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Articolo metodologico

Bioinchiostro a matrice extracellulare derivato dal tessuto pancreatico per la stampa di costrutti di tessuto pancreatico 3D Cell-Laden

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DOI:

10.3791/60434

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13 dicembre 2019

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

La matrice extracellulare decellularizzata (dECM) può fornire adeguati segnali microambientali per ricapitolare le funzioni intrinseche dei tessuti bersaglio in un costrutto ingegnerizzato. Questo articolo chiarisce i protocolli per la decellularizzazione del tessuto pancreatico, la valutazione del bioink dECM derivato dal tessuto pancreatico e la generazione di costrutti di tessuto pancreatico 3D utilizzando una tecnica di biostampa.

Abstract

Il trapianto di isole pancreatiche è un trattamento promettente per i pazienti che soffrono di diabete di tipo 1 accompagnato da ipoglicemia e complicazioni secondarie. Tuttavia, il trapianto di isole presenta ancora diverse limitazioni, come la scarsa vitalità delle isole trapiantate a causa di un cattivo innesto di isole e di ambienti ostili. Inoltre, le cellule che producono insulina differenziata dalle cellule staminali pluripotenti umane hanno capacità limitate di secernere ormoni sufficienti che possono regolare il livello di glucosio nel sangue; pertanto, è fortemente necessario migliorare la maturazione colticce le cellule con adeguati segnali microambientali. In questo articolo, chiariamo i protocolli per la preparazione di un bioink a matrice extracellulare decellularizzata decellularizzata (pdECM) derivato dal tessuto pancreatico per fornire un microambiente benefico che può aumentare la sensibilità al glucosio delle isole pancreatiche, seguito da descrivere i processi per la generazione di costrutti di tessuto pancreatico 3D utilizzando una tecnica di biostampa basata sulla microestrusione.

Introduzione

Recentemente, il trapianto di islet pancreatico è stato considerato un trattamento promettente per i pazienti con diabete di tipo 1. La relativa sicurezza e la minima invasività della procedura sono grandi vantaggi di questo trattamento1. Tuttavia, ha diverse limitazioni come il basso tasso di successo delle isole isolare e gli effetti collaterali dei farmaci immunosoppressori. Inoltre, il numero di isolotti innevati diminuisce costantemente dopo il trapianto a causa dell'ambiente ostile2. Vari materiali biocompatibili come algerino, collagene, poli(acido lattico-co-glicolico) (PLGA) o glicole di polietilene (PEG) sono s....

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Protocollo

Tessuti pancreatici porcini sono stati raccolti da un macello locale. Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Asan Medical Center di Seoul, Corea.

1. Decellularizzazione dei tessuti

  1. Preparare le soluzioni per la decellularizzazione.
    NOTA: 1x salina con buffer fosfato (PBS) utilizzata in tutti i preparati della soluzione viene diluita aggiungendo acqua distillata a 10 volte PBS.
    1. Per la soluzione 1% Triton-X 100, sciogliere 100 mL di 100% soluzione Triton-X 100 in 900 mL di 1x PBS utilizzando una barra di stiring magnetico con l'agitazione a 150 rpm ....

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Risultati

Decellularizzazione dei tessuti pancreatici
Abbiamo sviluppato il processo di preparazione del bioink pdECM per fornire microambienti specifici del tessuto pancreatico per migliorare la funzionalità delle isolotti in un costrutto di tessuto biostampato 3D (Figura 2A). Dopo il processo di decellularizzazione, il 97,3% del dsDNA è stato rimosso e componenti ECM rappresentativi come collagene e GAG sono rimasti rispettivament.......

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Discussione

Questo protocollo ha descritto lo sviluppo di bioinks pdECM e la fabbricazione di costrutti di tessuto pancreatico 3D utilizzando tecniche di stampa cellulare 3D. Per ricapitolare il microambiente del tessuto bersaglio nel costrutto di tessuto ingegnerizzato 3D, la scelta del bioink è fondamentale. In uno studio precedente, abbiamo convalidato che i bioink dECM specifici dei tessuti sono utili per promuovere la differenziazione delle cellule staminali e la proliferazione10. Rispetto ai polimeri si.......

