Articolo metodologico

Risonanza in tempo reale sulla bioluminescenza delle dinamiche di segnalazione di nota durante la neurogenesi di Murine

6.4K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/60455

⸱

12 dicembre 2019

 , 
1Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University, 2Institute for Integrated Cell-Material Sciences (iCeMS), Kyoto University, 3Kyoto University Graduate School of Medicine, 4Kyoto University Graduate School of Biostudies

In questo articolo

Sommario

Le cellule staminali neurali/progenitrici mostrano varie dinamiche di espressione dei componenti di segnalazione di Notch che portano a diversi risultati di eventi cellulari. Tale espressione dinamica può essere rivelata dal monitoraggio in tempo reale, non dall'analisi statica, utilizzando un sistema di imaging a bioluminescenza altamente sensibile che consente la visualizzazione di rapidi cambiamenti nelle espressioni geniche.

Abstract

La segnalazione di notch regola il mantenimento delle cellule staminali/progenitrici neurali mediante interazioni cellula-cellula. I componenti della segnalazione Notch presentano un'espressione dinamica. L'efere di segnalazione della nota Hes1 e il Delta-simile a 1 (Dll1) del ligando di Notch sono espressi in modo oscillatorio nelle cellule staminali/progenitrici neurali. Poiché il periodo dell'espressione oscillatoria di questi geni è molto breve (2 h), è difficile monitorarne l'espressione ciclica. Per esaminare tali rapidi cambiamenti nell'espressione genica o nella dinamica delle proteine, sono necessari giornalisti a risposta rapida. A causa della sua cinetica a maturazione rapida e dell'elevata sensibilità, il reporter di bioluminescenza luciferasi è adatto per monitorare i rapidi cambiamenti dell'espressione genica nelle cellule viventi. Abbiamo usato un giornalista di luciferasi destabilizzato per monitorare l'attività promotore e un reporter con luciferasi fuso per la visualizzazione delle dinamiche proteiche a risoluzione cellulare singola. Questi reporter di bioluminescenza mostrano un rapido turnover e generano segnali molto deboli; pertanto, abbiamo sviluppato un sistema di imaging a bioluminescenza altamente sensibile per rilevare tali deboli segnali. Questi metodi ci permettono di monitorare varie dinamiche di espressione genica nelle cellule viventi e nei tessuti, che sono informazioni importanti per aiutare a comprendere gli stati cellulari effettivi.

Introduzione

Il cervello dei mammiferi è composto da un gran numero di vari tipi di neuroni e cellule gliali. Tutte le cellule sono generate da cellule staminali neurali,progenitrici (NPC), che prima proliferano per espandere il loro numero, poi iniziano a differenziarsi in neuroni, e infine danno origine a cellule gliali1,2,3,4,5. Una volta che le cellule si sono differenziate in neuroni, non possono proliferare o aumentare il loro numero e, quindi, il mantenimento dei PNG fino a quando le fasi successive non sono importanti. La segnalazione della notch tramite interazioni cella-cellula svolge un ruolo importante nel mantenimento dei PNG6,7. I ligandi Notch interagiscono con la proteina della membrana, Notch, sulla superficie delle cellule vicine e attivano la proteina Notch. Dopo l'attivazione, si verifica la proteolisi della proteina Notch, rilasciando così il dominio intracellulare di Notch (NICD) dalla membrana cellulare nel nucleo8,9,10. Nel nucleo, NICD si lega alle regioni promotrice di Hes1 e Hes5 (Hes1/5) e attiva l'espressione di questi geni. Hes1/5 reprime reprime reprimere l'espressione dei geni proneurali Ascl1 e Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Poiché i geni proneurali inducono la differenziazione neuronale, Hes1/5 svolge un ruolo essenziale nel mantenimento dei PNG. Inoltre, poiché i geni proneurali possono attivare l'espressione del Delta-come1 (Dll1), Hes1/5 reprimere anche l'espressione di Dll1. Pertanto, l'espressione di Dll1 porta alle celle adiacenti essere negativo per Dll1 tramite segnalazione Notch. In questo modo, le cellule impediscono alle cellule adiacenti di seguire il loro stesso destino, un fenomeno noto come inibizione laterale8. Nel cervello in via di sviluppo, l'inibizione laterale svolge un ruolo nella generazione di vari tipi di cellule diverse.

