Articolo metodologico

Modello di carcinogenesi cutanea indotta dalla sostanza chimica utilizzando Dimethylbenz[a]Anthracene e 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate (DMBA-TPA)

DOI:

10.3791/60445

⸱

19 dicembre 2019

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University and Tampere University Hospital, 2Department of Clinical Microbiology, Fimlab Laboratories

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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La carcinogenesi cutanea a due stadi è indotta da due sostanze chimiche applicate topicamente. Un mutagen 7,12-dimethylbenz[a]anthracene) provoca mutazioni nelle cellule epidermiche e una continua applicazione dello stimolatore di crescita generale 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetato accelera la formazione di papilloma cutaneo.

Abstract

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Il cancro è una delle malattie umane più devastanti. I modelli sperimentali di cancro sono importanti per ottenere informazioni sulla complessa interazione di diversi tipi di cellule e geni nella promozione della progressione tumorale e per fornire una piattaforma per testare l'efficacia di diversi approcci terapeutici. Uno dei modelli di carcinogenesi infiammatoria sperimentale più comunemente utilizzati è il modello di carcinogenesi cutanea a due stadi DMBA-TPA. La formazione del tumore è indotta in questo modello dall'applicazione topica di due diverse sostanze chimiche, 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) e 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetato (TPA), che insieme causano formazione di papilloma nella pelle. Poiché il risultato principale è la formazione di papilloma nella pelle, il modello è un modo ideale, affidabile e riproducibile per affrontare sia l'inizio del tumore (sopravvivenza senza tumore) che la progressione del tumore (numero e dimensione dei tumori visibili). Gli effetti del trattamento DMBA-TPA sono trasmessi attraverso un meccanismo infiammatorio, che rende questo modello particolarmente adatto per studiare il ruolo del sistema immunitario nella formazione del tumore. Tuttavia, questo modello è limitato alla pelle e ad altre superfici su cui possono essere applicate le sostanze chimiche. In questo articolo viene fornito un protocollo dettagliato per utilizzare correttamente il modello.

Introduzione

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Il cancro è una delle principali cause di morte nel mondo. Pertanto, vi è la richiesta di sviluppare modelli di malattia sperimentale affidabili per ottenere una migliore comprensione della malattia e per esplorare potenziali approcci terapeutici. Uno dei modelli sperimentali in vivo più comunemente utilizzati per studiare lo sviluppo del cancro della pelle è il modello di carcinogenesi cutanea a due stadi indotto chimicamente1,2. Il modello fornisce uno strumento per studiare l'inizio del tumore, la promozione e la progressione, oltre a eventi specifici come l'infiltrazione delle cellule immunitarie e l'angiogenesi.

Per utilizzare il modello di carcinogenesi cutanea a due stadi, la pelle posteriore dei topi viene trattata con due diverse sostanze chimiche che insieme inducono la formazione del tumore. Il modello viene avviato con una dose bassa del mutageno, DMBA, seguita da un'esposizione prolungata al promotore del tumore, TPA3 (Figura 1). DMBA muta il DNA in modo casuale formando addotti covalenti con il DNA delle cellule epidermiche e delle cellule staminali primarie cheratinociti4,5,6,7. Alcune di queste mutazioni casuali avvengono in un proto-oncogene, come Hras1 (vengono rilevate anche mutazioni in Kras e Nras) e la conversione dei proto-oncogeni in oncogeni guida la formazione del tumore sotto stimoli adeguati. TPA, a sua volta, è l'agente di promozione della crescita del tumore più comunemente usato. Il suo obiettivo molecolare è la chinasi proteica C (PKC)8. TPA attiva anche la segnalazione Wnt/z-catenin che è cruciale per la formazione del tumore nel modello9. L'esposizione ripetuta e prolungata all'agente promotore porta a una migliore segnalazione cellulare, a una maggiore produzione di fattori di crescita e a una reazione infiammatoria locale, che sono evidenti a causa di una maggiore sintesi del DNA e infiltrazione infiammatoria delle cellule nella pelle trattata.

I principali mediatori infiammatori nel modello DMBA-TPA sono stati identificati10. L'interleucina-17A (IL-17A) è noto per essere particolarmente cancerogeno nel modello DMBA-TPA11,12. Lavora in sinergia con l'interleuchino 6 (IL-6) e partecipa al reclutamento di macrofagi e neutrofi13,14. Inoltre, CD4- cellule T e neutrofili hanno dimostrato di essere cancerogeni nel modello DMBA-TPA. Infine, i macrofagi possono anche promuovere la tumorigenesi nel modello15,16,17.

