Articolo metodologico

Un test di tubercolosi a carico batterico molecolare (TB-MBLA)

DOI:

10.3791/60460

⸱

30 aprile 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Infection and Global Health, School of Medicine, University of St Andrews, 2National Institute for Medical Research (NIMR)-Mbeya Medical Research Centre, 3Instituto Nacional de Saúde (INS), Ministério da Saúde, 4Institute of Biodiversity, Animal Health & Comparative Medicine, College of Medical, Veterinary & Life Sciences, University of Glasgow

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo un test di analisi del carico batterico molecolare della tubercolosi eseguito dopo l'inattivazione termica dell'espettorato. L'inattivazione del calore rende non infettivi i campioni di sputum e ovvia la necessità di laboratori di livello di contenimento 3 per i test molecolari della tubercolosi.

Abstract

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La tubercolosi è causata dalla mitologia Mycobacterium (Mtb), un agente patogeno classificato dalle Nazioni Unite (ONU) come una sostanza biologica pericolosa di categoria B. Per motivi di sicurezza dei lavoratori, la movimentazione di tutti i campioni che si presume portino Mtb deve essere effettuata in un laboratorio a livello di contenimento (CL) 3. Il test TB Molecular bacterial load assay (TB-MBLA) è un test inverso di reazione a catena quantitativa polimerasi (RT-qPCR) che quantifica il carico battericolare Mtb utilizzando primer e sonde a doppia etichetta per 16S rRNA. Descriviamo l'uso dell'inattivazione termica per rendere i campioni di TB non infettivi preservando l'RNA per il TB-MBLA. Una aliquota di 1 mL del campione di espettorato in tubi di centrifuga da 15 mL ben chiusi viene bollita per 20 minuti a 80 , 85 o 95 gradi centigradi per inattivare i bacilli Mtb. La coltivazione del calore inattivato e il controllo (vivi) dei campioni per 42 giorni hanno confermato la morte della TB. Il campione inattivato viene quindi riempito con 100 l del controllo di estrazione e l'RNA viene estratto seguendo la procedura standard di isolamento dell'RNA. Non è stata osservata alcuna crescita nelle colture di campioni trattati con calore. L'RNA isolato è sottoposto a RT-qPCR in tempo reale, che amplifica un bersaglio specifico nel gene RRNA Mtb 16S, producendo risultati sotto forma di cicli di quantificazione (Cq). Una curva standard viene utilizzata per tradurre Cq in carico batterico, o unità formanti colonie stimate per mL (eCFU/mL). C'è una relazione inversa tra Cq e il carico batterico di un campione. La limitazione è che la disattivazione del calore lisce alcune cellule, esponendo l'RNA a RNaes che causano una perdita di <1 log10eCFU/mL (vale a dire, <10 CFU/mL). Ulteriori studi determineranno la percentuale di pazienti a basso carico di lavoro che causano falsi risultati negativi a causa dell'inattivazione di calore.

Introduzione

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Causato da Mycobacterium tuberculosis (Mtb), oltre 7 x 106 nuovi casi di tubercolosi (TB) sono segnalati a livello globale di cui oltre 1 x 106 muoiono all'anno1,2. Per invertire la tendenza, l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha lanciato un approccio a tre pilastri, tra cui lo sviluppo di efficaci strumenti diagnostici e terapeutici3. Classificata come una pericolosa sostanza biologica B dall'ONU, lavorare con campioni presunti positivi per Mtb richiede un livello di contenimento (CL) di 3. I laboratori CL3 sono costosi da costruire e mantenere. Di conseguenza, la maggior parte dei paesi dispone di servizi di cultura della TB centralizzati a livello regionale o nazionale. Ciò significa che la microscopia striscio è lo strumento diagnostico più disponibile nelle strutture sanitarie periferiche.

L'OMS ha approvato l'attuazione di test molecolari rapidi come Xpert MTB/RIF alle strutture sanitarie di livello 4, per lo più situate ai livelli distrettuali4,5. Alcuni distretti sono piuttosto grandi e meno accessibili ad alcune persone. Pur è vantaggioso, Xpert MTB/RIF funziona rilevando il DNA Mtb. Il DNA è una molecola stabile che sopravvive a lungo dopo la morte delle cellule e quindi non è un buon standard per misurare le cellule vitali critiche per monitorare la risposta al trattamento5,6. I saggi basati sull'RNA offrono un'alternativa per la misurazione accurata delle cellule vitali7,8,9,10,11,12,13. L'RNA esiste in diverse specie di stabilità variabile: RNA ribosomico (rRNA), RNA di trasferimento (tRNA) e RNA messaggero (mRNA). L'RNA messaggero è associato all'espressione genica e quindi il più strettamente associato all'attività cellulare e alla vitalità14. È importante notare che l'assenza di espressione genica non è equivalente alla morte cellulare perché patogeni come Mtb sono noti per esistere in stati inattivi (domeggiati) ma vitali15,16. Le specie di RNA stabili come l'rRNA sono quindi marcatori migliori di stati attivi e inattivi di cellule vitali.

Utilizzando Escherichia coli, Sheridan ha mostrato che 16S rRNA proporzionalmente aumentato con la crescita batterica misurata da unità formanti colonia (CFU) conta17. C'è stato un calo simultaneo nei conteggi di CFU e 16S rRNA quando i batteri E. coli sono stati esposti agli antibiotici. Il calo dell'rRNA dopo la morte cellulare è stato un indicatore che potrebbe essere utilizzato come marcatore per la vitalità cellulare13,17. Attingendo a questo principio, il test del carico batterico molecolare della TB (TB-MBLA) è stato sviluppato per prendere di mira M. tuberculosis 16S rRNA per misurare il carico batterico TB vitale come marcatore della risposta al trattamento per i pazienti con terapia anti-TB11,18,19. Abbiamo ulteriormente sviluppato e ottimizzato il TB-MBLA per incorporare un controllo di estrazione cellulare che riflette la lisi di M. tuberculosis bacilli ed è robusto in diverse impostazioni ambientali20. La procedura TB-MBLA richiede che i primi passi di isolamento dell'RNA da Mtb siano condotti in un laboratorio CL3 fino a quando le cellule Mtb non sono completamente lisminate per garantire la sicurezza dei lavoratori. Esso comprende anche la conservazione del campione per l'analisi retrospettiva in lotti a zero sotto la guanidina, una sostanza tossica di livello 4. A tal fine, abbiamo usato il calore per inattivare Mtb e rendere sicuri i campioni per TB-MBLA da eseguire nei laboratori a livello di microscopia spalmata.