L'imaging in tempo reale a livello di singola cellula rivela le espressioni dinamiche dei componenti della segnalazione di Notch nei PNG15,16,17. La segnalazione di notch attiva l'espressione di Hes1, ma la proteina Hes1 si lega al proprio promotore e reprime la propria espressione. Inoltre, Hes1 è una proteina estremamente instabile, che è degradata dal percorso onniquitina-proteasome; pertanto, la repressione del proprio promotore è solo di breve durata e poi la trascrizione ricomincia. In questo modo, l'espressione di Hes1 oscilla sia a livello di trascrizione che a livello traslazionale in un ciclo di 2 h18. L'espressione oscillatoria di Hes1, a sua volta, induce l'espressione oscillatoria dei geni bersaglio a valle, come Ascl1, Neurog2 e Dll1, attraverso la repressione periodica15,16,17,19. Mentre i geni proneurali possono indurre la differenziazione neuronale, la loro espressione oscillatoria non è sufficiente per la differenziazione neuronale; piuttosto la loro espressione sostenuta è essenziale per la differenziazione neuronale. L'espressione oscillatoria dei geni proneurali è importante per mantenere i PNG piuttosto che per indurre la differenziazione neuronale14,15,16. L'espressione di Dll1 oscilla sia a livello di trascrizione che a livello traslazionale durante varie morfogenesi, come la neurogenesi e la somitogenesi. L'espressione dinamica di Dll1 è importante per la normale morfogenesi e l'espressione costante di Dll1 induce difetti nella neurogenesi e somitogenesi17. Questi risultati dimostrano l'importante funzione che la dinamica dell'espressione genica e della cinetica proteica ha sulla regolazione di vari eventi dello sviluppo (cioè, dinamiche di espressione diverse producono risultati diversi nei comportamenti cellulari).

Per analizzare la dinamica della segnalazione di Notch, l'analisi statica dei tessuti e delle cellule è insufficiente perché cambia in continua evoluzione. L'imaging in tempo reale di singole cellule è un potente strumento per rivelare le dinamiche nell'espressione genica. L'espressione dinamica delle molecole di segnalazione Notch subisce risposte cicliche rapide nel periodo di 2-3 h. Questa rapida espressione periodica presenta due problemi difficili per il monitoraggio in tempo reale: (1) l'espressione delle molecole viene soppressa a bassi livelli e (2) un rapido turnover richiede una risposta rapida ai giornalisti. Per superare questi problemi, abbiamo precedentemente sviluppato un metodo di imaging in tempo reale di bioluminescenza20. Poiché il reporter di bioluminescenza ha una sensibilità più elevata e tempi di maturazione più brevi rispetto ai reporter fluorescenti, questa strategia ci permette di monitorare le dinamiche rapide nelle cellule viventi. Utilizzando la visualizzazione in tempo reale, abbiamo scoperto che più geni mostravano un'espressione dinamica di quanto pensassimo in precedenza. Inoltre, è aumentato il numero di rapporti che mostrano l'espressione e la dinamica delle proteine nelle cellule viventi e il significato di queste dinamiche in vari eventi biologici, suggerendo un ruolo fondamentale delle dinamiche nelle espressioni geniche21,22.

In questo rapporto viene descritto un modo per visualizzare l'espressione della Dll1 del ligando di Notch nei PNG sia nelle colture dissociate che nelle colture di taglio corticali. Per monitorare la dinamica della trascrizione Dll1 a livello di singola cellula, abbiamo generato colture dissociate di PNG derivate dal telencefano embrionale di topi transgenici che trasportano pDll1-Ub-Fluc reporter, un giornalista di luciferasi destabilizzate destabilizzato guidato dal promotore di Dll1. Per monitorare le dinamiche delle proteine Dll1 in vivo, abbiamo introdotto il reporter di fusione Dll1-Fluc nei PNG nella corteccia e abbiamo visualizzato l'espressione del reporter nei PNG nelle colture di fette corticali. L'imaging in tempo reale ci ha permesso di catturare le varie caratteristiche dell'espressione genica e della dinamica delle proteine nelle cellule viventi ad alta risoluzione temporale.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Tutte le procedure, compresi i soggetti animali, sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali istituzionali presso l'Istituto per la vita di frontiera e le scienze mediche dell'Università di Kyoto.