Durante la fase di promozione, la proliferazione cellulare delle cellule mutate è migliorata e un'iperplasia sostenuta dell'epidermide viene mantenuta1. Questo porta allo sviluppo del papilloma nella pelle in 10-20 settimane, dopo di che i papillomi iniziano a convertirsi in tumori maligni, carcinomi a cellule squamose (SCC)2. Tuttavia, meno del 10% dei papillomi progredisce verso la malignità, anche se questa percentuale dipende anche dal background genetico dei topi2,18. Per decenni non si sapeva quale tipo di cellule fossero inizialmente mutate nei tumori che portavano alla malignità, anche se alcuni studi avevano riportato caratteristiche chiaramente distinte nei tumori maligni rispetto ai papillomi benigni19,20. Tuttavia, studi recenti hanno notevolmente aumentato la nostra comprensione sull'origine clonale della formazione del tumore nel modello DMBA-TPA21. 22. 23.È stato dimostrato che sia le cellule epiteliali derivate dal midollo osseo che le cellule staminali del follicolo pilifero contribuiscono alla formazione del tumore22. Studi di tracciamento del lignaggio specifico dello stadio hanno svelato che i papillomi benigni sono di origine monoclonale, ma reclutano nuove popolazioni di cellule epiteliali21,23. Tuttavia, solo uno dei cloni cellulari funziona come conducente della carcinogenesi; contiene una mutazione Hras23. La progressione verso la formazione di carcinoma è associata a uno sweep clonale23.

Il DMBA cancerogeno avvia la formazione del papilloma e il TPA promuove la crescita del tumore. Quindi, l'inizio del tumore può essere studiato separatamente dalla promozione interrompendo l'esperimento prima del periodo di trattamento TPA. Come la progressione del tumore è studiato settimanalmente offre una grande opportunità per l'analisi dettagliata della crescita del tumore in tutto lo studio. Poiché i tumori sono generati da sostanze chimiche esterne, una mutazione oncogenica nella linea germinale non è necessaria. Così, lo studio degli effetti di un background genetico (ad esempio, knockout/transgene vs tipo selvaggio) sulla tumorigenesi è semplice2. In sintesi, il modello di cancro della pelle DMBA/TPA è un approccio particolarmente utile per studiare il ruolo del sistema immunitario nella progressione tumorale, nonché per la valutazione delle fasi di avvio e promozione del tumore in modo indipendente o interdipendente.

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Figura 1: contorno del modello di carcinogenesi cutanea indotta da DMBA-TPA. La DMBA cancerogena è applicata topicamente per indurre mutazioni del DNA nella fase di avvio del modello. L'agente di promozione della crescita TPA viene somministrato 2volte a settimana per migliorare la proliferazione cellulare durante la fase di promozione, portando allo sviluppo di papillomi nella pelle. Gli animali vengono sacrificati dopo che la risposta al papilloma raggiunge un altopiano, di solito entro settimane 15-20, a seconda del background genetico dei topi. Una piccola parte dei papillomi può svilupparsi ulteriormente in CCN entro 20-50 settimane. Per studiare i primi eventi nella fase di avvio e promozione precoce, è possibile raccogliere campioni (ad esempio, poco dopo la seconda applicazione TPA). Una fotografia rappresentativa e ematossilina e eosina macchiato sezione trasversale di papillomi su una pelle di topo C57BL/6 dopo 19 settimane di trattamento sono mostrati. Barra di scala - 0,1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocollo

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Il protocollo qui descritto è stato approvato dal Comitato Nazionale Per l'Etica animale della Finlandia (numero di protocollo ESAVI/23659/2018).