L'uso del calore in laboratorio e applicazioni cliniche è stato intorno per secoli21,22. Tuttavia, alcuni microrganismi come Mtb sono difficili da uccidere, e l'esposizione più breve al calore è insufficiente per uccidere tutte le cellule23,24. Uno studio ha rivelato che il riscaldamento di 20 min di colture di TB a 80 gradi centigradi ha ucciso tutti i bacilli Mtb senza distruggere il DNA necessario per PCR25. Successivamente, un certo numero di tecniche di estrazione del DNA di laboratorio attualmente riscaldano a 95 gradi centigradi. Abbiamo applicato lo stesso principio per dimostrare che l'ebollizione di campioni di TB a 80 gradi centigradi, 85 gradi centigradi o 95 gradi centigradi inattiva Mtb preservando l'RNA sufficiente per la TB-MBLA da eseguire. La coltura inattivata o l'espettorato possono essere mantenuti in contenitori strettamente chiusi a temperatura ambiente o refrigerati per 7 giorni senza ridurre la quantità di rRNA quantificabile.

Il TB-MBLA, attualmente utilizzato come test di solo uso di ricerca (RUO) è adattabile ed è stato applicato a diversi tipi di campione tra cui espettorato, tessuto polmonare, e fluido spinale cerebrale. Deve ancora essere applicato sul liquido alveolar bronchiale, sangue, e altri tipi di campioni. Utilizzando l'espettorato come campione, i risultati della valutazione multisito in Africa (dati inediti) e le pubblicazioni precedenti18,26 mostrano che la sensibilità di MBLA è coerente con mycobacterium crescita indicatore di cultura del tubo (MGIT) coltura liquida. Tuttavia, TB-MBLA è più veloce, dando risultati in ore al contrario di giorni o settimane di cultura, specifici, non colpiti da microrganismi non TB nel campione, e dà una misura quantitativa della gravità della malattia. L'OMS ha recentemente riconosciuto TB-MBLA come candidato per sostituire la microscopia e la coltura dello striscio per il monitoraggio del trattamento della TB2.

In questo articolo descriviamo in dettaglio l'inattivazione del calore e il protocollo TB-MBLA pubblicati in Sabiiti et al.27. Questo protocollo dettagliato fornirà una risorsa visiva one-stop per gli utenti TB-MBLA in tutto il mondo.

Protocollo

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1. Preparazione del campione

  1. Cultura
    1. Lavorando su una panca pulita o in una cabina di classe 1, raccogli 1 mL di fase esponenziale la coltura Bacillus Calmette-Guérin (BCG) in tubi di centrifuga in plastica da 15 mL. Chiudere saldamente i tubi.
      NOT: Per elaborare un intero campione da 5 mL, sono necessari cinque tubi di centrifuga da 15 mL.
      AVVISO: È necessario un armadio di biosicurezza quando si lavora con qualsiasi coltura della TB.
  2. Campione di espettorato per il paziente
    1. Lavorando in uno spazio ben ventilato e indossando una maschera nasale, aprire con cura la tazza di campioni, pipette 1 mL aliquote in tubi di centrifuga di plastica da 15 ml e chiudere saldamente i tubi.
      NOT: Una punta larga della bocca è raccomandato per pipetta espettorato. Utilizzando un paio di forbici, tagliare la parte fine della bocca di punta 1 mL per creare una bocca più ampia.

2. Inattivazione termica

  1. Prima della preparazione del campione, impostare il bagno d'acqua a 95 gradi centigradi.
    NOT: La temperatura di 95 gradi aumenta la possibilità di ridurre l'attività di RNase e quindi preservare più RNA per la TB-MBLA a valle.
  2. Trasferire i tubi campione in un portapacchi immerso nel bagno d'acqua. Assicurarsi che tre quarti di ogni tubo campione sia immerso nell'acqua.
  3. Far bollire a 95 gradi centigradi per 20 min, quindi trasferire i tubi in panca per raffreddare a temperatura ambiente per 5 min prima di iniziare l'estrazione dell'RNA.
    NOT: L'inattivazione completa del calore di M. tuberculosis bacilli e BCG è stata verificata incubando campioni e controlli inattivati dal calore a 37 gradi centigradi per 42 giorni per verificare la crescita. Una misurazione ottica della densità a 600 nm (OD600) è stata effettuata al basale e quindi settimanale per il periodo di incubazione di 42 giorni.

3. Estrazione dell'RNA

NOT: Il processo di estrazione dell'RNA qui descritto è per il kit di RNA elencato nella Tabella dei Materiali. Possono essere utilizzati altri kit di estrazione RNA adatti da diversi produttori.