1. Giornalisti di bioluminescenza

NOTA: Il reporter luciferate è adatto per misurare la rapida dinamica dell'attività promotrice fondendo il segnale di degradazione. Inoltre, il reporter di fusione luciferasi consente il monitoraggio delle dinamiche proteiche nella singola cellula. Entrambi i tipi di reporter sono disponibili per l'esperimento di coltura monostrato (cultura della dissociazione) e di coltura dei tessuti (cultura delle fette).

  1. Reporter per il monitoraggio dell'attività promotore Dll117
    NOTA: Per monitorare i rapidi cambiamenti nell'espressione genica, è essenziale la risposta rapida e il reporter instabile. Firefly luciferase (Fluc) mostra una rapida maturazione rispetto ai reporter fluorescein. Poiché l'ubiquitina fusa giornalista lucidferasi (Ub-Fluc) mostra una rapida degradazione e un rapido turnover, è molto utile monitorare l'espressione genica dinamica nelle cellule viventi20.
    1. Utilizzare Dll1 promoter-driver-driver destabilizzato lucidferasi reporter, luciferasi ubiquitanated (pDll1-Ub-Fluc, Figura 1Un pannello superiore), per monitorare le rapide modifiche nell'espressione Dll1 a livello di trascrizione17.
    2. Generare una linea di mouse transgenica che trasporta pDll1-Ub-Fluc per l'espressione stabile di questo reporter.
  2. Reporter per il monitoraggio delle dinamiche proteiche Dll117.
    1. Per la generazione di topi knock-in, inserire la luciferate cDNA nel 3 - termini della regione di codifica Dll1 in modo che si eslentrasse la proteina di fusione Dll1-luciferate (dll1-Fluc reporter, Figura 1A, pannello inferiore)17.
    2. Monitorare la dinamica di espressione di Dll1 a livello proteico misurando l'attività di luciferasi.
    3. Per monitorare la dinamica delle proteine Dll1 a livello tissutale, introdurre il reporter Dll1-Fluc nei PNG nel telencephalon embrionale per elettroporazione in utero.

2. Sistema di imaging a bioluminescenza

  1. Costruisci un sistema di imaging live a bioluminescenza utilizzando un microscopio invertito installato con una telecamera CCD altamente sensibilia e raffreddata ad acqua. Al fine di ridurre il rumore e ottenere un'elevata sensibilità, raffreddare la fotocamera con acqua refrigerata fornita dal circolatore d'acqua ad una temperatura ottimizzata di -90 gradi centigradi.
  2. Per l'imaging delle cellule vive/tessuto, installare il sistema di incubazione, controllando la temperatura e il gas misto, allo stadio del microscopio.
  3. Per immaginare l'espressione di una giornalista lucidferasi destabilizzata, utilizzare un angolo numerico elevato (NA: 1.30) 40x lente di immersione dell'olio. La distanza di lavoro di questa lente è di 0,2 mm, è disponibile non solo per la coltura cellulare a strato monostrato, ma anche per la coltura delle fette.
  4. Per il doppio monitoraggio dell'espressione della lucidferasi e della fluoresceina, installare il dispositivo di illuminazione a LED nel percorso luminoso del microscopio.
  5. Controllare l'imaging time-lapse con un software associato al microscopio (ad esempio, programma di acquisizione multidimensionale del software MetaMorph).
  6. Preparare l'intero sistema in una stanza buia, perché il segnale del reporter luciferasi destabilizzato è molto debole, e per evitare la luce estranea impedire l'acquisizione.

