Articolo metodologico

Optocardiografia ed elettrofisiologia Studi di Ex Vivo Langendorff-perfusi

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DOI:

10.3791/60472

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7 novembre 2019

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1Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation, Children's National Hospital, 2Children's National Heart Institute, Children's National Hospital, 3Center for Neuroscience Research, Children's National Hospital, 4Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, University of Alabama at Birmingham, 5Department of Pediatrics, Department of Pharmacology & Physiology, School of Medicine and Health Sciences, George Washington University

In questo articolo

Sommario

L'obiettivo di questo studio era quello di stabilire un metodo per studiare le dinamiche cardiache utilizzando un modello animale traslazionale. L'approccio sperimentale descritto incorpora l'optocardiografia a doppia emissione in combinazione con uno studio elettrofisiologico per valutare l'attività elettrica in un modello cardiaco porcina isolato e intatto.

Abstract

I modelli animali di piccole dimensioni sono più comunemente utilizzati nella ricerca cardiovascolare a causa della disponibilità di specie geneticamente modificate e dei costi inferiori rispetto agli animali più grandi. Eppure, i mammiferi più grandi sono più adatti per domande di ricerca traslazionale relative alla fisiologia cardiaca normale, alla fisiofisiologia e ai test preclinici degli agenti terapeutici. Per superare le barriere tecniche associate all'impiego di un modello animale più grande nella ricerca cardiaca, descriviamo un approccio per misurare i parametri fisiologici in un cuore di maialino isolato e perfuso da Langendorff. Questo approccio combina due potenti strumenti sperimentali per valutare lo stato del cuore: studio di elettrofisiologia (EP) e mappatura ottica simultanea di tensione transmembrana e calcio intracellulare utilizzando coloranti sensibili ai parametri (RH237, Rhod2-AM). Le metodologie descritte sono adatte per studi traslazionali che studiano il sistema di conduzione cardiaca, alterazioni nella morfologia potenziale d'azione, gestione del calcio, accoppiamento di contrazione eccitazione e l'incidenza di alternanze cardiache o Aritmia.

Introduzione

Le malattie cardiovascolari sono una delle principali cause di malattia e morte in tutto il mondo. Come tale, un obiettivo di ricerca primaria è quello di ottimizzare le metodologie che possono essere utilizzate per studiare la fisiologia cardiaca normale e meccanismi sottostanti che possono contribuire alla morbilità e mortalità negli esseri umani. La ricerca cardiovascolare di base si è tradizionalmente affidata a piccoli modelli animali, tra cui roditori e conigli1,2,3, a causa della disponibilità di specie geneticamente modificate4,5, minore costo, ingombro sperimentale più piccolo e una maggiore produttività. Tuttavia, l'uso di un modello di suina ha il potenziale per fornire dati più rilevanti dal livello clinico6. Infatti, studi precedenti hanno documentato somiglianze nell'elettrofisiologia cardiaca (EP) tra esseri umani e suini, tra cui correnti ioniche simili7, forma potenziale di azione8e risposte ai test farmacologici9. Inoltre, il cuore porcina ha cinedi contrattili e relax che sono più paragonabili agli esseri umani di roditori o conigli10. Rispetto a un modello canino, l'anatomia coronaria porcina assomiglia più da vicino a un cuore umano11,12 ed è il modello di scelta per studi incentrati sullo sviluppo del cuore, cardiologia pediatrica e/o difetti cardiaci congeniti 13.Anche se ci sono differenze tra il maiale e il cuore umano8, queste somiglianze rendono il cuore di porcina un modello prezioso per la ricerca cardiovascolare14.

La perfusione retrograda del cuore è diventata un protocollo standard per lo studio delle dinamiche cardiache ex vivo15 dalla prima fondazione da Oskar Langendorff16. Di conseguenza, Langendorff-perfusione può essere utilizzato per sostenere un cuore isolato e intatto in assenza di influenze autonome. Questo modello è uno strumento utile per confrontare direttamente l'elettrofisiologia cardiaca e la contrattilità tra cuori sani e non sani. Poiché le dinamiche cardiache sono complesse sia dal tempo che dallo spazio, una leggera alterazione in una regione può influenzare drammaticamente la capacità dell'intero cuore di funzionare come sincitio17. Pertanto, l'imaging spatiotemporale elevato di coloranti sensibili ai parametri è uno strumento utile per monitorare la funzione cardiaca sulla superficie del cuore18,19. Infatti, la doppia imaging simultanea di sonde fluorescenti sensibili alla tensione e al calcio consente la valutazione dell'attività elettrica, la manipolazione del calcio e l'accoppiamento di contrazione di eccitazione a livello tissutale20,21, 22,23,24,25,26,27,28. Le tecniche di mappatura langendorff-perfusione e/o ottica sono state precedentemente utilizzate per documentare il declino delle prestazioni cardiache dovuto all'invecchiamento o alle mutazioni genetiche e per valutare la sicurezza degli agenti farmacologici o delle esposizioni ambientali29 ,30,31,32,33.

In ambito clinico, uno studio di elettrofisiologia cardiaca invasivo viene spesso utilizzato per studiare disturbi del ritmo cardiaco, identificare patologie e individuare possibili opzioni di trattamento. Allo stesso modo, descriviamo un protocollo EP che può essere utilizzato per valutare la funzione del nodo del seno, misurare la conduzione atrioventricolare e identificare la refrattanza del tessuto miocardico. Lo studio EP descritto può essere eseguito in combinazione con la mappatura ottica, o optocardiografia34, per caratterizzare completamente la fisiologia cardiaca nei cuori isolati. Nel protocollo descritto, l'imaging a fluorescenza ad alta risoluzione spatiotemporale è stato eseguito con una combinazione di coloranti di tensione (RH237) e calcio (Rhod-2AM) in una configurazione a doppia emissione. Inoltre, i parametri di elettrofisiologia cardiaca sono stati monitorati sia sotto il ritmo del sinusale che in risposta alla stimolazione elettrica programmata.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con il National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Ottava edizione). Tutti i metodi e protocolli utilizzati in questi studi sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Protocol Committee presso il Children's National Hospital seguendo le Linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicate da NIH. Tutti gli animali utilizzati in questo studio hanno ricevuto cure umane in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Preparazione