  1. Aggiunta del controllo di estrazione (EC)
    1. Trasferire 1 mL di campioni inattivati a 1,5 mL. Spike 100 L della CE in ogni campione, chiudere il tubo e mescolare invertendo il tubo capovolto 3x.
      NOT: La CE è fornita con il kit di batteri vitali TB-MBLA (Tabella dei materiali).
  2. Sedimentazione cellulare
    1. Utilizzando una microcentrifuga da banco, centrifugare i tubi a 20.000 x g per 10 min a temperatura ambiente. Pipette al largo del supernatante, lasciando 50 litri di sedimenti.
    2. Sospendere il sedimento in 950 - L di lisitrico tampone pipetting su e giù, e trasferire l'intera sospensione nel tubo matrice lysing fornito con il kit di estrazione RNA (Tabella dei materiali). Assicurarsi che i tubi siano ben chiusi ed etichettare sia il coperchio che il lato del tubo.
  3. Per la lisi cellulare, trasferire i tubi dal passaggio 3.2.2 a un omogeneizzatore. Omogeneizzare i campioni per 40 s a 6.000 rpm.
  4. Purificazione dell'acido nucleico
    1. Centrifugare il lisato dal passo 3.3 a 12.000 x g per 5 min a temperatura ambiente.
    2. Preparare i tubi freschi da 1 mL e aggiungere 300 -L di cloroformio in ogni tubo.
    3. Utilizzando una punta da 1 mL con attenzione pipetta fuori dal supernatante senza toccare la matrice lising.
    4. Trasferire il supernatante al cloroformio contenente tubi e vortice per 5 s. Lasciare che il tubo si accerchi a 5 min o più fino a quando tre fasi (superiore, centrale e inferiore) sono chiaramente visibili.
    5. Centrifuga a 12.000 x g per 5 min a temperatura ambiente. Attentamente pipetta la fase superiore e trasferire in tubi freschi da 1,5 mL.
    6. Ai tubi al passo 3.4.5, aggiungere 500 L di etanolo a freddo ghiaccio 100%, chiudere i tubi e mescolare invertendo delicatamente a testa in giù 3x. Incubare i tubi a -80 gradi centigradi per 15 minuti o -20 gradi centigradi per 30 minuti e continuare l'estrazione, o lasciare a -20 gradi durante la notte per completare l'estrazione il giorno successivo.
    7. Impostare la microcentrifuga a 4 gradi centigradi e lasciare raffreddare ad almeno 12 gradi centigradi prima di iniziare la centrifugazione. Caricare i tubi nella microcentrifuga e centrifugare per 20 min a 13.000 x g. Scartare il supernatante, sostituire con il 70% di etanolo ghiacciato, e centrifugare per altri 10 min a 13.000 x g.
      NOT: Il 70% di etanolo deve essere fatto con acqua priva di nuclea sicca di grado molecolare.
    8. Scartare tutti i supernatali dal punto 3.4.7 e trasferire i tubi in un'incubatrice fissata a 50 gradi centigradi. Incubare per 20 min per asciugare il pellet RNA/DNA. Tenere i tubi parzialmente aperti per consentire l'evaporazione di tutto l'etanolo.
    9. Aggiungere 100 l di acqua priva di nucleata al pellet secco e incubare per 5 min a temperatura ambiente. Vortice per 3 s per mescolare il contenuto.
      NOT: In questa fase l'estratto può essere conservato 2/3 giorni in frigorifero o più a -80 gradi centigradi fino a quando non viene eseguita la sezione 3.5.
  5. Rimozione del DNA
    NOTA:     Questo passaggio è fondamentale perché la presenza di DNA nell'estratto invalida il risultato dell'MBLA. Questa sezione si basa su un kit di rimozione del DNA (Tabella dei materiali).
    1. Preparare un mix dell'enzima DNase I 10x buffer e dell'enzima DNase I per il numero di campioni (10 dollari l of buffer e 1 l of DNase per campione) più il 10% in più per coprire qualsiasi perdita dal pipettaggio. Mescolare vortice e poi pipetta 11 - L in ogni tubo contenente l'estratto di RNA.
    2. Mescolare vortice vortice 3 s e poi girare brevemente (10 s a 13,000 x g) per rimuovere eventuali goccioline sulle pareti. Incubare a 37 gradi centigradi per 30 min nel blocco caldo o nell'incubatrice. Aggiungete un ulteriore 1 -L di Enzima DNase I direttamente in ogni tubo, mescolate bene vorticendoe e incubate per altri 30 min a 37 gradi centigradi.
    3. Scongelare il reagente di inattivazione DNase 10 min prima della fine dell'incubazione d'Annae. Vortex 20 s per garantire una sospensione omogenea e lattiginosa e quindi aggiungere 10 - L di reagente di inattivazione DNase in ogni estratto di RNA dal passo 3.5.2.
    4. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 5 min. Vortex 3x durante la fase di incubazione di 5 min.
    5. Centrifugare la miscela a 13.000 x g per 2 min. Trasferire con attenzione il supernatante a 1,5 mL RNase tubi liberi senza toccare alcuna della matrice di inattivazione.
    6. Conservare l'estratto di RNA in frigorifero se si esegue l'RT-qPCR nello stesso giorno o a -80 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine.