3. Colture di dissociazione NPC (Neural Stem/Progenitor Cell)

  1. Preparazione dei mezzi di coltura, piatti e reagenti per la cultura della dissociazione NPC
    1. Preparare i supporti N2/B27 per la coltura di cellule staminali/progenitrici neurali con una concentrazione finale di 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acetylcysteine, 10 ng/mL bFGF e 50 U/mL Penicillina/Streptomicina nei media DMEM/F12.
    2. Preparare la soluzione papaina per la dissociazione contenente 7 papaina U/mL, 0.006% DNase e 1 mM N-acetylcysteine nei media EBSS.
    3. Preparare 100 mM di soluzione di sodio luciferina per l'imaging a luminescenza. Diluire la soluzione luciferina di 100 mM nei supporti N2/B27 ad una concentrazione finale di 1 mM.
      NOTA: Luciferin mostra auto-fluoresceina stessa. Nel caso della luciferasi-fluorescenza doppia imaging, in particolare EGFP, abbassare la concentrazione di luciferina a 0,5 mM è meglio.
    4. Rivestire una soluzione di fondo in vetro da 35 mm (diametro di vetro di 27 mm) con una soluzione poli-L-lysine (PLL) di 40 g/mL di poli-L-lysine (PLL) per 1 h a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare le piastre 3x con PBS e lasciarlo asciugare.
  2. Dissezione degli embrioni e dissociazione dei PNG
    1. Dopo l'eutanasia di un topo transgenico incinta pDll1-Ub-luc (giorno embrionale 12.5 (E12.5)) da CO2 asfissia e dislocazione cervicale, tagliare l'addome ed estrarre l'utero.
      NOTA: I ricercatori devono seguire i regolamenti e le linee guida del comitato per la ricerca sugli animali della loro istituzione. Se vengono utilizzati farmaci per l'anestesia o il sollievo dal dolore, usali correttamente.
    2. Trasferire l'utero in una teglia Petri di 10 cm contenente 25 mL di PBS ghiacciato. Estrarre gli embrioni dall'utero in PBS ghiacciato, utilizzando micro forbici e pinze sottili.
    3. Tagliare la testa di ogni embrione con le forbici e trasferirla a 10 cm piatti Petri contenenti dMEM/F12 ghiacciati. Rimuovere l'epidermide e la cartilagine che circonda il cervello e trasferire il cervello a 35 mm piatto Petri contenente ghiacciato 3 mL di n2/B27 media.
    4. Tagliare il telecefalo destro e sinistro dal diencefalo(Figura 1Ba-f, C,D). Rimuovere le meningi che coprono la superficie del telencephalon con pinze sottili (Figura 1Bi). Utilizzando di nuovo le doci sottili, estrarre la parte dorso-laterale della corteccia dal telencephalon (Figura 1Bg,h,j-l E).
    5. Trasferire i tessuti su nuovi tubi da 1,5 mL utilizzando una pipetta P1000 e rimuovere qualsiasi mezzo supplementare con una pipetta P200. Aggiungere 0,1 mL di soluzione papaina per tessuto cerebrale (una coppia della corteccia). Dopo 15 minuti di incubazione a 24 gradi centigradi, pipette pipette i campioni 10 volte con P1000 pipetta. Incubare nuovamente i campioni per 15 min a 24 gradi centigradi.
    6. Pipette delicatamente i campioni 10 volte con pipetta P1000. Centrifugare i campioni per 3 min a 400 x g e temperatura ambiente (RT). Scartare il super-attardato.
    7. Aggiungere 1 mL di supporto DMEM/F12 al pellet. Delicatamente pipetta 10 volte con p1000 pipetta. Centrifugare i campioni per 3 min a 400 x g e RT. Scartare il supernatante. Ripetere questa operazione almeno altre due volte.
    8. Al pellet, aggiungere 0,5 mL di supporti N2/B27 contenenti 1 m di luciferina e mescolare bene. Semina le celle (1 x 106 celle) a un piatto inferiore in vetro rivestito di PLL. Coltura le cellule nell'incubatrice di CO2 per 1 h. Una volta che le cellule aderiscono al piatto, aggiungere 2 mL di supporti N2/B27, contenenti 1 mM luciferina.
  3. Visualizzazione dell'espressione di reporter luciferasi nella cultura della dissociazione NPC
    1. Avviare il sistema di imaging live della luminescenza prima di eseguire la dissezione. Per la coltura NPC, impostare la temperatura dell'incubatore palco a 37 gradi centigradi e impostare l'impostazione della miscela di gas 20% O2, 5% CO2.
    2. Mettere l'olio di immersione alla lente obiettivo. Posizionare il piatto campione sullo stadio del microscopio. Visualizzare il campo manualmente e scegliere la posizione migliore e il focus delle celle di interesse. Fare clic su Live per acquisire l'immagine di prova.
    3. Eseguire l'acquisizione time-lapse mediante acquisizioni bidimensionali (luminescenza e campo luminoso) per 24 h con il programma Multi-Dimensional Acquisition. Scegliere il programma di acquisizione multidimensionale e impostare l'impostazione di acquisizione come segue (passaggio 3.3.6).
    4. Per l'acquisizione dell'immagine della luminescenza, utilizzare le seguenti impostazioni della fotocamera: bassa velocità di trasferimento (50 kHz), 2 x 2/4 x 4 binning, 10 min/5 min tempo di esposizione. Per l'acquisizione di immagini da campo luminoso, utilizzare le seguenti impostazioni: velocità di trasferimento intermedio (1 MHz), 1 x 1 binning e 100 ms tempo di esposizione.