  1. Preparare 6 L della soluzione Krebs-Henseleit modificata16 (mM: 118.0 NaCl, 3.3 KCl, 1.2 MgSO4, 24.0 NaHCO3, 1.2 KH2PO4, 10.0 glucosio, 2.0 pyruvate di sodio, 2% albumina, 2.0 CaCl2). Aggiungere CaCl2 il giorno dell'esperimento, poiché nel corso del tempo, in presenza di fosfati, il cloruro di calcio precipiterà terminalemente fuori dalla soluzione come fosfato di calcio.
  2. Regolare il pH a 7,4 dopo il filtraggio sterile (dimensione del poro: 0,22 m). Controllare l'osmolalità della soluzione per garantire un'autonomia di 275 mOsm/kg. Raffreddare 1 L sul ghiaccio per l'uso immediatamente dopo l'esordio cardiaco. Riscaldare 3 L in un bagno d'acqua a circa 37 gradi centigradi prima di spumeggiare con carbogeno (95% O2, 5% CO2).
    NOT: Il riscaldamento riduce al minimo le bolle e l'embolia potenziale, poiché il liquido freddo ha una maggiore capacità di gas di sciogliersi; pertanto, man mano che i supporti Krebs-Henseleit modificati passano attraverso il sistema di perfusione e si riscaldano, il gas verrà rilasciato come bolle.
  3. Preparare 2 L di cardioplegia (modificata della soluzione di cardioplegia di Nido, Tabella 1). Congelare abbastanza cardioplegia in un vassoio di cubetti di ghiaccio per riempire un becher da 500 mL.
  4. Accendere i bagni d'acqua circolanti impostati a 42 gradi centigradi. Accendere le pompe per far circolare il perfse in un circuito di riscaldamento idronico chiuso (per un elenco completo dei materiali, vedere Tabella dei materiali e Figura 1).
    NOT: Un bagno d'acqua circolante riscaldato viene utilizzato per riscaldare i tubi con giacca d'acqua e gli scambiatori di calore.
  5. Pulire i circuiti e le camere di tubazione eseguendo 2 L di una soluzione di detersivo universale in acqua attraverso il sistema. Sciacquare tutti i circuiti e le camere del sistema Langendorff con >4 L di acqua purificata. Eseguire le pompe fino a quando tutta l'acqua è stata rimossa dal sistema.
  6. Aggiungere un filtro a membrana sintetica in linea con le pompe perfusione (filtro polipropilene, dimensione dei pori >5 m). Gas un ossigenatore a microfibra (emofiltro) con 95% O2 e 5% CO2 a 80 kPa.
    NOT: Quando si utilizza albumin, c'è spesso schiuma associata all'ossigenazione e/o all'attività di pompaggio attraverso il circuito dei tubi. Un composto anti-foam (emulsione antifoam Y30) può essere aggiunto periodicamente gocciolante (ogni 30 min) per placare come si verifica.
  7. Controllare una calibrazione a due punti (0 e 60 mmHg) per il sensore di pressione situato sopra l'aorta o nella trappola a bolle; calibrare in base alle esigenze.
  8. Immediatamente prima dell'escissione cardiaca, versare i media nel sistema di perfusione loop Langendorff. Assicurarsi che perfusate passi attraverso ossigenatori in microfibra (emofiltri) gasati con perfusate ossigenati, che poi scorre attraverso scambiatori di calore per mantenere una temperatura mediaperusate di 37 gradi centigradi all'aorta.
  9. Impostare il bagno d'acqua circolante a pochi gradi superiore a 37 gradi centigradi, ad esempio 42 gradi centigradi, per tenere conto della perdita di calore durante lo scambio e in tutto il sistema. Monitorare la temperatura del perfusate circolante con termocoppie.