4. Inverti Trascrizione qPCR

  1. Per campioni sconosciuti, diluire tutti gli estratti di RNA da utilizzare in un rapporto 1:10 in acqua libera di RNase. Mescolare bene vorticendo per 5 s e brevemente girare verso il basso per rimuovere eventuali goccioline o bolle d'aria.
  2. Per i campioni standard per una curva standard, prendere gli standard di RNA Mtb e EC dal congelatore -80 sC e scongelare a temperatura ambiente. Effettuare sette e sei diluizioni di campioni standard Mtb e EC rispettivamente. Cambiare le punte prima di trasferire la miscela da un tubo all'altro.
    NOT: I campioni standard vengono forniti con il kit TB-MBLA.
  3. Preparazione del mix master
    NOTA:     Master mix (MM) è una soluzione di reagenti PCR sufficiente ad amplificare tutti i campioni, gli standard e l'acqua per un controllo senza modello (NTC). L'acqua utilizzata come NTC deve essere la stessa acqua utilizzata nell'estrazione e per preparare la MM. Assicurarsi che gli standard, ogni campione di RNA e la sua diluizione decimale siano amplificati 2 volte per la reazione positiva della trascrizione inversa (RT) e 1x per la reazione negativa della trascrizione inversa (RT-). La reazione RT- è un controllo per determinare l'efficienza della rimozione del DNA(Tabella 1).
    1. Trasferire 16 - L di MM in ogni tubo di reazione PCR.
    2. Aggiungere 4 -L di estratto di RNA in ogni tubo di reazione RT e RT e acqua nei tubi di reazione NTC.
    3. Caricare i tubi di reazione in una macchina PCR in tempo reale e impostare le condizioni pcR come segue: 50 s per 30 min, 95 S per 15 min, 40x cicli a 94 s per 45 s, e 60 s per 1 min con acquisizione con fluorofori che assorbono in canali verdi e gialli.
      NOT: Il canale verde è il fluoroforo di rilevamento Mtb e il giallo è il fluoroforo di rilevamento dell'estrazione.
  4. Interpretazione dei risultati
    NOTA:     Assicurarsi che le reazioni duplicate dello stesso campione non differiscano da più di 1 deviazione standard. I valori Mtb ed EC Cq superiori a 30 sono considerati negativi. Vedere ulteriori dettagli sull'interpretazione nella tabella 2.
    1. Per interpretare la risposta al trattamento, convertire i valori Cq in carico batterico (eCFU/mL) utilizzando la curva standard. Leggere la risposta al trattamento come il cambiamento nel carico batterico durante il periodo di follow-up del trattamento.
      NOT: La diminuzione del carico batterico dopo il trattamento significa una risposta positiva (cioè farmaci anti-TB che uccidono i batteri della TB) mentre nessun cambiamento o aumento del carico batterico implica una risposta negativa, il che può significare resistenza dei batteri della TB ai farmaci anti-TB o il paziente che non aderisce in modo appropriato alla dose di trattamento. Il calo del carico batterico misurato da TB-MBLA è correlato all'aumento del tempo di MGIT alla positività della coltura (TTP).

5. Microscopia elettronica di trasmissione

  1. Trasferire 2 aliquote mL di colture e controlli inattivati dal calore in tubi di microcentrifuga da 2 mL. Centrifuga per 10 min a 20.000 x g.
  2. Scartare il supernatante e sospendere il pellet in 700 - L di buffer di fissaggio cellulare e incubare a temperatura ambiente per 5 min per fissare le cellule.
  3. Centrifugare la sospensione per 30 min a 16.000 x g per ottenere un pellet duro. Scartare il supernatante e sostituire con l'1% di saccarosio nella salina con buffer fosfato (PBS). Conservare i pellet nel saccarosio a 4 gradi centigradi fino a sezionare per la microscopia elettronica.
  4. Sezionamento e TEM
    NOTA:     il protocollo riportato di seguito è adattato da Griffiths etal.
    1. Cryoproteggere il pellet cellulare incorporandolo in 2,1 M di saccarosio in PBS durante la notte a 4 gradi centigradi. Lavare 3x con acqua ghiacciata.
    2. Raffreddare i pellet cellulari crioprotetti in azoto liquido e montarli mozziconi di criomicrotomia. Utilizzando il criomicrotome, tagliare le sezioni ultrasottili a 90 nm.
    3. Recuperate le sezioni tagliate utilizzando i loop di filo di tungsteno di 1:1 miscela di cellulosa metile 2% e 2,1 M di saccarosio in PBS.
    4. Trasferire le sezioni a pioloform rivestito 150 maglie rame esagonale supporti TEM (griglie) e conservare a 4 gradi centigradi o procedere al passaggio 5.4.5.
    5. Contrapporre le griglie in acetato di uranilo e asciugare all'aria in una pellicola di acetato di metile. Lavare le griglie con acqua ghiacciata seguita da due gocce di PBS oltre 5 min e asciugarle per 15-30 min. Esaminare le sezioni in base alle linee guida del TEM seguendo le linee guida del produttore.
      NOT: Tutte le fasi di etichettatura sono state eseguite a temperatura del ghiaccio (temperatura liquida) ad eccezione delle fasi di lavaggio, che sono state eseguite a temperatura ambiente.

Risultati

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Il calore inattiva tutti i M. tuberculosis bacilli
La densità ottica (OD) dei controlli (cellule vive) è aumentata nel tempo (0,04OD–0,85OD) e non è stata osservata alcuna variazione OD nei campioni inattivati dal calore, che indica rispettivamente la crescita e nessuna crescita (Figura 1)27. Allo stesso modo, l'espettorato clinico di controllo è cresciuto positivo al giorno 3 in MGIT, mentre i campioni clinici inattivati dal calore non sono stati segnalati positivi fino alla fine dell'incubazione. La crescita di Mtb in MGIT è stata confermata dalla microscopia dello striscio di ieehl-Neelsen e dall'antigene MPT6429.

L'RNA nei campioni inattivati è stabile a 37 gradi centigradi per 4 giorni
I campioni inattivati dal calore sono stati incubati a 37 gradi centigradi per determinare se l'RNA si degrada a seguito dell'inattivazione di calore delle cellule. Non è stata riscontrata alcuna differenza tra l'RNA raccolto al giorno (D) 0 immediatamente dopo l'inattivazione del calore e l'RNA isolato a D1, 2, 3 e 4 in entrambe le colture BCG (Figura 2A-C) e l'espettorato positivo della TB ( Figura2D).

RNase esogeno aumenta il tasso di degradazione dell'RNA nelle frazioni inattivate dal calore
Per determinare il motivo per cui l'RNA non era degradante, l'enzima RNase A è stato aggiunto esogenamente a 1.000 U/mL prima e/o dopo l'inattivazione del calore. Ciò ha causato una perdita di RNA equivalente al carico batterico di 1,5 x 0,3 -, 1,8 - 0,2 -, e 1,3 - 0,1 – log10 eCFU/mL rispettivamente a 80 , 85 gradi e 95 gradi centigradi in 4 giorni di incubazione. C'era una differenza nell'RNA degradato nei campioni in cui RNase è stato aggiunto prima e/o dopo l'inattivazione del calore (Figura 3A-C).