1. Animali sperimentali, reagenti e attrezzature

  1. Usa l'età e i topi abbinati al sesso. Iniziare lo studio a 7-9 settimane di età, perché la pelle nella maggior parte dei topi è in telogen (la fase di riposo) intorno a quell'età2.
  2. Osservare il comportamento degli animali durante lo studio e se combattono, che spesso accade con i maschi, ospitarli separatamente. I combattimenti possono causare tagli nella pelle, che promuovono la formazione del tumore. I topi femminili sono preferiti a causa del loro comportamento meno aggressivo. La dimensione tipica del gruppo sperimentale varia tra 8-20 animali per gruppo24,25,26,27.
    NOTA: I calcoli di potenza basati sulla varianza biologica osservata negli studi precedenti aiutano a scegliere una dimensione di gruppo sufficientemente grande. I ceppi utilizzati come esempi in questo articolo includono Balb/c e C57BL/6. Tuttavia, molti altri ceppi di mouse come SENCAR e FVB sono stati utilizzati con il modello DMBA-TPA, così come i ratti Wistar e Sprague-Dawley2,28,29. Prima dell'inizio dello studio è necessaria una licenza del comitato nazionale o locale per il lavoro sugli animali. Oltre alle considerazioni generali sul benessere, gli endpoint specifici del modello sono in genere il carcinoma a cellule squamose (SCC) e un'infezione della pelle. Graffi nella pelle a causa di prurito dopo l'applicazione delle sostanze chimiche tumorigene in acetone è tipico, ma per il resto gli animali dovrebbero non mostrare segni di disagio. La pesatura regolare (ad esempio, 2 volte al mese) aiuta a valutare il benessere degli animali.
  3. Utilizzare il DMBA e il TPA, entrambi diluiti in acetone. La concentrazione di lavoro di DMBA è di 250 g/L. Una dose per un animale è di 50 g di DMBA in 200 -L di acetone. La concentrazione di magazzino di TPA è di 125 g/L e la concentrazione di trattamento 25 g/L. Una dose di TPA per un animale è di 5 g in 200 l di acetone.
    PRUDENTE: DMBA è dannoso se ingerito e può causare il cancro. L'acetone evapora rapidamente ed è infiammabile. Può causare vertigini e irritare gli occhi. Utilizzare una maschera di respirazione e/o lavorare sotto un flusso di vuoto. Cambiare i guanti dopo aver maneggiato una qualsiasi di queste sostanze chimiche. Le gabbie ventilate individualmente impediscono la diffusione delle sostanze chimiche durante l'alloggiamento dei topi. Dopo l'applicazione, raccogliere le punte pipette utilizzate per la gestione del DMBA e smaltire come rifiuti pericolosi.
    NOTA: Il DMBA deve essere protetto dalla luce. Il TPA diluito è immagazzinato in -20 gradi centigradi, preferibilmente protetto dalla luce.
  4. Procurare la seguente attrezzatura: una scala, un rasoio ordinario per la pelliccia, pipette e punte di dimensioni appropriate, un righello ordinario, una fotocamera digitale, un blocco note e una penna o un computer per la registrazione dei papillomi, un sistema di anestesia inalato o un restrainer per topi con un'apertura sul piano posteriore, e un sistema di narcosi di anidride carbonica per sacrificare i topi.

2. Skin Papilloma Induzione e promozione

  1. Rasare la pelle posteriore e pesare l'animale. Successivamente, radere la pelle quando necessario, ma non al momento dell'esposizione chimica.
    NOTA: Fare attenzione quando la rasatura intorno ai papillomi ed evitare di fare eventuali tagli sulla pelle. Pesare ogni animale ogni 2 settimane per notare qualsiasi potenziale perdita di peso.
  2. Applicare 50 g di DMBA in 200 -L di acetone topicamente sulla zona rasata utilizzando una pipetta 48 h dopo aver rasato la pelliccia. Se necessario, trattenere l'animale usando anestesia per inalazione leggera o un restrainer per topi.
  3. Dopo 7 giorni, dare la prima dose tPA. Applicare il 5o g di TPA in 200 -L topically con una pipetta 2 volte a settimana, preferibilmente lunedì e giovedì o martedì e venerdì.
  4. Conta, registra e fotografa i papillomi ogni settimana. Una massa palpabile di 1 mm di diametro è considerata un papilloma se rimane più lunga di 1 settimana. Segna ogni singolo papilloma su una mappa ed elenca le sue dimensioni ogni settimana. Memorizzare fotografie digitali.

3. Sacrificio animale e collezione di campioni

  1. Continuare il trattamento fino a quando la risposta del tumore raggiunge un altopiano. Generalmente, il carico di papilloma dovrebbe aumentare 10-20 settimane dopo l'avvio, a seconda del ceppo del topo utilizzato. L'altopiano è atteso tra 15-20 settimane. Una piccola parte dei papillomi (sotto il 3%) possono svilupparsi in CCN entro 20-50 settimane2.
  2. Sacrificare gli animali 24 h dopo l'ultima applicazione TPA. Utilizzare la narcosi di anidride carbonica con lussazione cervicale o un altro metodo adatto.
  3. A seconda della domanda di ricerca, raccogliere il materiale campione appropriato dagli animali30,31.
    1. Ad esempio, prelevare campioni di sangue prima di sacrificarsi e separare il plasma.
    2. Tagliare pezzi della pelle per la colorazione immunoistochimica (IHC) (ad esempio, ematossialina ed eosina, cellule proliferanti o infiammatorie).
    3. Utilizzare punzoni di biopsia per raccogliere pezzi di pelle con tessuto papilloma o pelle non papilloma (trattata) per l'espressione genica (ad esempio, qPCR) e/o analisi proteiche (ad esempio, macchia occidentale o ELISA).
    4. Raccogliere un pezzo dei linfonodi che drenano la milza e della pelle per l'analisi della citometria del flusso se si desidera un'analisi più dettagliata delle popolazioni di cellule immunitarie. È inoltre possibile separare gli strati epidermici e dermici per ulteriori analisi.