2. Escissione cardiaca e Langendorff-perfusione

  1. Sedare il maiale con un'iniezione intramuscolare (I.M.) di ketamina (20 mg/kg) e xylazina (2 mg/kg) e intubata con un tubo endotracheale. Per l'induzione, somministrare un'iniezione endovenosa (I.V.) di fentanil (50 g/kg) e rocuronio (1 mg/kg). Mantenere l'anestesia con Isoflurane inalato (0,5-3%), fentanil (10-25 g/kg) e pancuronio (1 mg/kg).
    NOT: Per questo studio di prova di principio, sono stati utilizzati giovani maiali dello Yorkshire (14-42 giorni, n - 18) che variavano da 2,5,10,5 kg di peso corporeo e 18-137 g di pesocardiaco( Figura 2 ). Se è necessaria un'iniezione aggiuntiva per l'induzione, la chetamina (10 mg/kg) può essere iniettata I.M.
  2. Una volta che l'animale è completamente anestesizzato e non reattivo, eseguire una sternotomia per esporre l'aorta ascendente e atrio destro.
    1. Utilizzando un bisturi, fare un'incisione mediana dalla parte superiore dello sterno presso l'inserizione toracica, fino al processo xifoide. Con un cauterio (o forbici), sezionare il grasso sottostante e il muscolo fino a quando lo sterno è visibile.
    2. Dal processo xifoide, tagliare lo sterno media attraverso il manubrio con forbici ossee chirurgiche o una sega ossea. Inserire retrattini nell'incisione per esporre il cuore.
  3. Fornire una dose di bolus di eparina (300 U/kg) all'atria destra, utilizzando un ago e una siringa da 18 G, per ridurre al minimo i coaguli di macchie sull'escissione dell'organo. Posizionare le pastiglie assorbenti nella cavità toracica e il ghiaccio intorno al cuore.
  4. Con le forbici, tagliare con cura attraverso il pericardio, isolare l'aorta per dissezione smussata dal tessuto connettivo circostante e bloccare l'aorta appena sotto il primo ramo arterioso sull'arco aortico. Utilizzando una siringa da 50 mL con un ago da 18 G, iniettare cardioplegia ghiacciata (20 mL/kg) attraverso la parte superiore dell'aorta ascendente.
  5. Tagliare i vasi che conducono al cuore e rimuovere il cuore con l'aorta ascendente intatta e immergere il cuore eccitato nella cardioplegia ghiacciata.
  6. Afferra le pareti dell'aorta con un paio di emostati e infilala su una cannula a coste attaccata a tubi che portano a 1 L di supporti di cardioplegia ghiacciata sospesi sopra il cuore (95 cm per fornire 70 mm Hg). Consentire al fluido di entrare e riempire l'aorta fino a quando non trabocca per evitare che qualsiasi bolla entri nella vascolatura.
    NOT: L'uso di un disaccoppiatore meccanico (2,3-butanedione monoxime [BDM] o blebbistatin) diminuirà il tasso di perfusione coronarica come la domanda di ossigeno del tessuto diminuisce.
  7. Fissare l'aorta alla cannula utilizzando nastro ombelicale e ancorarla ulteriormente legando gli emostati a sopportare il peso del cuore, che ora è appeso alla cannula (Figura 1C). Lasciare che i supporti freddi perfondono il cuore a una pressione costante di 70 mmHg a causa della gravità. Mantenere il cuore immerso nella cardioplegia fredda fino a quando non è pronto per essere trasferito al sistema riscaldato Langendorff-perfusione (<10 min).
  8. Trasferire il cuore al sistema Langendorff (37 gradi centigradi) senza introdurre aria nella cannula. Lasciare che il ritmo del sinustorio per lavare la vascolatura di qualsiasi sangue rimanente e cardioplegia.
    NOT: Nello studio descritto è stata osservata una portata iniziale media di 184 x 17 mL/min nei cuori di maialino giovanile isolati. La portata è scesa a 70 x 7,5 mL/min (media e SEM) dopo la perfazione con supporti riscaldati contenenti un disaccoppiatore meccanico (20 mM BDM). Non immergere il tessuto cardiaco, in quanto può incidere sull'imaging cardiaco. La temperatura dei tessuti è mantenuta dal flusso coronarica nel cuore del maiale a causa del suo volume maggiore e della superficie più piccola, rispetto ai roditori. A pieno regime, le temperature dell'epicardio e dell'endocardio variavano rispettivamente dai 35 ai 37 gradi centigradi.
    ATTENZIONE: Indossare adeguati dispositivi di protezione personale, compreso l'usura degli occhi quando si lavora con disaccoppiatori meccanici. Il cuore può espellere i media rapidamente e inaspettatamente.
  9. Defibrillare il cuore in caso di aritmie scioccanti (tachicardia ventricolare, fibrillazione ventricolare) posizionando pale esterne all'apice e alla base del cuore e consegnando un singolo shock a 5 J, aumentando in incrementi di 5 J (o come selezionabili dal defibrillatore) fino a 50 J, cardioversione, o ritmo non scioccante. Ripetere gli ammortizzatori a 50 J se necessario.
    NOT: Nello studio presentato, l'89% dei preparati ha richiesto la defibrillazione. Dopo l'equilibratura (10 min), è stata osservata una frequenza cardiaca media di 70 x 4,5 bpm (media - SEM) per i cuori giovani delle suine (Figura 2).
  10. Sciacquare il cuore con almeno 1 L di supporti Krebs-Henseleit modificati, senza ricircolare, per rimuovere sangue residuo e cardioplegia. Una volta che il supporto scorre chiaro attraverso il cuore, chiudere il ciclo circolante per ricircolare perfusate.

3. Studio di elettrofisiologia

  1. Per registrare un elettrocardiogramma piombo standard II (ECG) durante tutto il corso dello studio, collegare un elettrodo di 29 G di ago all'epicardiodio ventricolare vicino all'apice, con un altro elettrodo nell'atrio destro. Collegare gli ingressi positivi e negativi di un bioamplificatore differenziale rispettivamente all'apice e all'atrio destro.
  2. Fissare un elettrodo di stimolo bipolare sull'atria destro e un secondo elettrodo di stimolo bipolare al ventricolo sinistro laterale a scopo di stimolazione.
  3. Passo il cuore usando uno stimolatore di elettrofisiologia, con la corrente iniziale impostata su due volte la soglia diastolica (1-2 mA) e una larghezza di impulso di 1 ms35,36.
    NOT: Se la stimolazione non riesce a suscitare una risposta, la larghezza dell'impulso può essere aumentata fino a 2 ms. È necessaria più corrente (10x) con grandi elettrodi coassiali (stimolazione bipolare).
  4. Identificare la soglia di stimolazione applicando una serie di impulsi di stimolo (larghezza dell'impulso di 1 mA, 1 ms) a lunghezze di ciclo di stimolazione definite (PCL) per garantire una risposta di stimolo coerente.
    NOT: Una volta stabilito il tasso intrinseco, il treno d'impulso iniziale può iniziare a una libreria di classiPortacomi leggermente più corta.
  5. Eseguire il ritmo extrastimolato utilizzando un treno di stimolazione S1, S1 o S1, in quest'ultimo un treno di 6-8 impulsi (S1) è stato seguito da un singolo impulso (S2). Diminuire la libreria PCL S2 di 10 ms (ad esempio, 200 ms, 190 ms, 180 ms e così via) fino a quando non riesce a catturare. Passare alla penultima libreria di classi Portaimodale (cioè 190 ms) e diminuire in intervalli di 1 ms per trovare la libreria PCL più precisa prima della perdita di cattura (ad esempio, 184 ms).
    NOTA:     Gli stessi parametri di stimolazione vengono utilizzati sia per S1 che per S2( Vedere la figura 3 per esempi rappresentativi o i valori pubblicati in precedenza sulle misurazioni dell'elettrofisiologia del cuore di porcina37.
    1. Per stabilire il periodo refrattario efficace ventricolare (VERP), utilizzare l'elettrodo di stimolo sul ventricolo sinistro laterale per identificare l'intervallo S1-S2 più breve in cui l'S2 (battito prematuro) avvia la depolarizzazione ventricolare.
      NOT: Il periodo refrattario è l'intervallo di accoppiamento s1-S2 più breve.
    2. Per definire la lunghezza del ciclo di Wenckebach (WBCL), utilizzare l'elettrodo di stimolo sull'atrio destro per trovare l'intervallo S1-S1 più breve in cui 1:1 conduzione atrioventarelare propaga attraverso il percorso di conduzione normale.
      NOT: In caso contrario, il blocco cardiaco di 2o.
    3. Per definire il tempo di recupero del nodo del seno (SNRT), utilizzare l'elettrodo di stimolo sull'atrio destro per applicare un treno di stimolazione (S1-S1) e misurare il ritardo tra l'ultimo impulso nel treno di stimolazione e il recupero dell'attività spontanea mediata dal nodo sinoatriale.
    4. Per stabilire un periodo refrattario efficace del nodo atrioventricolare (AVNERP), utilizzare l'elettrodo di stimolo sull'atrio destro per trovare l'intervallo di accoppiamento S1-S2 più breve in cui la stimolazione atriale prematura è seguita da un suo potenziale fascio che suscita un QRS complesso, che significa depolarizzazione ventricolare.