L'RNA è conservato per TB-MBLA usando 16S rRNA come marcatore di riferimento
L'effetto dell'inattivazione del calore sull'RRNA è stato misurato nelle colture BCG e nell'espettorato da pazienti con TB positivi. Il carico batterico misurato della coltura BCG di controllo, 5,3 x 0,2 log10 eCFU/mL, era pari a 0,2 x 0,1 log10 eCFU/mL superiore al log combinato di 5,1 0,3 log10 eCFU/mL di27coltura inattiva termica (ANOVA p < 0.0001) a 80 C, 85 C e 95C. Allo stesso modo, il carico batterico dell'espettorato del paziente di controllo, 7,1 log10 eCFU/mL, era di 0,8 x 0,1 log10 eCFU/mL superiore al log combinato di 6,3 - 0,41 log10eCFU/mL a 80 gradi centigradi, 85 gradi centigradi e 95 gradi centigradi (Figura 4B)27. La riduzione del carico batterico è stata <1log nei due tipi di campioni testati.

Il test di confronto multiplo di Sidak ha rivelato una differenza significativa tra il carico batterico a 95 gradi centigradi rispetto a quello di 80 e 85 gradi centigradi.001. Non è stata riscontrata alcuna differenza nei campioni di TB a tutte le temperature, p - 0,8.

L'integrità della parete cellulare non viene distrutta dal calore nella maggior parte delle cellule Mtb
Utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) abbiamo studiato se le cellule fossero lisviate dall'inattivazione del calore. Sottili sezioni di pellet fissi di paraformaldeide sono state fatte e incorporate in un mezzo ricco di elettroni prima dell'esame da TEM. L'ispezione delle cellule con un ingrandimento inferiore e superiore ha rivelato una parete cellulare intatta e corpi lipidici intracellulari visibili. Le cellule apparivano morfologicamente allungate ma non lisciviate. La figura 5 illustra la morfologia delle cellule di mycobacterium con diversi ingrandimenti. I due pannelli superiori rivelano corpi lipidici intracellulari e il cordone senza corda, una caratteristica morfologica tipica delle specie di miccobacterio. I due pannelli inferiori sono più alti ingrandimento espandendo la vista dei corpi lipidici e rivelando alcune strutture micro-intracellulari.

Il carico batterico misurato da TB-MBLA è inversamente correlato al tempo di coltura MGIT alla positività
Per i pazienti che rispondono alla terapia, il carico batterico cade in media 1 log10 eCFU/mL a settimana nel corso del trattamento. I risponditori veloci si rilassano più velocemente, convertendosi in negativo (carico batterico zero) di 2 settimane di trattamento. Il calo del carico batterico misurato da TB-MBLA corrispondeva all'aumento del tempo di coltura MGIT alla positività (TTP). La figura 6 mostra la correlazione inversa trovata tra carico batterico e TTP MGIT. La differenza, tuttavia, è che i risultati TB-MBLA sono disponibili in 4 h e il time-to-result è indipendente dal livello di carico batterico. Questo è in contrasto con 5-25 giorni per i test di coltura MGIT. La contaminazione con batteri non TB compromette ulteriormente i risultati dei test di coltura.

figure-results-1
Figura 1: Verifica dell'inattivazione di BCG a 80 gradi (curva del modello a punti), 85 gradi (curva del motivo punto-trattino) e 95 gradi (curva del modello di trattino). La cultura BCG di controllo (curva nera) era inoculata inoculata nello stesso mezzo di crescita. La crescita del controllo è stata confermata dall'aumento della OD della coltura nel periodo di incubazione. Questa cifra è stata modificata da Sabiiti et al.27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Stabilità dell'RNA quantificabile nel campione inattivato dal calore incubato a 37 gradi centigradi per 4 giorni (D0-D4). (A), (B) e (C) mostrano le colture BCG inattivate rispettivamente a 80 , 85 e 95 gradi centigradi. (D) indica l'espettorato della TB inattivato a 80 gradi centigradi. Il controllo è la frazione non trattata (live) dello stesso campione. Barre di errore: deviazione standard. Tre ripetizioni, nove repliche per corsa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Maggiore degradazione dell'RNA dopo l'aggiunta esogena dell'enzima RNase A. (A) Inattivazione del calore (HI) a 80 gradi centigradi, (B) HI a 85 gradi centigradi e (C) HI 95 gradi centigradi. Barre di errore: errore standard della media. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: La conservazione di RNA sufficiente per la misurazione del carico batterico TB-MBLA utilizzando 16S rRNA come marcatore. (A) Carico batterico stimato dalle colture BCG in vitro. (B) Carico batterico stimato dall'espettorato positivo alla tubercolosi. Barre di errore: errore standard della media (n - 18 e 20 repliche rispettivamente per A e B). Questa cifra è stata modificata da Sabiiti et al.27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Micrografie elettroniche di bacilli Mtb intatti dopo l'inattivazione a 95 gradi centigradi per 20 min. Con TEM sono stati osservati chiari muri cellulari intatti e corpi lipidibili enumerabili. In alto: immagini a basso ingrandimento di un gruppo di cellule che rivelano una morfologia corda micobatterica non ostacolata e corpi lipidi intracellulari. In basso: alto ingrandimento dei pannelli superiori per espandere la vista dei corpi lipidici e rivelare alcune strutture micro-intracellulari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-6
Figura 6: La curva di risposta al trattamento di 12 settimane di un paziente sulla terapia anti-TB che mostra una correlazione inversa tra TB-MBLA misurato carico batterico e TTP MGIT. Il carico batterico (curva blu) cade mentre il TTP sale (curva rossa) mentre il paziente risponde al trattamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Master mixReazione positiva RTReazione negativa RT
Volume per reazione x no. delle reazioni n. 5Volume per reazione x no. delle reazioni n. 5
Miscela Quantitect10,0 L (L)10,0 L (L)
Miscela di primer Mtb16S (F0,4 l l0,4 l l
Sonda Mtb16S0,2 l l0,2 l l
Miscela di primer CE (F0,4 l l0,4 l l
Sonda CE0,2 l l0,2 l l
Enzima RT0,2 l l-------
RNase acqua libera4,6 l4,8 l l
Volume totale16 ll16 ll

Tabella 1: Guida alla preparazione del mix master per il TB-MBLA qPCR.

digitareCanale MTBCanale CEInterpretazione
EsempioPositivoPositivoValido
EsempioPositivoNegativoIndeterminato
EsempioNegativoPositivoValido
EsempioNegativoNegativoNon valido
MTB - ControlloPositivoNegativoValido
Controllo dell'estrazione (CE)NegativoPositivoValido
Controllo del DNANegativoNegativoValido
Controllo negativo (NTC)NegativoNegativoValido

Tabella 2: Guida all'interpretazione dei risultati TB-MBLA.