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Ringraziamenti

Questa ricerca è stata sostenuta dal Bio & Medical Technology Development Program della National Research Foundation (NRF) finanziato dal governo coreano (MSIT) (2017M3A9C6032067) e da "ICT Consilience Creative Program" (IITP-2019-2011-1-00783) supervisionato dall'IITP (Institute for Information & Communications Technology Planning & Evaluation).

....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Armadi di Sicurezza BiologicaCRYSTEPURICUBE 1200
CongelatoreThermo Scientific Forma957
Agitatore orbitale digitaleDAIHAN ScientificDH.
Forno a seccoDAIHAN ScientificWON-155
LiofilizzatoreLABCONCO7670540
FrigoriferoSANSUNGCRFD-1141
GrattugiaABM1415605793
Microscopi invertiti LeicaDMi1
MicrocentrifugaCRYSTEPURISPIN 17R
Lettore di micropiastreThermo Fisher ScientificMultiskan GO
Mini centrifugaDAIHAN ScientificCF-5
Agitatori multi-piastra riscaldanteDAIHAN ScientificSMHS-6
NanodropThermo Fisher Scientific Misuratoreda banco ND-LITE-PR Thermo
Fisher ScientificSTARA2110
ReometroTA StrumentoDiscovery HR-2
Miscelatore a vorticeDAIHAN ScientificVM-10
Cirurgical Instruments
Forbici operativeHiroseHC.13-122
ForcepKorea Ace ScientificHC.203-30
Materials
Provetta per microcentrifuga da 1,7 mLAxygenMCT-175-C
Flaconcino di vetro da 10 mlScilabSL. VI1243
40 µ filtro cellulare Falcon352340
becher da 5 LDong Sung ScienceSDS 2400
provetta cornicale da 50 mLFalcon352070
becher da 500 mLKorea Ace ScientificKA.23-08
filtro sottovuoto per flaconi da 500 mLCorning431118
contenitore in plastica da 500 mLLOCK& LOCKINL301
Piastra a 96 pozzettiFalcon353072
Foglio di alluminioDAEKYO
KimwipeKimtech
Barra magneticaCorea Ace ScientificBA.37110-0003
Mortaio e pestelloDAIHAN ScientificSC. Pipettatore multicanale MG100
Eppendorf4982000314
Petri DishSPL10100
Strisce indicatrici di pHSigma-Aldrich
Setaccio a reteDAIHAN Scientific
Decellularizzazione
10x pbsHycloneSH30258.01
4,7% Acido peraceticoOmegafarm
70% etanoloSAMCHUN CHEMICALSE0220 SAM
Acqua
IPASAMCHUN CHEMICALSsamchun I0348
Triton-X 100BiosesangT1020
Saggio biochimico
1,9-Dimetil-Metilene Cloruro di zinco blu doppio saleSigma-Aldrich341088
10 N NaOHBiosesangS2018
Clorammina TSigma-Aldrich857319
Condroitina solfato ASigma-AldrichC4384
Acido citricoSupelco46933
Cisteina-HClSigma-AldrichC1276
Acido acetico glacialeMerok100063
GlicinaSigma-Aldrich410225
HClSigma-AldrichH1758
Na2-EDTASigma-AldrichE5134
NaClSAMCHUN CHEMICALSS2097
PapainaSigma-Aldrichp4762
P-DABSigma-AldrichD2004
Acido percloricoSigma-Aldrich311421
Acetato di sodioSigma-AldrichS5636
Idrossido di sodioSupelcoSX0607N
Fosfato di sodio (monobasico)Sigma-AldrichRDD007
TolueneSigma-Aldrich244511
Bioink
Caratterizzato FBSHycloneSH30084.03
Penicillina-StreptomicinaThermo Fisher Scientific15140122
PepsinaSigma-AldrichP7215
Rose bengalSigma-Aldrich198250
RPMI-1640 medioThermo Fisher Scientific11875093
soluzione di Trypan BlueSigma-AldrichT8154
WSO04010 di pH 1095350001 distillata

Riferimenti

  1. Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268(2017).
  2. Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeu....

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Ristampe e permessi

Tag

ECM derivata da tessuto pancreaticomatrice extracellulare decellularizzatapreparazione del bioinktecnica di biostampa 3Dincapsulamento di isolotticomposizione tessuto-specificastampa a estrusionecaratterizzazione reologicatransizione sol-gelvalutazione della sensibilità al glucosio