4. Mappatura ottica della tensione transmembrana e del calcio intracellulare

NOT: Un disaccoppiatore meccanico deve essere utilizzato per ridurre al minimo gli artefatti di movimento durante la mappatura ottica ed evitare l'ipossia3,38,39,40. (-/-) La blebbistatina (5 M di concentrazione circolante) può essere aggiunta lentamente come dose di bolus di 0,5 mM in 5 mL di perfusate (100x di concentrazione finale)41. In alternativa, il BDM può essere inizialmente incluso nel supporto perfusate ad una concentrazione circolante di 20 mM.

  1. Preparare il tintura di tensione sciogliendo 5 mg di RH237 in 4 mL di anhydrous DMSO. Diluire l'aliquota di tintura con un massimo di 5 mL di supporti e vortice. Aggiungere lentamente RH237 (62,1 g per 500 mL di perfusate) proximal alla cannula aortica.
    NOT: Il tessuto miocardico può essere ri-macchiato con RH237, se necessario, per tutta la durata dell'esperimento.
  2. Preparare il colorante di calcio sciogliendo 1 mg di Rhod2-AM in 1 mL di Anhydrous DMSO. Mescolare il colorante con 50 o L di acido pluronico, mettere in un bagno di sonicazione 37 gradi per un massimo di 10 min, quindi diluire con un massimo di 5 mL di supporti. Aggiungere lentamente il colorante di calcio (50 g per 500 mL di perfusate) proximal alla cannula aortica.
    NOT: Per garantire una colorazione uniforme, i coloranti devono essere aggiunti lentamente (>30 s). Rhod-2AM impiega fino a 10 min per raggiungere la massima fluorescenza, mentre RH237 macchia il cuore all'interno di un 1/2 min. Utilizzando il carico di colorante descritto, è possibile prevedere intervalli di rapporto segnale/rumore (SNR) di 42,86 e 35 dollari per tensione e calcio, rispettivamente. I valori SNR possono essere calcolati come SNR (Conteggi picco-picco)/(Deviazione standard durante l'intervallo didiastolico)42.
  3. Posizionare l'hardware di imaging (fotocamera, barra di divisione immagini, obiettivo) come illustrato nella Figura 1,per mettere a fuoco un campo visivo appropriato.
    NOT: La barra di divisione è configurata con un mirror dichroico (660 nm) che supera RH237 e riflette gli spettri di emissione Rhod2. I filtri di emissione ad alta trasmissione vengono utilizzati per il RH237 (710 nm long pass) e Rhod2 (585 nm) luce emessa (pass lungo ET710, vedere Tabella dei materiali). Un'ampia lente da 50 mm/F0.95l è attaccata alla parte anteriore dello splitter dell'immagine. Questa configurazione si traduce in un'adeguata separazione della luce di emissione, come precedentemente convalidato43,44.
  4. Collegare la fotocamera a una stazione di lavoro e acquisire immagini utilizzando un software selezionato, con un tempo di esposizione di 0,5 ms. Eseguire l'allineamento delle immagini con l'aiuto di software in grado di dividere le regioni desiderate, sovrapporre e visualizzare una sottrazione in scala di grigi o pseudo-colore oltre a evidenziare il disallineamento (vedere Opzione Tabella dei materiali per il software).
  5. Spegnere la luce della stanza per ridurre al minimo l'interferenza della fluorescenza dall'illuminazione ambientale. Testare le luci LED (525 nm, 1,4 mW/mm2) prima dell'inizio dell'imaging per garantire un'illuminazione epicardiale uniforme e massima, come determinato dalla profondità del pozzo del sensore.
    NOT: Ogni luce è diretta attraverso un filtro di eccitazione (535 x 25 nm). Le luci LED possono essere attivate manualmente prima delle riprese per massimizzare la linearità del segnale. La fluorescenza emessa dall'epicardio viene passata attraverso lo splitter di immagini e i filtri di emissione. Le immagini divise vengono proiettate su un sensore ad alta velocità. Il campo visivo di è di circa 12 cm x 10 cm, ovvero 5,9 cm x 4,7 cm per ogni immagine divisa, a seconda della scelta dell'obiettivo e della distanza dal cuore.
  6. Per gli studi di mappatura ottica, immagine del miocardio durante il ritmo del sinusale, fibrillazione ventricolare (Figura 4) o ritmo dinamico (S1, 1 mA, 1 ms di larghezza dell'impulso) tramite un elettrodo di stimolazione posizionato sul ventricolo sinistro (Figura 5). Iniziare con una lunghezza del ciclo di stimolazione di 350 ms e diminuire di 10-50 ms per generare curve di restituzione (Figura 5E)35,36.

5. Pulizia

  1. Togliere il cuore dal sistema e drenare tutti i perfusate. Risciacquare i tubi del sistema e le camere con acqua purificata.
  2. Per la manutenzione ordinaria, sciacquare periodicamente il sistema con una soluzione detergente o una soluzione diperossido di idrogeno diluito, se necessario.

