "parola chiave" per indirizzare la scissione di un file contenente la parola. Questa cifra è stata modificata da Morazzani et al.32 e i riferimenti in quella volta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Differenze specifiche delle specie nelle sequenze del sito di scissione. I domini PRY/SPRY del terminalE C degli omologhi TRIM14 sono mostrati nell'allineamento. Il dominio PRY/SPRY può essere identificato dai motivi conservati evidenziati in grigio. L'uomo TRIM14 viene tagliato a QEAGA-G dalla proteasi cisteina di VEEV nsP2. La sequenza SSHHP viene visualizzata a colori. Il residuo in verde è il residuo P1'; in blu è il residuo P4, e in rosso sono altri residui conservati all'interno della sequenza di motivo sito scissione. Equine porto una versione troncata di TRIM14 privo del dominio PRY/SPRY. La lisina evidenziata nel ciano è poli-ubiquitinated ed è importante per l'assemblaggio del signaloso MAVS. Il dominio PRY/SPRY del terminale C può essere tagliato transitoriamente dalla proteasi nsP2 per compromettere la risposta antivirale dell'ospite intracellulare durante un'infezione virale acuta. In equino, questo dominio è sempre assente. Ciò suggerisce che il dominio PRY/SPRY di TRIM14 può avere una funzione protettiva contro le infezioni da VEEV. Questa figura è stata riprodotta da Morazanni et al.6Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: identificazione SSHHPS tramite BLAST. La sequenza di motivo sito di scissione nella giunzione VEEV nsP1/nsP2 è allineata con la sequenza SSHHP nella proteina ospite TRIM14. Il residuo colorato in verde è il residuo P1'; in blu è il residuo P4 e in rosso sono altri residui conservati della sequenza di motivi sito scissione. La maggior parte degli allineamenti conteneva omologia a regioni al di fuori del motivo del sito di scissione conservato o non includeva i residui di legame scissile P1/P1'. TRIM14 ha mostrato una corrispondenza a 6 residui in ordine sequenziale che includeva P1 e P1'. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Sequenze proteiche e di DNA del substrato CFP-V12-YFP per la proteasi cisteina VEEV nsP2. I siti di restrizione NdeI (CATATG) e XhoI (CTCGAG) sono visualizzati in lettere maiuscole. In rosso è la sequenza del sito di scissione dalla poliproteina virale che si trova tra nsP1 e nsP2. Il residuo in verde è il residuo P1' e in blu è il residuo P4 del sito di scissione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Sequenza proteica del costrutto della proteasi di cisteina Trx-VEEV-nsP2. Thioredoxin (Trx) è mostrato in giallo. Il sito di scissione della trombina e His-tag sono mostrati in ciano. I Cys-His dyad sono etichettati in rosso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Strutture di peptide in MOE. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: aggancio del peptide del substrato utilizzando PyRx/AutoDock. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Lavori in esecuzione sul cluster Biowulf. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 9: Modello del substrato VEEV P12 contenente la sequenza del sito di scissione nella giunzione nsP1/nsP2. Il diala catalitico Cys-477/His-546 è mostrato in blu. La figura è stata effettuata utilizzando Pymol (https://pymol.org). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 10: Analisi SSHHPS della proteasi del virus ns2B/ns3. (A) Previsti bersagli proteici ospiti della proteasi di n2B/ns3. I residui in rosso corrispondono a una singola sequenza di siti di scissione. I residui in verde sono tollerati nel sito secondario e corrispondono ai residui in altri siti di scissione. SFRP1 aveva il maggior numero di residui identici in ordine consecutivo. (B) le proteine CFP-substrato-YFP (50-60 kDa) sono state espresse e purificate contenente la sequenza SSHHP prevista da ogni proteina ospite (umana). La proteasi di SimLaKV ha tagliato foxG1, SFRP1, NT5M e una sottounità alfa Gsisolata da una libreria cDNA retinica. I prodotti di scissione sono circa 28-30 kDa. Le sequenze di substrato sono disponibili in Morazzani et al.6 (C) Mentre la proteasi ns2B/ns3 taglia SFRP1, non ha tagliato i suoi omologhi (SFRP2 e SFRP4). (D) L'allineamento dei siti di scissione di diverse specie animali può essere utile per selezionare un modello animale per un virus di gruppo IV. Si noti che la sequenza di r-G conservata differisce tra gli esseri umani e i roditori in SFRP1. Figura riprodotta da Morazzani et al.6Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 11: Analisi cinetica di stato costante utilizzando i saggi continui e discontinui. (A) I dati cinetici mostrati nella tabella 5 sono stati tracciati in GraFit. L'insetto mostra il grafico Lineweaver-Burk. (B) Gel SDS-PAGE che mostra i prodotti di scissione del substrato CFP-V12-YFP. Nella corsia 1 è il substrato "UNCUT" (48 kDa). Nella corsia 2 è il substrato "CUT" (31 kDa e 27 kDa). Nelle corsie 3-9 diversi composti sono stati inclusi per testare la loro attività inibitoria. La corsia 4 contiene l'inibitore covalente E64d. Queste reazioni sono state eseguite durante la notte per 17 h a temperatura ambiente. L'ebollizione dei campioni è stata necessaria per ottenere il modello di fasciatura affilata. La proteasi nsP2 è visibile (56 kDa) nelle reazioni contenenti enzima, ma non nella corsia 1. La corsia 1 è il controllo "nessun enzima". Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