Discussione

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Questo articolo mostra che il trattamento termico per 20 minuti a 80 gradi centigradi, 85 gradi centigradi e 95 gradi di tubercolosi inattiva efficacemente i campioni di tubercolosi, rendendo possibile l'esecuzione di TB-MBLA in un impianto non CL3 senza rischio di infezione per i lavoratori di laboratorio. I risultati confermano le osservazioni fatte in studi precedenti, mentre in contrasto con alcune sull'efficacia dell'inattivazione del calore di Mtb25,30. Per esempio, alcuni rapporti indicano che il riscaldamento a 80 gradi centigradi non è efficace su campioni di carico ad alta bacillari25,31,32,33. L'effetto inoculum ad alta densità è stato evitato nel nostro studio assicurando che tutti l'espettorato e le colture pure fossero riscaldate a un volume da 1 mL per tubo di centrifugazione da 15 mL fornendo spazio adeguato per esporre ogni parte del campione all'ebollizione27.

La conservazione dell'RNA in seguito all'inattivazione del calore rende possibile l'esecuzione di TB-MBLA. Questa scoperta concorda con due studi che hanno dimostrato la conservazione dell'RNA dopo l'inattivazione del calore12,34. Abbiamo dimostrato che l'RNA nei campioni inattivati dal calore è stabile a 37 gradi centigradi per 4 giorni, il che implica che i laboratori potrebbero fare test in batch mantenendo i campioni inattivati a temperatura ambiente per una settimana. Applicando kit di estrazione dell'RNA che richiedono refrigerazione o congelamento, la capacità di mantenere i campioni inattivati dal calore a temperatura ambiente elimina la necessità sia della catena del freddo che dei laboratori di categoria 3 per eseguire TB-MBLA in ambienti con risorse limitate.

Il carico batterico di 1log è stato perso usando il rRNA 16S come marcatore. Anche se c'era una differenza tra campione inattivato dal vivo e calore, la quantità persa per inattivazione del calore è troppo piccola per compromettere i risultati a valle. L'aumento della temperatura non ha aumentato la quantità di RNA perso, il che implica che la perdita osservata è indipendente dal trattamento termico. Il trattamento termico ad alte temperature causa molto probabilmente la lisi cellulare, esponendo l'RNA alla degradazione da parte di RNases. Infatti, l'aggiunta esogena di RNase A alla frazione inattivata dal calore ha aumentato il tasso di degradazione dell'RNA. L'ebollizione non ha ridotto l'attività di RNase, il che implica che si tratta di una proteina molto resistente.

È importante notare che una degradazione media dell'RNA di 1,5 log10 eCFU/mL non è una grande perdita. A tal fine si ipotizza che il riscaldamento lisi una piccola parte di Mtb bacilli, esponendo così una piccola quantità di RNA a RNase. Utilizzando TEM abbiamo dimostrato che la morfologia e l'integrità delle pareti cellulari delle cellule Mtb non sono influenzate dal riscaldamento a 95 gradi centigradi. Ciò significa che può richiedere vari fattori fisiologici e un apporto sufficiente di RNasi come nell'ospite per degradare significativamente L'RNA35,36. Inoltre, essendo un ribosoma strutturale, 16S rRNA è potenzialmente meno suscettibile a RNase37,38. Una singola cella Mtb contiene 700 ribosomi/0,1 mm3 di citoplasma37, il che implica che ci sono maggiori quantità di rRNA per cellula. Pertanto, piccole quantità di RNase possono avere un impatto minore38. L'esistenza di un elevato numero di ribosomi dà un vantaggio alla TB-MBLA in termini di sensibilità e capacità di rilevare i pazienti a basso carico di lavoro.

C'era una forte correlazione tra il carico batterico misurato da TB-MBLA e MGIT culture TTP. Questo conferma il carico batterico come motore della positività culturale in una certa misura. Tuttavia, il vantaggio di TB-MBLA è che quantifica direttamente il carico di bacchezza presente nel campione e non richiede la proliferazione delle cellule Mtb prima del rilevamento. Questo contrasta con la cultura il cui tempo di positività dipende dal livello di carico batterico e dalla velocità di proliferazione cellulare Mtb. Studi futuri valuteranno il flusso di lavoro TB-MBLA, inclusa l'inattivazione del calore, in ambienti clinici di routine. Lo studio esplorerà anche campioni con una serie di carichi batterici per capire il numero che potrebbe cambiare da positivo a negativo (cioè quelli con meno batteri in seguito all'inattivazione del calore).

Il protocollo TB-MBLA per la quantificazione molecolare del carico batterico è il primo del suo genere in batteriologia. Il metodo quantifica direttamente il carico batteriale Mtb dall'espettorato del paziente e non richiede alcuna coltura per farlo. Questo lo rende più veloce e aumenta il suo potenziale per informare una decisione clinica sul progresso del paziente. La fase di inattivazione del calore riduce il rischio di infezione e aumenta l'applicabilità di TB-MBLA in ambienti che non dispongono di un laboratorio di categoria 3. In seguito all'inattivazione termica del campione, ci sono tre passaggi di protocollo per ottenere risultati TB-MBLA: estrazione di RNA, trascrizione inversa (RT)-qPCR e analisi dei risultati qPCR.