6. Trattamento dei dati

  1. Confermare la qualità del segnale ottico durante tutto lo studio aprendo un file video, selezionando una regione di interesse e tracciando la media fluorescenza nel tempo utilizzando un pacchetto software appropriato o un algoritmo personalizzato.
  2. Analizzare i dati di imaging come descritto in precedenza23,33,43,45,46, per quantificare il potenziale d'azione e i parametri temporali transitori di calcio, compreso il tempo di attivazione, tempo di accoppiamento tensione-calcio (differenza tra i tempi di attivazione di Vm e Ca) e misurazioni della durata di ripolarizzazione.
    1. Applicare la soglia per isolare i pixel epicardici fluorescenti ed eliminare i dati di sfondo rumorosi.
      NOT: La soglia semplifica e velocizza l'analisi su video di grandi dimensioni.
    2. Filtrare spazialmente i segnali ottici su una superficie epicardiale con dimensioni del kernel che vanno da 3 mm x 3 mm a 5 mm x 5 mm, come illustrato nella Figura 4 e Figura 5.
      NOT: Quest'ultimo migliorerà la SNR senza distorcere le caratteristiche potenziali di azione, la morfologia transitoria del calcio o il contorno complessivo dei fronti d'onda19,47. Questo potrebbe non essere necessario se si utilizza un sensore con pixel di grandi dimensioni o se binning durante l'acquisizione.
    3. Filtra temporalmente i segnali con un filtro digitale a passo basso (ad esempio, Butterworth di quinto ordine) con una frequenza di taglio compresa tra 100 e 75 Hz per eliminare il contenuto di segnale insignificante45.
      NOT: Vedere la figura 5C per un esempio di tracce elaborate rappresentative.
    4. Applicare la rimozione e la sottrazione della deriva, tramite raccordo polinomiale di ordine Nth, per ridurre al minimo gli effetti del fotosbiancamento, del movimento o di altre fonti significative di variazione.
    5. Dopo l'elaborazione e la normalizzazione dei dati ottici in un intero video, calcolare il potenziale dell'azione e i parametri transitori di calcio di interesse. Determinare il tempo di attivazione, definito come il tempo della derivata massima durante la depolarizzazione e la fluorescenza di picco per calcolare i tempi e i periodi di ripolarizzazione (durata potenziale dell'azione [APD] e [Ca2]idurata [CaD], vedere Figura 5).
    6. Dopo aver calcolato i parametri temporali, generare mappe isocroniche per rappresentare gli aspetti di una singola azione potenziale o calcio transitorio attraverso l'intera superficie epicardiale immagine utilizzando algoritmi personalizzati23,33, 43,45,46.
      NOT: Vedere Figura 5D per un esempio.

Risultati

Figura 1A mostra un diagramma del sistema di perfusione cardiaca isolato, che comprende il circuito tubo, pompa, filtro, ossigenatore, serbatoi ed elementi di riscaldamento. Il posizionamento degli elettrodi ECG (configurazione lead II) e della stimolazione è illustrato nella Figura 1Be la configurazione dell'immagine è illustrata nella Figura 1C. Uno schema dei componenti ottici e dei percorsi luminosi è illustrato nella Figura 1D.

Sono stati condotti studi sperimentali su cuori interi intatti e isolati dai giovani maiali dello Yorkshire (14-42 giorni, n - 18) che variavano in dimensioni da 2,5,10 kg di peso corporeo e 18-137 g di peso cardiaco (Figura 2A). Dopo aver trasferito il cuore isolato in un sistema Langendorff (37 gradi centigradi), la frequenza cardiaca si è stabilizzata a 70 s 4,5 bpm (media : SEM) entro 10 min di defibrillazione e rimase costante per tutta la durata dello studio (Figura 2B). È stata misurata una portata media di 184 mL/min (media e SEM), che è rallentata a 70 , 7 mL/min, dopo la perfusing con supporti riscaldati contenenti un disaccoppiatore meccanico (Figura 2C).

Gli ECG di piombo II sono stati registrati per tutta la durata dello studio durante il ritmo del sinusale(Figura 3A) o in risposta al ritmo esterno (Figura 3B-E) per quantificare i parametri elettrofisiologici. Per la valutazione dell'EP, all'atrio destro è stato applicato il ritmo dinamico (S1-S1) per individuare il WBCL e la SNRT (tempo di recupero dopo l'inizio di S1-S1, Figura 3C),in cui la WBCL è stata indicata come la PCL più breve che ha avviato la conduzione atriale alla conduzione ventricolare. Un protocollo di stimolazione S1-S2 è stato implementato utilizzando un elettrodo di stimolo bipolare sul ventricolo sinistro al fine di identificare l'intervallo di accoppiamento più breve che ha iniziato la depolarizzazione ventricolare, individuando così VERP (Figura 3D). In alternativa, viene applicato un protocollo di ritmo atriale S1-S2 per individuare AVNERP (S1-S2), come illustrato nella Figura 3E. Esempi rappresentativi di parametri di elettrofisiologia del cuore di maiale si allineano strettamente con quelli precedentemente pubblicati37.

Gli esperimenti di mappatura ottica sono stati eseguiti durante il ritmo del sinusoio, la fibrillazione ventricolare spontanea (Figura 4),o durante il ritmo dinamico (S1-S1) del ventricolo sinistro (LV) per generare curve di restituzione elettriche e calcio Figura 5. Immagini rappresentative di un cuore di maialino carico di tintura sono mostrate nella Figura 4 con i corrispondenti potenziali di azione ottica (Vm) e calcio (Ca) transitori raccolti da due regioni di interesse sulla superficie epicardiale (ventricolo destro [RV] - blu, LV - rosso) . I segnali non elaborati vengono visualizzati durante il ritmo del senzio e durante la fibrillazione ventricolare. Come accennato in precedenza, durante gli esperimenti di mappatura ottica è stato utilizzato anche il ritmo epicardiale dinamico (S1-S1) per normalizzare qualsiasi leggera differenza nellafrequenza cardiacaintrinseca ( Figura 5A-E). Vengono visualizzati i segnali grezzi (RV - blu, LV - rosso), che sono stati utilizzati per rappresentare il potenziale di azione - tempo di accoppiamento transitorio di calcio (Figura 5C), attivazione e durata (Figura 5D), restituzione elettrica e restituzione del calcio (Figura 5E). Per le preparazioni miocardiche spesse, il filtraggio spaziale con dimensione del kernel 3 mm x 3 mm è appropriato per il potenziale di azione epicardiale o l'analisi transitoria del calcio19,47. Di conseguenza, le immagini ad alta risoluzione spaziale (nell'impostazione descritta 1240 x 1024 totale, o 620 x 512 per canale, dimensione dei pixel di 6,5 m) sono spesso collocate spazialmente durante o dopo l'acquisizione (Figura 5C). L'elaborazione delle immagini può essere eseguita per generare mappe di attivazione e ripolarizzazione utilizzando algoritmi personalizzati23,33,43,45 ( Figura3D), con il tempo di attivazione di ogni pixel sul cuore è stato definito come il derivato massimo del potenziale di azione o upstroke transitorio di calcio.