4. Elettroporazione in utero

NOTA: Questa operazione viene eseguita per l'introduzione del reporter Dll1-Fluc nelle cellule progenitrici neurali.

  1. Preparazione di utensili e reagenti per l'elettroporazione
    1. Preparare i micro capillari per l'iniezione di DNA nel ventricolo del telencephalon embrionale. Allungare un'erba capillare con calore e tagliare e lucidare la punta di esso con la lucidatrice.
    2. Preparare una miscela di DNA con colorante (ad esempio, blu Trypan). La concentrazione di ogni DNA è di 1 g/L in PBS e aggiungere il tinrito ad una concentrazione finale del 10%.
      NOTA: Utilizzare la miscela di DNA per la visualizzazione delle dinamiche proteiche Dll1 come segue: Dll1-Fluc (Dll1 proteina reporter, Figura 2E superiore) e pEF-EGFP (EF promoter guidato vettore di espressione EGFP, Figura 2E inferiore), monitoraggio della posizione e morfologia delle cellule trafette.
    3. Preparare due tipi di anestetici: 3,88 mg/mL di pentobarbital e 0,12% di xilazina, in pbS 1x sterile.
    4. Utilizzare gli strumenti sterili e guanti chirurgici durante il funzionamento.
  2. Elettroporazione in utero
    1. Anestetizzare un volta topo ICR incinta (E12.5) dalla somministrazione intraperita di anestetici con 500 - L di 3,88 mg/mL pentobarbital e 5000L di 0.12% xylazine.
      NOTA: I ricercatori devono seguire la regolazione degli esperimenti sugli animali. Se si ha bisogno di usare l'anestesia o farmaci antidolorifici, usarli correttamente.
    2. Tagliare i capelli e disinfettare la pelle con scrub chirurgici.
    3. Verificare la mancanza di risposta pizzicato dell'alto. Una volta che il riflesso del pedale non viene osservato, fare un 2-3 cm tagliare attraverso l'addome lungo la linea mediana. Mettere garze intorno alla parte sezionata e umido le garze con PBS caldo non asciugare l'incisione. Estrarre delicatamente il corno uterino destro con pinze a forma di anello e contare il numero di embrioni.
    4. Iniettare 1-2 l del DNA misto nel ventricolo del telecefalo degli embrioni delicatamente con micro capillare.
      NOTA: Quando l'iniezione ha esito positivo, si può vedere il colore blu del colorante sulla superficie dell'utero.
    5. Sorsrare l'utero e l'elettrodo prima di fornire gli impulsi di tensione, quindi tenere delicatamente la testa di un embrione. Impostare l'elettrodo caricato positivamente sul lato dell'emisfero, in cui è stato iniettato il DNA. Assicurarsi che la condizione dell'impulso di elettroporazione sia 30-50 V per 50 ms, l'intervallo degli impulsi è 1 s (50 ms di carica e 950 ms non carica). Fornire 5 impulsi a un embrione e verificare che le bolle vengano generate dall'elettrodo caricato negativamente.
      NOTA: Assicurarsi che la direzione dell'elettrodo: il DNA è incorporato nelle cellule sul lato dell'elettrodo positivo. Durante questa procedura, non spostare la posizione dell'elettrodo.
    6. Ripetere i passi 4.2.3-4.2.4 per altri embrioni e restituire il corno uterino alla cavità addominale. Eseguire la stessa procedura per gli embrioni nel corno uterino sinistro.
    7. Dopo aver rimesso il lato sinistro, suturare l'incisione da una sutura di seta (4-0) con un ago (17 mm). Prima di chiudere completamente l'incisione, mettere PBS caldo nella cavità addominale
      NOTA: l'intervallo tra le suture è di circa 2 mm.
    8. Dopo aver terminato l'intervento chirurgico, posizionare il mouse su una piastra di riscaldamento per il recupero post anestesia. Casa il mouse individualmente.
      NOTA: I ricercatori devono seguire la regolazione istiutola locale degli esperimenti sugli animali. Se si ha bisogno di usare farmaci antidolorifici, usarli correttamente.