Maggiore è l'efficienza di isolare l'RNA Mtb da un campione di pazienti, maggiore è la qualità dei risultati. È importante notare che la qualità del campione di espettorato influisce sulla quantità di RNA isolato. Ad esempio, l'espettorato salivare è considerato di bassa qualità ed è stato associato a un basso carico di bacillario. Ciò significa che è importante allenare il paziente all'aspettativa dell'espettorato di qualità. Per valutare l'efficienza del processo di estrazione, un controllo di estrazione (cioè il numero noto di cellule non-Mtb) è a spillo nel campione prima dell'estrazione dell'RNA. Il recupero del controllo di estrazione conferma l'efficienza del processo di estrazione dell'RNA. Il processo di isolamento dell'RNA non può essere valido a meno che il controllo di estrazione non sia stato recuperato. Dato che Mtb è un organismo resiliente rende la lisi meccanica una parte cruciale del processo. L'omogeneizzazione del campione ad alta velocità (600 giri/min) in presenza di perline (cioè matrice liscivia) lisci letali le cellule. La purificazione del lisato produce un estratto contenente sia l'RNA che il DNA. La rimozione del DNA è un ultimo passo cruciale dell'estrazione dell'RNA. TB-MBLA mira a misurare bacilli vitali quantificando l'RNA. Pertanto, la mancata rimozione del DNA genomico significa che i risultati avranno un segnale dal DNA, che non è un buon marcatore per la vitalità cellulare6.

L'RT-qPCR è un duplex con sonde dual labelcon per Mtb e controllo di estrazione. Si tratta di tre passaggi: trascrizione inversa di 30 min per trascrizione inversa a 50 gradi centigradi, denaturazione di 15 min a 95 gradi centigradi e 40 cicli di amplificazione a 94 e 60 gradi centigradi. L'acquisizione della fluorescenza dalle sonde avviene a 60 gradi centigradi (cioè la fase di allungamento del frammento). È importante notare che il TB-MBLA è stato ottimizzato utilizzando una particolare macchina qPCR, quindi gli operatori che utilizzano altre piattaforme qPCR dovrebbero ottimizzare le condizioni per le loro apparecchiature. L'efficienza della rimozione del DNA è controllata eseguendo una singola reazione per campione in assenza di RT. Un risultato positivo da questa reazione significa la rimozione incompleta del DNA. I campioni ad alto carico di peso che hanno elevate quantità di DNA possono richiedere il doppio della quantità di enzima DNase per rimuovere completamente il DNA. Fortunatamente, in campioni di carico di alta bacillari, la presenza di piccole quantità di DNA ha meno probabilità di influenzare il risultato dell'RNA. L'RNA ribosomico, il bersaglio TB-MBLA, si verifica naturalmente in un valore doppio della quantità di DNA37. Nella PCR, un controllo senza modello (NTC), che è l'acqua utilizzata per sciogliere i reagenti PCR, controlla la contaminazione incrociata con DNA o RNA esogeno. Un segnale positivo nel NTC implica contaminazione incrociata e il risultato considerato non valido. Ciò significa che tutte le soluzioni costituite con quest'acqua devono essere scariate e quelle nuove realizzate con una fiala d'acqua fresca. Si consiglia di tenere l'acqua PCR in separa per evitare la contaminazione di tutta l'acqua. Un controllo positivo (Mtb RNA) viene utilizzato per controllare l'efficienza complessiva della PCR.

L'analisi dei risultati comporta la conversione dei Cq PCR in carico batterico (cioè le unità di formazione della colonia stimate per mL) utilizzando la curva standard. L'impostazione e l'ottimizzazione della curva standard sono fondamentali per questo passaggio. Si consiglia un'efficienza di curva standard di 0,95–1. Le curve standard per la MTb e il controllo dell'estrazione devono essere impostate e ottimizzate prima che i pazienti o altri campioni di prova vengano eseguiti sulla macchina. I campioni standard sono forniti con il kit TB-MBLA. Per la PCR si raccomanda una diluizione di dieci volte dell'estratto di RNA. Ciò implica che il risultato del carico batterico deve essere moltiplicato per un fattore di 10 per ottenere il risultato finale del carico batterico per mL. È importante notare che i Cq superiori a 30 sono considerati negativi per TB-MBLA. È necessario un minimo di due potenziali risultati di carico batterico misurati in diversi punti temporali per fare un'inferenza sulla risposta al trattamento. Si raccomanda vivamente che uno dei due risultati dovrebbe essere al basale, prima dell'inizio del trattamento. Tuttavia, se la valutazione del carico batterico iniziata dal paziente si verifica a metà del trattamento, deve essere effettuata una misurazione del carico batterico a un secondo punto temporale per valutare la risposta al trattamento. TB-MBLA è in grado di distinguere il carico batterico in uno spazio di 3 giorni durante il trattamento, ma l'ideale sono due misurazioni del carico batterico effettuate a 7 giorni di distanza.