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Figura 1: Configurazione sperimentale. (A) Diagramma del sistema di perfusione cardiaca isolato; frecce indicano la direzione del flusso. (B) Un cuore cannulato è mostrato con posizionamento elettrodo. RA - atria destra, RV - ventricolo destro, LV - ventricolo sinistro, elettrocardiogramma di piombo II. (C) La piattaforma di imaging in prossimità del tessuto cardiaco. (D) L'emissione di ogni sonda complementare (tensione, calcio) è separata dalla lunghezza d'onda utilizzando un dispositivo di scissione dell'immagine con filtri di emissione appropriati e specchio dicroico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Misurazioni del peso cardiaco, della frequenza e del flusso. (A) Rapporto peso cardiaco/peso corporeo per ogni suinio utilizzato nello studio (n - 18). (B) La frequenza cardiaca misurava 10 min dopo la defibrillazione e di nuovo alla fine dello studio (circa 1 h). (C) Il flusso coronario scende precipitosamente dopo la perfusione con un disaccoppiatore meccanico (BDM) a causa della ridotta domanda di ossigeno. Le barre della scala rappresentano la media : SEM.

figure-results-3
Figura 3: Esempi rappresentativi delle registrazioni di elettrocardiogramma di piombo II raccolte durante il ritmo del sinusale o in risposta al ritmo esterno. (A) Ritmo del peccato normale. (B) Esempio di ritmo epicardiale alla durata del ciclo di 400 ms ( S1-S1), che è stato utilizzato per esperimenti di imaging. (C) Top: Atrial pacing per identificare WBCL; l'acquisizione riuscita viene osservata a S1 - 250 ms in cuiin atriale a conduzione ventricolare è osservato. Si noti che il ritmo atriale può essere utilizzato per determinare SNRT (tempo di scarico del nodo del sino, dopo l'inizio del ritmo esterno). In basso: Come la lunghezza del ciclo S1 è diminuita a 205 ms, la conduzione al ventricolo fallisce. (D) Superiore: Stimolazione Epicardiale (S1-S2) per identificare VERP; l'acquisizione riuscita viene osservata a S1 - 450 ms, S2 - 300 ms. Bottom: Poiché la lunghezza del ciclo S2 viene ridotta a 250 ms, il tessuto ventricolare non riesce a catturare. (E) Atrial pacing (S1-S2) per identificare AVNERP. In alto: l'acquisizione riuscita viene osservata a S1 - 450 ms, S2 - 200 ms. In basso: Quando la lunghezza del ciclo S2 viene ridotta a 199 ms, la conduzione al ventricolo ha esito negativo. Le frecce blu indicano picchi di stimolazione, le frecce rosse indicano la cattura ('C') o nessuna cattura ('NC'). S1-S1 - ritmo dinamico, S1-S2 - stimolazione extrastimolante. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Dati ottici durante il ritmo del senno e la fibrillazione ventricolare. Sinistra: immagini rappresentative di un cuore di maiale carico di tintura (Vm - tensione, RH237; Ca - calcio, Rhod2), vista anteriore. Tensione transmembrana filtrata spazialmente e segnali fluorescenti intracellulari del calcio da un cuore di maiale durante il ritmo del senno (centro). Segnali di tensione e calcio durante la fibrillazione ventricolare (destra). Dimensioni della regione del segnale (15 x 15 x 2,4 x 2,4 mm2, 30 x 30 x 4,8 x 4,8 mm2 dimensioni del kernel) rappresentate come quadrati rossi e blu. Unità : F/F. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-5
Figura 5: Dati ottici provenienti da cuori di maiale langendorff-perfusi. La tensione transmembrana non lavorata, filtrata spazialmente (A) e (B) la fluorescenza intracellulare del calcio da destra e sinistra durante il ritmo elettrico all'apice. I segnali non filtrati e mediati nello spazio raffigurano i potenziali di azione ottica e i transitori di calcio provenienti da regioni di interesse (le unità di segnale sono f/F. (C) Una sovrapposizione di transitori normalizzati illustra il tempo di accoppiamento transitorio potenziale calcio (basso passaggio filtrato a 75 Hz). (D) Elaborazione dei segnali attraverso la superficie epicardiale per generare mappe isocroniche di parametri temporali, inclusi il tempo di attivazione (tact) e l'80% del tempo di ripolarizzazione. (E) Curve di restituzione transitorie elettriche e di calcio generate a più frequenze (a sinistra) con analisi statistica (a destra) per illustrare tempi di ripolarizzazione più lunghi a cicli di stimolazione più lenti. Barre di scala - media - SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

ChimicaFormulaPeso molecolareg/L
Cloruro di sodioNacl58.445.26
Gluconato di sodioC6H11NaO7 218.145.02
Triidrato di acetato di sodioC2H3NaO2s3H 2O136.083.68
Cloruro di potassioKcl74.550.63
Cloruro di magnesio (anidroso)MgCl2 95.210.1405
8,4% bicarbonato di sodioNaHCO3 84.0113
MannitoloC6H14O6 182.1716.3
Solfato di magnesioMGSO4 120.374
Ph7.4
Osmolarità (mOsmol/L)294

Tabella 1: Ricetta di cardioplegia di del Nido modificata.

Discussione

Anche se i modelli di ricerca cardiovascolare vanno dai preparati cellulari ai preparati in vivo, c'è un compromesso intrinseco tra rilevanza clinica e utilità sperimentale. In questo spettro, il cuore isolato Langendorff-perfuso rimane un compromesso utile per studiare la fisiologia cardiaca48. L'intero modello cardiaco rappresenta un livello più elevato di integrazione funzionale e strutturale rispetto ai monostrati a cella singola o a tessuto, ma evita anche le complessità confuse associate ai modelli in vivo. Un grande vantaggio durante la doppia mappatura ottica è che la superficie epicardiale del cuore isolato può essere osservata, e l'imaging a fluorescenza del potenziale transmembrana e della manipolazione del calcio può essere utilizzato per monitorare la fisiologia cardiaca34.