La distruzione specifica della sequenza di una proteina o di un acido nucleico guidato da una sequenza estranea si vede solo in pochi casi in biologia. I meccanismi illustrati nella Figura 1 sono meccanismi difensivi che proteggono un host da un virus o un virus da un host.

Utilizzando metodi bioinformatici possiamo identificare gli obiettivi che vengono distrutti da questi sistemi. Nelle nostre analisi delle sequenze SSHHP, abbiamo scoperto che molte di esse potrebbero essere trovate nelle proteine necessarie per generare risposte immunitarie innate. Alcuni avevano ruoli ovvi come MAVS e TRIF (TIR-domain-che induce l'interferone-z), mentre altri erano legati all'immunità anche se meccanismi più complessi (ad esempio, Histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. Le informazioni di destinazione memorizzate nella sequenza SSHHP hanno il potenziale per identificare le vie che hanno effetti antivirali contro questi virus. Le risposte antivirali in vivo sono spesso specifiche per i virus26,43. Ad esempio, sottoinsiemi di proteine TRIM hanno effetti antivirali su diversi virus43,44,45, alcuni sono fattori di restrizione virale (ad esempio, HIV e TRIM5). La specificità delle proteine TRIM (70 dollari sono stati identificati) è ancora in fase di esame44,45. Le informazioni all'interno di SSHHPS possono contribuire alla nostra comprensione di come questi virus eludano le risposte immunitarie innate. Altri modelli e correlazioni possono essere scoperti con l'esame di un maggior numero di SSHHPS.