4. Statistiche

  1. Disegna una curva di sopravvivenza Kaplan-Meier del tempo senza papilloma e usa il test di rango di log Mantel-Cox per la sopravvivenza. Disegnare una curva lineare del numero di papillomi a settimana. Poiché si tratta di dati di conteggio, utilizzare un modello di regressione non lineare. Se necessario, consultare uno statistico.

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Risultati

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Il risultato principale è il tempo di sopravvivenza (cioè senza papilloma) tra i gruppi di trattamento o genotipi. Il risultato secondario è il numero di papillomi a settimana in ogni gruppo (Figura 2). I risultati attesi sono una differenza statisticamente significativa nel tempo libero del papilloma e nel numero di papillomi tra i gruppi sperimentali (due o più). Si raccomanda di contare il numero di papillomi e disegnare una curva durante la fase di promozione (TPA) per avere un'idea dell...

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Discussione

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Il cancro della pelle indotta da DMBA-TPA è uno dei modelli tumorali più comunemente usati perché è altamente riproducibile e fornisce informazioni sulla progressione del tumore dall'inizio alla malignità. La misura dei risultati chiave, la formazione del papilloma, è facilmente e in modo affidabile quantitativo. Il modello affronta sia l'inizio tumorale (sopravvivenza senza tumore) che la progressione (numeri e dimensioni del tumore) contemporaneamente. Il modello è adatto per studiare diversi composti, come potenziali ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato finanziato dall'Accademia di Finlandia (concede 25013080481 e 25013142041 (I.J.), 286377 e 295814 (M.P.), 287907 (T.J.)), P'ivikki e Sakari Sohlberg Foundation (M.P.), T.J.), Finnish Medical Foundation (T.P.), The Competitive State Research (Fondazione Medica Finlandese) (T.P.), The Competitive State Research (Fondazione Medica Finlandese) Finanziamento dell'Expert Responsibility Area of Tampere University Hospital (grant 9V049 e 9X044 (M.P.), 9X011 e 9V010 (T.J.), The Competitive State Research Financing of the Expert Responsibility Area of Fimlab Laboratories (Grant X51409 (I.J.)), Tays Fondazione di sostegno (I.J., M.P., T.J.), Tampere Tuberculosis Foundation (I.J., M.P., T.J.), la Fondazione Culturale Finlandese (M.V.), la Fondazione Paulo (T.P.), la Cancer Society of Finland (M.P.) e la Fondazione Emil Aalton (T.P.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1000 ul RPT XL Puntale Filtrante Graduato (Sterile), RicaricaStarlabS1182-1730-C
300 ul RTP Puntale Filtrante Graduato (sterile), RicaricaStarlabS1180-9710-C
7,12-Dimetilbenz[a]antracene (DMBA)SigmaD3254-100MGDannoso se ingerito e può causare il cancro. Conservare al riparo dalla luce.
AcetoneSigma1000141011Evapora rapidamente ed è infiammabile.
Attane vet 1000 mg/gPiramal Critical Care LimitedIsoflurano liquido per inalazione
Clipper a batteria IsisAlbert Kerlb GmbHGT421Per la rasatura della pelliccia
CONTRAfluran-RestgasfilterZeoSys GmbHPer anestesia
Linex Nature N1030 Righello 30 cmGraffe Business Advantage60383Per misurare i
papillomiCamera di CO2 media 300 x 200 x 200 mm - RedVetTech Solutions LtdAN045ARPer sacrificio
MekasoftMekalasi23008Copritavolo
Topi (Balb/c JRj)Janvier labsAltri ceppi possibili anche
Topi (C57BL/6JRj)Janvier labsAltri ceppi possibili anche
Panasonic Lumix DMC-FS5 Fotocamera digitalePanasonic
ParaformaldeideMerck30525-89-4Per campioni istologici
Phorbol 12-miristate 13-acetato aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetato (TPA)EnzoBML-PE160-0001
Bilancia di precisione PLJ-C/PLJ-GKERN & SOHN GmbHPLJ 600-3CM
di CO2 preimpostato-2 Camera-Alloggiamento in acciaio inoxVetTech Solutions LtdAN044BXPer il sacrificio
RNAlaterQiagen76104Per campioni di acido nucleico
Pipetta Tacta 100-1000 ulSartoriusLH-729070
Pipetta Tacta 20-200 ulSartoriusLH-729060
UNO Riempitivo per chiavi anestesiologicheStrumentazione Scintica inc.Per anestesia
Maschera facciale UNO perstrumentazione Mouse Scintica inc.Per anestesia
UNO FM2200 FlussimetroScintica instrumentation inc.Per anestesia
Unità di scarico gas UNOStrumentazione Scintica inc.Per anestesia
UNO Induction BoxScintica instrumentation inc.Per anestesia
UNO200VAP VaporizzatoreScintica instrumentation inc.Per anestesia
Sistema

Riferimenti

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