I modelli di roditori sono più comunemente utilizzati per preparazioni cardiache isolate rispetto agli animali più grandi, in parte a causa del costo associato di up-sizing di tutti gli elementi coinvolti (ad esempio, volume della soluzione, circuito di perfusione, quantità di coloranti e disaccoppiatori meccanici) insieme a una maggiore instabilità e propensione per le aritmie in animali più grandi10,36,49. Un vantaggio dell'uso dei cuori di maiale è che assomigliano strettamente al cuore umano nella struttura, nelle dimensioni e nella velocità di contrazione, modellando quindi in modo più accurato parametri emodinamici come il flusso sanguigno coronavo e l'uscita cardiaca. Allo stesso modo, gli esseri umani e i maiali hanno una gestione simile del calcio, intervalli di elettrocardiogramma37e una morfologia potenziale di azione compresi i canali sottostanti che rappresenta12,50,51, 52. Questo protocollo descrive in dettaglio i passaggi per la creazione di un modello animale di grandi dimensioni riproducibile per caratterizzare in modo completo la funzione miocardio. L'imaging simultaneo della tensione transmembrana (RH237) e del calcio intracellulare (Rhod2), utilizzato in combinazione con protocolli elettrofisiologici stabiliti, offre l'opportunità di individuare i meccanismi responsabili di Funzione. La metodologia descritta può essere utilizzata per test di sicurezza preclinici, screening tossicologico e lo studio di patologie genetiche o di altro tipo. Inoltre, la metodologia descritta può essere modificata e adattata per l'uso con altri modelli cardiaci (ad esempio, canino, umano) a seconda dello specifico focus di ricerca53,54,55.

Ci sono alcune modifiche critiche da tenere a mente quando si passa da un modello di roditore più piccolo a un modello di maiale più grande per preparazioni isolate e intere del cuore. Durante la preparazione e la configurazione, si consiglia di aggiungere albumina al perfusate per mantenere la pressione oncotica e ridurre l'edema (più antifoam, se necessario)56,57,58,59. Inoltre, la perfusate contenente albumina può anche aiutare in studi metabolici che richiedono anche il completamento dell'acido grasso ai media60,61. A differenza dei cuori dei roditori, il cuore di maiale più grande non ha bisogno di essere immerso nei supporti caldi a causa del suo rapporto superficie-volume più piccolo e dell'aumento del volume dei supporti riscaldati che scorre attraverso i vasi coronarici che meglio mantiene la temperatura. Come notato in precedenza, abbiamo posizionato sonde di temperatura all'interno del ventricolo destro e sulla superficie epicardiale dei ventricoli destro e sinistro, osservando solo lievi fluttuazioni di temperatura di 1o2 gradi centigradi in tutte e tre le posizioni in tutto lo studio. È importante sottolineare che tali flussi più veloci possono anche aumentare la probabilità di bolle e una potenziale embolia. Per aggirare questo problema, si consiglia di utilizzare una trappola a bolle con grandi tubi di foro che conducono direttamente alla cannula aortica. Allo stesso modo, abbiamo trovato più utile avere due individui che lavorano in tandem per cannulare l'aorta su un cuore più grande (e più pesante); una persona per tenere l'aorta aperta con robusti emostati e un'altra per fissare l'aorta alla canula con nastro ombelicale. Nella metodologia descritta, abbiamo scoperto che la perfusione con cardioplegia e defibrillazione era vitale per il recupero cardiaco, il che è contrario ai preparati cardiaci dei roditori. Nella nostra esperienza, solo pochi cuori ascisi ripresero la normale attività guidata dal sino senza cardioversione.

Per migliorare gli endpoint dell'imaging ottico, una preparazione del cuore appeso ha limitato l'effetto dell'abbagliamento che può verificarsi con un cuore sommerso. Inoltre, il cuore appeso evita anche qualsiasi compressione o compromesso dei vasi coronarici sull'aspetto posteriore del cuore che può verificarsi quando si posa il cuore orizzontalmente per l'imaging verticale. Abbiamo anche scoperto che il caricamento di coloranti fluorescenti dopo la trappola a bolle (vicino alla cannula aortica) ha notevolmente migliorato la colorazione dei tessuti e i segnali ottici. Infine, per migliorare gli endpoint di elettrofisiologia cardiaca, l'uso di un elettrodo di stimolazione coassiale più grande ha facilitato il pacing atriale di successo. Anche se descriviamo l'uso di elettrocardiogrammi per identificare la cattura e la perdita di cattura per vari parametri EP, possono essere utilizzati anche cateteri intracardiaci o elettrodi di registrazione bipolari.

Il nostro studio si è concentrato sullo sviluppo di una metodologia per la doppia mappatura ottica e la valutazione elettrofisiologica cardiaca in un modello di cuore di porcina isolato e intatto. A causa di somiglianze con il cuore umano giovanile, il cuore porcina rimane un modello popolare per gli studi incentrati sulla cardiologia pediatrica o difetti cardiaci congeniti. È importante sottolineare che l'approccio descritto può essere adattato per l'uso con cuori adulti di dimensioni maggiori e/o diverse specie di interesse. Infatti, altri laboratori possono scoprire che l'uso di cuori canini o umani (donatore o malato) sono più applicabili per il loro specifico focus di ricerca53,54,55. Un'altra potenziale limitazione a questo studio è l'uso di un disaccoppiatore meccanico per ridurre l'artefatto di movimento durante l'imaging. Blebbistatin è diventato lo scollegatore di scelta nelle applicazioni di imaging cardiaco grazie ai suoi effetti minimi sui parametri ECG, l'attivazione e i periodi refrattari41,62,63. BDM è una scelta meno costosa, che può essere particolarmente importante negli studi sugli animali di grandi dimensioni che richiedono maggiori volumi di perfusate e uncoupler meccanico, ma è noto per avere un maggiore impatto sulle correnti di potassio e calcio che possono alterare il potenziale di azione morfologia64,65,66,67. Se si utilizza BDM, si noti che l'accorciamento APD aumenta la vulnerabilità dei cuori agli arrythmias68indotti da urti . Al contrario, la principale limitazione all'uso della blebbistatin è la sua fotosensibilità e fototossicità, anche se formulazioni alternative che hanno ridotto questi effetti69,70,71. Infine, la metodologia descritta utilizza un unico sistema di telecamere per la doppia mappatura ottica, ma è importante notare che gli studi di ricerca si sono concentrati sulla fibrillazione ventricolare e/o sul tracciamento delle onde elettriche attraverso la superficie epicardiale dovrebbe modificare questo approccio per includere l'imaging panoramico tridimensionale, come descritto dagli altri15,19,72,73,74,75 .