Differenze specifiche per specie erano evidenti nelle nostre analisi (Figura 2, Figura 10). Questi virus sono noti per colpire alcune specie più di altri. Le informazioni sulla gamma host, la suscettibilità degli host e le difese dell'host possono essere presenti all'interno di SSHHPS. Per esempio, l'equina, la specie più suscettibile ai virus dell'encefalite equina, mancava della regione dell'TRIM14 umano che veniva tagliata transitoriamente dalla proteasi VEEV nsP2. Gli esseri umani raramente muoiono per infezioni da VEEV, ma possono essere infettati24. La proteina umana TRIM14 trasportava una sequenza di scissione della proteasi nsP26. La presenza del sito di scissione suggerisce che gli esseri umani hanno un meccanismo di difesa contro questi virus. Gli uccelli sono stati pensati per essere potenziali serbatoi di questi virus46. La corrispondente sequenza SSHHP nella proteina TRIM14 dei polli differiva dalle sequenze presenti negli esseri umani e in altre specie. Sottili differenze come queste possono rendere una proteina ospite bersaglio sciaforma o più facilmente sciolsa. Aguirre et al.16 ha mostrato che una proteina STRING mutata da zio-avabile ha indotto livelli superiori di IFN dopo l'infezione da virus Dengue e che i topi portano naturalmente una versione di STING che non viene tagliata dalla proteasi Dengue ns2B3. La proteina murine STING non è stata tagliata dalla proteasi47. Nella nostra analisi SSHHPS, abbiamo anche osservato differenze nelle sequenze del sito di scissione della proteasi di IKV quando abbiamo confrontato le proteine umane con quelle dei roditori6 (Figura 10D). La riproduzione delle scissioni proteolitiche specifiche delle proteine ospiti può essere importante nei modelli animali utilizzati per i virus del Gruppo IV. L'inibizione della scissione delle proteine ospiti ha anche implicazioni per quanto riguarda lo sviluppo di inibitori della proteasi di gruppo IV. Nella nostra pubblicazione precedente, abbiamo dimostrato che potevamo inibire la scissione TRIM14 con la proteasi VEEV nsP2 utilizzando CA074 ester dimetile 6. Questo risultato suggerisce che piccoli inibitori molecolari di queste proteasi possono essere in grado di modulare le risposte immunitarie innate che sono in grado di sopprimere l'infezione6,31.

La variazione genetica all'interno di una specie ha anche il potenziale per produrre differenze nella scissione proteolitica. Sottili differenze nell'uso del codone potrebbero influenzare la pausa ribosomiana48. Poiché alcune proteasi virali di Gruppo IV sono incorporate nella membrana ER, le differenze in queste pause potrebbero influenzare la scissione di un bersaglio se la scissione si verifica in modo co-traduzione. Alcuni dei siti di scissione che abbiamo identificato erano in sequenze di peptidi di segnale previste (ad esempio, SFRP1) mentre altri erano interni.

L'analisi SSHHPS può produrre informazioni che differiscono da altri metodi di analisi delle proteine ospiti. L'analisi SSHHPS è stata poco costosa e facile da impiegare. L'uso di un sistema di espressione batterica ha permesso di testare i segmenti corti (25 aminoacidi) delle sequenze di mammiferi senza l'uso della coltura cellulare dei mammiferi. Abbiamo scoperto che i substrati CFP-YFP erano in grado di tollerare tutte le sequenze proteiche umane testate; tuttavia, le rese variavano. In analisi simili, substrati contenenti sequenze proteiche umane fino a quando 63 aminoacidi sono stati espressi con successo, purificati e utilizzati per analisi cinetiche e screening degli inibitori49,50,51. Poiché solo piccole quantità di substrato sono necessarie per il saggio discontinuo, è possibile esplorare un gran numero di obiettivi. Un vantaggio del sistema è che i substrati CFP/YFP possono essere utilizzati per le analisi SDS-PAGE e per analisi cinetiche più elaborate (cioè IC50, Ki, Km, Vmax). Per la scoperta di farmaci, i composti inibitori possono produrre artefatti nei saggi fluorescenti. Così, il saggio discontinuo in combinazione con un saggio continuo permette di confermare la scissione o l'inibizione della scissione. I campioni per il saggio SDS-PAGE discontinuo possono essere prelevati direttamente dalle piastre da 96 pozze. I substrati CFP/YFP sono stati utilizzati per lo screening della libreria composta52. Tuttavia, sono necessarie ulteriori analisi per determinare se un substrato è adatto per lo screening ad alta produttività, come il calcolo di un fattore z53.