5. Preparazione delle colture di fette della corteccia in via di sviluppo e visualizzazione dell'espressione del reporter luciferate nelle fette corticali

  1. Preparazione dei mezzi di coltura e reagenti per le colture di fette della corteccia
    1. Preparare supporti arricchiti per la coltura di fette corticali contenenti il 5% di siero bovino fetale e il 5% di siero di cavallo nei supporti N2/B27.
    2. Bolla 100% O2 gas attraverso i supporti DMEM/F12 per la dissezione e fare fette corticali.
      NOTA: Per utilizzare il gas di ossigeno in modo sicuro, conservare il cilindro O2 nell'armadio del cilindro e monitorare la concentrazione di ossigeno nell'aria mediante un misuratore di concentrazione di ossigeno.
    3. Diluire 100 mM di soluzione di sodio luciferina nei media arricchiti ad una concentrazione finale di 1 mM.
      NOTA: Luciferin mostra auto-fluoresceina stessa. Nel caso della luciferasi-fluorescenza doppia imaging, in particolare EGFP, minore concentrazione di luciferina (0,5 mM) è meglio.
    4. Impostare l'incubatore multi-gas a 37 gradi centigradi del 40% O2 e 5% di CO2.
  2. Dissezione degli embrioni ed esame dell'espressione del reporter fluorescente
    1. Dopo l'eutanasia del topo incinta a cui i reporter (E13.5) vengono introdotti per elettroporazione in utero (passaggio 4.2), tagliare l'addome ed estrarre l'utero.
      NOTA: I ricercatori devono seguire la regolazione degli esperimenti sugli animali. Se si utilizzano anestesia o farmaci antidolorifici, usarli correttamente.
    2. Trasferire l'utero in una teglia Petri di 10 cm contenente PBS. Estrarre gli embrioni dall'utero in PBS, utilizzando micro forbici e pinze sottili. Tagliare la testa di ogni embrione e trasferirla in una teglia Petri di 10 cm contenente supporti DMEM/F12 bollita con 100% O2 gas. Rimuovere l'epidermide e la cartilagine che circonda il cervello in supporti DMEM/F12.
    3. Posizionare il cervello sul coperchio del piatto Petri con pinze a forma di anello e impostare il coperchio sullo stadio del microscopio stereoscopico a fluorescenza. Controllare la regione della corteccia esprimendo proteine fluorescenti sotto la luce di eccitazione (Figura 2A,B).
    4. Trasferire il cervello in un tagliere in gomma siliconica riempito con 30 mL di supporti DMEM/F12 bollato con 100% O2 gas. Rimuovere le meningi che coprono la superficie del telencephalon con pinze sottili.
    5. Tagliare il confine tra la parte mediale e laterale del telencephalon dorsale e separarlo in due emisferi utilizzando coltello micro chirurgico o pinze fini. Utilizzando un coltello micro chirurgico, tagliare la corteccia come strisce e fare fette corticali (Figura 2C,D). Affettacone pipette con mezzo utilizzando pipetta e trasferite su supporti arricchiti in un piatto da 35 mm.
    6. Mettere le fette sugli inserti di coltura nei piatti di fondo di vetro con supporti arricchiti. Correggere la direzione delle sezioni utilizzando pinze fini. Impostare la superficie di taglio delle sezioni sulla superficie dell'inserto di coltura. Rimuovere il supporto supplementare da una pipetta. Incubare le fette in incubatrici multigas impostate da 40% O2 e 5% di CO2 a 37 gradi centigradi per 30 min.
    7. Aggiungere 300 l di supporti arricchiti contenenti 1 mM luciferina all'esterno della coltura inserto nel piatto inferiore di vetro.
  3. Visualizzazione dell'espressione del reporter luciferate nelle colture di sezioni
    1. Avviare il sistema di imaging live della luminescenza prima di iniziare la dissezione. Utilizzare la seguente condizione di colture di fette corticali: 40% O2, 5% CO2 e 37 gradi centigradi.
    2. Mettere l'olio di immersione a lente obiettivo 40x. Mettere il piatto campione allo stadio del microscopio. Acquisire l'immagine di prova di fluorescente e impostare la posizione e il piano di messa a fuoco per la regione di interesse sotto l'illuminazione della luce di eccitazione.
    3. Eseguire l'acquisizione time-lapse mediante acquisizioni di 3-dimentional (luminescenza, fluorescenza e campo luminoso) per 24 h (Figura 2F-H). Per l'acquisizione dell'immagine della luminescenza, utilizzare le seguenti impostazioni della fotocamera: bassa velocità di trasferimento (50 kHz), 2x2/4x4 binning, 10 min/5 min tempo di esposizione. Per la fluorescenza e l'acquisizione di immagini da campo luminose, utilizzare le seguenti impostazioni: velocità di trasferimento intermedio (1 MHz), 1x1 binning e 100 ms di tempo di esposizione.