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono con gratitudine il Dr. Matthew Kay per una guida sperimentale utile, e Manelle Ramadan e Muhaymin Chowdhury per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dai National Institutes of Health (R01HL139472 a NGP, R01 HL139712 a NI), Dall'Istituto nazionale di ricerca per bambini, dall'Istituto Nazionale del Cuore dei Bambini e dall'Istituto Sheikh s'ayed per l'innovazione chirurgica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
(-)-BlebbistatinSigma-AldrichB0560-5MGDisaccoppiatore meccanico
2,3-Butandione monoxime (BDM)Sigma-AldrichB0753-100GDisaccoppiatore meccanico
AlbuminaSigma-Aldrich, St. Louis, MOA9418
Interfaccia segnale analogicoemka Technologiesitf16USB
AntischiumaSigma-AldrichA5758-250ML
Emulsione antischiuma Y-30Sigma-Aldrich, St. Louis, MOA5758
Cannula aortica, 5/16"Cole-Parmer45509-60
Trappola a bolleSigma-AldrichCLS430641U-100EA
CaCl2Fisher Scientific, Fair Lawn, NJC77-500
Camera, sCMOSAndor TechnologyZyla 4.2 PLUS
Elettrodo di stimolazione coassiale (atri)Harvard Apparatus73-0219
ZollSerie
Specchio dicroicoTecnologia ChromaT660lpxrxt-UF2
Amplificatore differenzialeWarner InstrumentsDP-304A
Filtro di emissione, calcioChroma TechnologyET585/40m
Filtro di emissione, tensioneChroma TechnologyET710lp
Stimolatore EP (Bloom)Fisher MedicalDTU-215B
Filtro di eccitazioneChroma TechnologyCT510/60bp
Luci di eccitazioneThorlabsSOLIS-525C
FiltroMcMaster-Carr8147K52
Cartuccia filtrante, polipropilenePentairPD-5-934
Alloggiamento filtroMcMaster-Carr9979T21
Trasduttoredi flusso TransonicME6PXN
GlucosioSigma-Aldrich, St. Louis, MO158968
Serpentina di riscaldamentoRadnoti158821
EmofiltroHemocorHPH 400
Pinze emostaticheWorld Precision Instruments501326
Image SplitterCairn ResearchOptoSplit II
KClSigma-Aldrich, St. Louis, MOP3911
KH2PO4Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ423-316
Tubo di grande diametro, ID 3/8"Fisher Scientific14-169-7H
Obiettivo 50 mm, 0,95 f-stopNavitarDO-5095
MetamorphMolecular DevicesAllineamento dell'immagine
MgSO4Sigma-Aldrich, St. Louis, MOM-7506
Detergente MucasolSigma-AldrichZ637181-2L
Na PiruvatoSigma-Aldrich, St. Louis, MOP2256
NaClSigma-Aldrich, St. Louis, MOS-3014
NaHCO3Fisher Scientific, Fair Lawn, NJS-233
Elettrodi ad ago 29 G, 2 mmAD Instruments Inc.
Eliminatore di rumoreQuest ScientificHumbug
perfusionePolyStanA/S 1481
Trasduttore di pressioneWorld Precision InstrumentsBLPR2
Serbatoio, 2 LCole-ParmerUX-34541-07
RH237AAT Bioquest Inc.21480
Rhod2-AMAAT Bioquest Inc.21062
Elettrodo di stimolazione (ventricolo)Harvard Apparatus73-0160
Sutura chirurgicaMcKesson Medico-Chirurgico890186
Trasduttore amplificatorePrecision InstrumentsTBM4M
Console di flusso per tubiTransonicTS410
Nastro ombelicaleJorvetJ0025UA
Bagnomaria/circolatoreVWR89400-970<
strong>Strumenti chirurgici
Forbici per bendeHarvard Apparatus72-8448Lister Forbici per bende, angolate, smussate/smussate, lunghezza lama 42,0 mm, 17,0 cm
ElettrocauterizzazioneDalwha Corp. Ltd.Modello BA2ALD001: 200
EmostaticoRobozRS-7476Pinza occludente a tubo St Vincent Pinze
emostaticheApparecchio Harvard72-8960Pinza emostatica Hartmann, curva, seghettata Larghezza punta 2,2 mm, emostatici 9,5 cm
Apparato Harvard72-8985Pinze emostatiche Halstead-Mosquito Curve, seghettate, punta 2 mm
Forbici MayoWPI50174914,5 cm, forbici Metzenbaum diritte
WPI50174711,5 cm,
pinze per zanzareApparecchio Harvard72-8980Pinze emostatiche Halstead-Mosquito Dritte, lisce, larghezza punta 2 mm 12 cm
Porta aghiApparecchio Harvard72-8828Portaaghi Webster, dritto, liscio, lunghezza totale 13,0 cm
Croce pediatrica morsettoRobozRS-7660Cooley-Derra Morsetto 6,25" 5 mm Calibrazioni
Pinze ad angolo rettoWPI501240Baby Mixter Pinze emostatiche, 14 cm, bisturi ad angolo retto
Ted Pella549-4Manico per bisturi n. 4, 13,7 cm in acciaio inossidabile e 10 lame n. 22
ForbiciHarvard Apparatus72-8380Forbici operative, dritte, smussate/smussate, lama da 42 mm, 12 cm
Pinza seghettata drittaWPI500363Pinza per medicazione 15,5 cm
Pinza per asciugamaniWPI501700Pinza per asciugamani Backhaus, 13 cm, curva, maniglia di bloccaggio,
divaricatore SS WeitlanerWPI501314divaricatore Weitlanger, autobloccante, 10,2 cm, 2x 3 rebbi affilati
monouso
3-0 prolene suturaFornitori vari Fornitorivari Loop
per vasiAspen surgical011001PBXSterion® Ansa per vasi, 0,8 mm x 406 mm
Cardioplegia (Plegisol)Pfizer00409-7969-05Plegisol; Soluzione per cardioplegia cristalloide St Thomas 20 mL/kg
EparinaFornitori variFornitori vari300 U/kg
Siringa e agoFornitori vari Fornitorivari60 mL e 18 G rispettivamente
Nastro ombelicaleEthiconU12T
Defibrillatore MMLA1204Pompa di World di base da 14 cm dritte

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