Una sfida nella progettazione di un substrato è identificare la regione intorno al legame di scissile che è legato e riconosciuto dalla proteasi. Negli esempi mostrati qui, abbiamo iniziato con 12 sequenze di residui che sono state centrate intorno al legame scissile. Dopo aver analizzato gli allineamenti di sequenza dei siti di scissione ai residui, è stato trovato Il terminale N del legame con la scientifica VEEV, mentre per l'omologia protease di .IKV a molti dei residui del terminale C è stato trovato. Un modello in silico del substrato ancorato può essere utilizzato per progettare esperimenti di mutagenesi diretti al sito che sondano i siti di legame del substrato. Poiché le sequenze di substrato ed enzima sono su plasmidi, sia può essere mutato per testare i modelli in silico o tolleranze subsite. Questo può essere vantaggioso se non è disponibile una struttura cristallina del substrato(s) rilegato.

L'analisi SSHHPS può anche fornire nuove informazioni sui meccanismi mediante i quali i fenotipi indotti da virus sono prodotti da enzimi virali. Uno degli obiettivi di , SFRP1, fa parte del percorso di segnalazione Wnt e ha ruoli nello sviluppo sia del cervello che dell'occhio e nelle risposte immunitarie36,37,54,55,56,57. Abbiamo scoperto che le altre sequenze proteiche che potrebbero essere tagliate dalla proteasi di n2B/ns3 erano anche in proteine coinvolte nello sviluppo di cervello e occhi; anomalie in entrambi sono stati osservati nella sindrome congenita di zika e si pensa che faccia parte del fenotipo indotto dal virus58.

La prevedibilità delle interazioni ospite-patogeno potrebbe essere sfruttata per una varietà di applicazioni: terapie virali oncolitiche specifiche del bersaglio; de-risking di vaccini contro il virus vivo; perfezionamento, previsione o selezione di modelli animali; previsione dell'intervallo o della suscettibilità dell'ospite; previsione di eventi zoonotici; e la previsione delle difese dell'ospite. Poiché i metodi descritti sono basati sulla sequenza, possono essere di valore da incorporare nel software in futuro.