6. Elaborazione e analisi delle immagini

  1. Collegare ogni immagine e creare le immagini pila. Fate clic su Importa sequenza di immagini (File) Proprietà Import . Sequenza immagine) e scegliere la cartella in cui vengono salvate le immagini acquisite. Inserire alcune parole contenute nel nome del file nella colonna di File name contiene.
  2. Per rimuovere il rumore del raggio cosmico sulle immagini della bioluminescenza, applicate il plug-in Filtro SpikeNoise di ImageJ/Fiji. Aprire le immagini della pila e fare clic su Filtro SpikeNoise.
  3. Applicare savitzky Golay Temporale Filter plug-in per ottenere una chiara dinamica di espressione reporter. Aprire le immagini della pila e fare clic su Filtro temporale di Savitzky Golay.
  4. Per misurare l'intensità dell'espressione del reporter, applicare il plug-in Axis Profile Plus a ogni singola cella. Selezionare le celle e impostare i ROI, l'area di interesse e fare clic su Profilo asse Plus.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Le espressioni dei geni Hes1/7 presentano un ciclo di oscillazione di 2 h in varie linee cellulari e durante la somitogenesi. Inoltre, il periodo di oscillazione è molto breve e sia i loro mRNA che le proteine sono estremamente instabili con le emivite di circa 20 min. Se si utilizza un reporter a risposta lenta, non possiamo tracciare una dinamica così rapida, e se si usa un reporter stabile, si accumula gradualmente mentre l'espressione genica oscilla. Pertanto, il giornalista deve essere rapidamente degradato...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

I componenti della segnalazione di Notch mostrano espressioni oscillatorie in sincronia durante la somitogenesi ma fuori sincronia durante la neurogenesi, portando alle difficoltà nel catturare la dinamica dell'espressione mediante analisi statica in quest'ultimo caso. Pertanto, il monitoraggio in tempo reale è necessario per rivelare la dinamica di espressione dei componenti di segnalazione Notch, ad esempio Hes1 e Dll1. Poiché i periodi delle espressioni delle oscillazioni Hes1 e Dll1

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno interessi finanziari contrastanti.