Mentre il protocollo genera risultati quantitativi informativi per la risposta al trattamento, è ancora in gran parte manuale e richiede notevoli mani sul tempo per l'estrazione dell'RNA. I tecnici dei laboratori occupati potrebbero non avere questo tempo. Sono in corso accordi per automatizzare i processi di estrazione dell'RNA e PCR.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Lo studio è stato reso possibile dal finanziamento del partenariato europeo e dei paesi in via di sviluppo (EDCTP) – Pan African Biomarker Expansion Program (Pan African Biomarker Expansion Program) SP.2011.41304.008. Il sostegno è stato ottenuto anche il grant di ricerca della University of St Andrews School of Medicine. La pubblicazione di questo manoscritto e del protocollo TB-MBLA come risorsa visiva è stata resa possibile dai finanziamenti del Consiglio di finanziamento scozzese e del Global Challenges Research Fund all'Università di St Andrews. Grazie all'ospedale materno di Maputo e al Mavalane Health Centre che ha fornito i campioni di espettorato clinico, e al team dell'Unità di trattamento della tubercolosi maputo che ha contribuito agli esperimenti di inattivazione del calore di campioni di espettorato clinico.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
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15 mL Provette da centrifugaFisher-Scientific10136120essere utilizzate provette da 50 mL se si tratta di volumi di campione maggiori
15 mL Rack per provette in filo metallicoFisher-Scientific11749128È possibile utilizzare altre marche di marca simile
Fisher-Scientific15700619Possono essere utilizzate altre marche con marca simile
Estrazione dell'RNA:
CloroformioSigma372978-1LNon necessario in altre marche di kit di estrazione dell'RNA
Etanolo, assoluto 99-100%Sigma51976-500ML-FVolume maggiore disponibile
Controllo dell'estrazioneGruppo SOI St AndrewsVitalbacteriaECFornito con il TB-MBLA Kit Vitalbacteria
FASTRNA Pro blue KitMP Biomedicals116025050Fornito con provette per matrice lisante
Acqua di grado molecolare (senza RNasi)SigmaW4502-1LQiagen, Fisherscientific può fornire anche lo stesso prodotto
Precellys 24 omogeneizzatoreVWR432-3750FastPrep MP Biomedicals può essere utilizzato anche
Microcentrifuga refrigerata, Fresco 21, HeraeusFisher-Scientific15352117Possono essere utilizzate altre marche con capacità simili
ThermomixerEppendorfBLD-455-010CFunziona con provette da 1-2 mL
TURBO Senza DNAFisher-ScientificAM1907MRichiede più tempo ma è più efficace rispetto alle procedure di rimozione del DNA più brevi.
RT-qPCR:
Primer e sonde TaqmanGruppo SOI St AndrewsVitalbacteriaPPFornito con il kit TB-MBLA Vitalbacteria. I fluorofori della sonda sono FAM (verde) per Mtb e HEX (giallo) per il controllo dell'estrazione (EC). Le piattaforme qPCR di Applied Biosystems utilizzano VIC invece di HEX.
Kit QuantiTect Multiplex RT-PCR NRQiagen204845miscela PCR più l'enzima RT
RotorGene Q 5plex macchinaQiagen9001580Altre macchine qPCR: Vii7, Quantistudio, Steponelus ecc. Possono essere utilizzate
provette e tappi a strisce, 0,1 mLQiagen981103Altre dimensioni di provette disponibili a seconda delle dimensioni del rotore. Per altre piattaforme PCR sono necessarie piastre PCR a 96 pozzetti.
Non inattivazione termica Materiali per la conservazione dei campioni
1 M Tris-HCl pH 7,5Sigma93313Fornito pronto all'uso
2-MercaptoetanoloSigma63689Molti fornitori competenti
Tiocianato di guanidina (GTC)PromegaV2791Marchio Promega consigliato per la qualità
Acqua di grado molecolare ( Senza RNasi)SigmaW4502-1LAssicura che la soluzione GTC sia priva di nucleasi
Materiali generali (utilizzati ma non specifici per TB-MBLA)
500 mL contenitori734-5087Marchio Nalgene consigliato
Barattoli per lo smaltimento dei rifiuti biologici Moltifornitori competenti
Barattoli per lo smaltimento deirifiuti chimiciMolti fornitori competenti
Guanti monouso, resistenti agliMolti fornitori competenti
Congelatore (-20 ° C)Molti fornitori competenti
Congelatore (-80 ° C)Molti fornitori competenti
Frigorifero (0-8 ° C)Molti fornitori competenti
Cappaaspirante Per la manipolazione sicura dei reagenti tossici
Bilance daPer la misurazione accurata dei reagenti
Cilindri di misurazione in plasticaPer garantire una misurazione accurata dei reagenti
ProvetteDeve essere adatto allo strumento PCR utilizzato
Pipette e puntali per pipette sterili filtrati corrispondenti,privi di DNAsi e RNAsi, intervallo: P1000, P200, P10, P2 Piastre di
carico Qiagility consigliate PiastraQiagena 5 pozzetti, piastra reattiva a 16 pozzetti, piastra per campioni a 32 pozzetti, piastre di reazione a 72 e 96 pozzetti
Robot di pipettaggio QIAgilityQiagenImportante per il pipettaggio
ad alta produttivitàRack per microprovette da 1,5 mL e 2 mL e per provetteResistente agli agenti chimici e autoclavabile raccomandato
RNase Away (Rimuove gli enzimi RNasi dallo spazio di lavoro)Fisher Scientific10666421Importante garantire che i servizi e i dispositivi siano privi di enzimi RNasi
Occhiali di sicurezza, resistenti agli agenti chimiciFisher ScientificPuò essere acquistato anche da Sigma. Proteggere gli occhi dai reagenti tossici.
Pipette sterili Pasteur, 1,5-3 mLMolti fornitori competenti
MicroprovetteProvette da 1,5 mL adatte per il congelamento a -80 ° C
raccomandato disinfettante per la tubercolosi, ad es. Tristel FuseAssicurarsi che sia preparato al momento o preparato entro una settimana
VortexGenie 2 marca consigliato
Microscopia elettronica a trasmissioneGlutaldeide
(8%)SigmaG7526-10MLParte del tampone di fissazione cellulare (tampone HEPES)
HEPES ( pH 7,4, 100 mM)SigmaH4034-25GParte del tampone di fissazione cellulare (tampone HEPES)
Leica FCS ultracryoLeicaCriomicrotomo per il sezionamento dei tessuti
MetilcellulosaAgar ScientificAGG6425Resina per montaggio a freddo
Paraformaldeide (4% in PBS)SigmaP6148-500GParte del tampone di fissazione cellulare (tampone HEPES)
SaccarosioSigma84097-250GTerreno di conservazione e montaggio
Acetato di uranileAgar ScientificAGR1260AColorazione universale per microscopia elettronica
possono in plastica agenti chimici laboratorio di reazione PCR di miscelazione master Falcon da 15 mL e 50 mL sterili prive di RNAsi

Riferimenti

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