Dichiarazioni

Le opinioni qui espresse sono quelle degli autori e non rappresentano quelle della U.S. Navy, Dell'Esercito degli Stati Uniti, del Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti o del governo degli Stati Uniti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dai numeri di progetto della Defense Threat Reduction Agency (DTRA) CB-SEED-SEED09-2-0061 e CBCall4-CBM-05-2-0019, e in parte dal programma di ricerca Intramurale/Extramural dei fondi di base NCATS, NIH (XH) e Naval Research Laboratory.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
250 mL Erlenmeyer PalloneVWR89000-362
2-mercaptoetanoloAcros Organics (Fisher)125472500Pericolo: Acutamente tossico. Aprire il flacone nel cofano per evitare di inalare i fumi.
Pallone graduato Erlenmeyer a bocca larga in Pyrex da 4 L con tappo a viteMillipore SigmaCLS49954L-1EA
AKTA Prime PlusGE Healthcare17-0729-01
AKTA XK 16/20 ColonnaGE Healthcare28988937
Unità filtrante centrifuga Amicon Ultra-0.5 Unità filtrante
Amicon Ultra-15Millipore SigmaUFC901096
Amicon Ultra-4 Unità di filtro centrifugoMillipore SigmaUFC801024
AmpicillinaSigmaA0166Pericolo: Reazioni allergiche (cutanee o respiratorie).
Sefarosio chelante a flusso rapidoGE Healthcare17-0575-02Una volta che la resina è stata bilanciata con solfato di nichel 0,2 M, nel testo si fa riferimento a una colonna di nichel. La colonna avrà un colore verde dopo il lavaggio con acqua. La colonna avrà un colore blu dopo l'equilibratura con il buffer.
CloramfenicoloRPIC61000Pericolo: Può causare il cancro.
Provette da centrifuga Corning da 50 mL SuggerimentoCorning430828: le provette in polipropilene hanno meno probabilità di rompersi durante la sonicazione rispetto alle provette in polietilene
Corning 96 Well-Well Half-Area Microplate , superficie non vincolanteCorning3993
Clip per tubi per dialisiScientificPI68011
colonna di desalinizzazione monouso PD-10GE Healthcare17-0851-01
DNAseSigmaDN25-1G
DTT (DL-Ditiotreitolo)RPID11000-50.0Avvertenza: tossicità orale acuta; irritazione della pelle e degli occhi
EDTAFisher ScientificS311-500
Fisherbrand Piastre di Petri con coperchio trasparenteFisher ScientificFB0875712
GlycerolAcros Organics (Fisher)15892-0010
HEPESMillipore SigmaH4034-1KG
ImidazoleAcros Organics301870010 Pericolo: Tossico, irritante
IPTG (isopropil β-D-tiogalattopiranoside)Calbiochem (Millipore Sigma)420291Non respirare la polvere. Evitare il contatto con gli occhi e la pelle.
Laemmli Sample BufferBIO-RAD1610737
Luria Bertani AgarFluka (Millipore Sigma)L3027-1KGSuggerimento: Autoclave con agitatore magnetico nel liquido e agitare durante il raffreddamento. Attendi di aggiungere l'antibiotico fino a quando non riesci a tenere le mani sulla bottiglia senza dolore per 30 secondi.
Luria Bertani MediaFisher BioreagentsBP1426-2
LysozymeSigmaL4919-5g
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel BoxBIO-RAD
Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge TubesNalgene (Thermo Scientific)3119-0050
NanodropThermo Fisher
Incubatore shaker New Brunswick Innova 42REppendorfM1335
Solfato di nichel esaidrato (cristallino/certificato ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificN73-500Pericolo: Nocivo se ingerito o inalato, irritazione della pelle e degli occhi
Shot BL21(DE3) Chimicamente competente E. coliInvitrogen (Thermo Fisher)C600003Può essere dannoso se inalato o ingerito. Può causare irritazione della pelle e degli occhi in presenza di persone sensibili.
One Shot BL21(DE3) pLysS Chimicamente competente E. coliInvitrogen (Thermo Fisher)C606003Può essere dannoso se inalato o ingerito. Può causare irritazione della pelle e degli occhi in presenza di persone sensibili.
pet15b plasmide DNANovagen (Millipore Sigma)69661GenScript Inc. è stato utilizzato per la sintesi commerciale del DNA. Il plasmide pet15b è stato utilizzato per i substrati CFP/YFP.
pet32bNovagen (Millipore Sigma)69016-3Il plasmide pet32b è stato utilizzato per il costrutto della proteasi della cisteina.
Mini compresse di inibitore della proteasi Pierce, senza EDTAThermo FisherA32955Avvertenza: corrosione/irriazione della pelle; danni agli occhi
Lettore di piastreDispositivi molecolariModello M5
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein StandardBIO-RAD161-0373
Reagente per l'estrazione delle proteineNovagen (Millipore Sigma)70584-4BugBuster o Bper (Catalogo # 78248, ThermoFisher)
Q-Sepharose Fast FlowG.E. Healthcare17-0510-01Resina a scambio anionico
RunBlue (12%) Gel PAGE a 17 pozzettiExpedeonBCG01227È possibile utilizzare qualsiasi gel di poliacrilammide prefuso al 12%
RunBlue 20x SDS Running BufferExpedeonNXB50500Diluire 50 mL con 950 mL di acqua deionizzata per ottenere 1x
RunBlue Instant Blue Gel MacchiaExpedeonISB1LNon diluire, utilizzare come indicato
Cloruro di sodioFisher ChemicalS271-10
Sonifier Cell Disrupter 450 SonicatorBranson Ultrasonics (VWR)Modello n. 101-063-346RIl sonicatore è stato utilizzato sul livello 5
Spectra/Por 6-8 kD MWCOSpectrum Labs132645TTubo per dialisi
SP-Sepharose Fast FlowG.E. Sanità17-0729-01Resina a scambio cationico
Trombina da plasma bovinoSigmaT6634-500UN
Tris BaseFisher ScientificBP152-500Attenzione: irritante per occhi/pelle
centrifuga Millipore Sigma UFC501096 Fisher One

Riferimenti

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