Ringraziamenti

Ringraziamo Yumiko Iwamoto per aver sostenuto la produzione del video. Siamo anche grati ad Akihiro Isomura per la discussione e il supporto dell'analisi delle immagini, Hitoshi Miyachi per il supporto tecnico per la generazione di animali transgenici, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu ( Olympus Medical Science) e Ouin Kunitaki (Andor Japan) per il supporto tecnico e le discussioni del sistema di imaging di bioluminescenza. Questo lavoro è stato supportato da Core Research for Evolutional Science and Technology (JPMJCR12W2) (R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (MEXT 24116705 for H.S. and MEXT 16H06480 for R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research (CPS) (JSPS) 18K06254) (H.S.), Takeda Foundation (R.K. e H.S.) e Piattaforma per gli approcci dinamici al sistema vivente del Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia, Giappone.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Bioluminescence Imaging System
Circolatore d'acqua refrigerata (chiller)JulaboModello: F12-ED
Telecamera CCD raffreddataAndor TechnologyModello: iKon-M 934
Sistema di incubazioneTOKAI HITModello: INU-ONICS
Microscopio invertitoOlympusModello: IX81
Microscopio invertitoOlympusModello: IX83
Dispositivo di illuminazione a LEDCoolLEDModello: pE1
MetaMorphDISPOSITIVI MOLECOLARIModello: 40000
Regolatore di gasTokkenModello: TK-MIGM OLO2
ObiettivoOlympusModello: UPLFLN 40X O
Preparazioni per la dissezione
Microscopio per dissezioneNikonModello: SMZ-2B
Microscopio stereoscopico a fluorescenzaLeicaModello: MZ16FA
Pinza fineDUMONTINOX No.5
Forbici, Micro forbici
Forcipe
Pinza
Greinerpiastra di Petri in plastica da 10 cm664160-013
Greinercon piastra di Petri in plastica da 35 mm627160
PBSNacalai Tesque14249-24
DMEM/F12invitrogen11039-021
Reagenti per NPC coltura di dissociazione
B27 integratoreinvitrogen12587-010
bFGFinvitrogen13256-029Soluzione madre: 1 μ g/ml in 0,1% BSA/PBS
D-luciferinaNacalai Tesque01493-85Soluzione madre: 100mM in soluzione salina allo 0,9%
DNaseWorthington Biochemical CorporationLK003172Soluzione madre: 1000U/ml in EBSS
EBSSWorthington Biochemical CorporationLK003188
Piatto con fondo in vetroIWAKI3910-035
N2 integratore (100x)invitrogen17502-048
N-acetil-cisteinaSigmaA-9165-25G
PapainWorthington Biochemical CorporationLK003178Soluzione madre: 7U/ml in EBSS
Penicillina/StreptmicinaNacalai Tesque09367-34
Poli-L-lisinaSigmaP-628140 mg/ml in DW
Preparati per elettroporazione in utero
siringa da 50 mlTERUMO181228T Elettrodo
Neppagene7 mm
ElettroporatoreNeppageneCUY21 EDIT
Pinze
GarzeKawamoto co.7161
Micro capillareRealizzato internamente
PBSNacalai Tesque14249-24
PentbarbitalKyoritsuseiyakuSomnopentyl
Forbice
, Micro forbici
Ago da suturaAkiyama MEDICAL MFG. COF17-40B2
XilazinaBayerSeractal
Preparazioni per coltura a fette
10 cm piastra di Petri in plasticagreiner664160-013
Greinerin plastica per piastre di Petri da 35 mm627160
Inserto di colturaMilliporePICM01250
DMEM/F12invitrogen11039-021
Siero fetale bovinoSigma172012-500ML
Pinze finiDUMONTINOX No.5
Pinze
Siero di cavalloGibco16050-122
Micro coltello chirurgicoAlcon19 Gauge V-Lance
Incubatrice multigasPanasonicMCO-5MUV-PJ
N2/B27 mediaRealizzato internamenteref. Coltura dissociativa NPC
PBSNacalai Tesque14249-24
Pinza
Forbici, Micro forbici
Tagliere in gomma siliconicaRealizzato internamente
a forma di anello cona forma di anelload anello

Riferimenti

  1. Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
  2. Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Paridaen, J. T., Huttner, W. B. Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system. EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).
  5. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  6. Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. Notch signaling in vertebrate neural development. Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).
  7. Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks. Neuron. 69, 840-855 (2011).
  8. Bray, S. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
  9. Bray, S. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).
  10. Kopan, R., Ilagan, M. X. G. The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism. Cell. 137, 216-233 (2009).
  11. Ishibashi, M., et al. Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system. The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).
  12. Ohtsuka, T., et al. Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation. The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).
  13. Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain. Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).
  14. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis. Development. 134, 1243-1251 (2007).
  15. Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors. Neuron. 58, 52-64 (2008).
  16. Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
  17. Shimojo, H., et al. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes and Development. 30, 102-116 (2016).
  18. Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
  19. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition. Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).
  20. Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).
  21. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342, 1193-1200 (2013).
  22. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152, 945-956 (2013).
  23. Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice. Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).
  24. Yamaguchi, S., et al. Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
  25. Kiyohara, Y. B., et al. The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).
  26. Behar, M., Hoffmann, A. Understanding the temporal codes of intra-cellular signals. Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).
  27. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic Gene Expression in a Single Cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
  28. Nelson, D. E., et al. Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression. Science. 306, 704-708 (2004).
  29. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
  30. Hansen, A. S., O'Shea, E. K. Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression. Molecular Systems Biology. 9, 704(2014).
  31. Hansen, A. S., O'Shea, E. K. cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale. Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).
  32. Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo. Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).
  33. Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: Progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
  34. Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay. Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).
  35. Nakajima, Y., et al. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, (2010).
  36. Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12, (2013).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Cellule staminali neuralielettroporazione in uteroreporter della luciferasidinamica proteicamonitoraggio dell espressione genicaimaging di cellule vivecoltura di sezioni corticalirisoluzione a singola cellula

Articoli correlati