Livelli elevati di proteine del fluido spinale possono essere il risultato della diffusione della proteina plasmatica attraverso una barriera emato-encefalica alterata o sintesi intratea. In questo articolo viene presentato un protocollo di test ottimizzato che aiuta a discriminare entrambi i casi e fornisce misurazioni quantitative delle proteine sintetizzate intrathecally.
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Articolo metodologico
Misurazione quantitativa delle proteine intratecalliamente sintetizzate nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il liquido cerebrospinale (CSF), un fluido trovato nel cervello e nel midollo spinale, è di grande importanza sia per la scienza di base che clinica. L'analisi della composizione delle proteine CSF fornisce informazioni cruciali nella ricerca sulle neuroscienze di base e sulle malattie neurologiche. Un avvertimento è che le proteine misurate in CSF possono derivare sia dalla sintesi intrateca che dalla trasposizione dal siero, e l'analisi delle proteine del CSF può determinare solo la somma di questi due componenti. Per distinguere tra la trasposizione proteica dal sangue e le proteine prodotte intratelamente nei modelli animali e negli esseri umani, le misurazioni di profilazione delle proteine CSF utilizzando strumenti di analisi delle proteine convenzionali devono includere il calcolo dell'albumina CSF/serum quotient (Qalbumin),un marcatore dell'integrità dell'interfaccia emato-encefalica (BBI), e l'indice proteico(proteinaQ /Qalbumin ), una stima della sintesi di proteine intrateche. Questo protocollo illustra l'intera procedura, dalla raccolta del CSF e del sangue ai calcoli dei quozienti e degli indici, per la misurazione quantitativa della sintesi delle proteine intrateche e la compromissione della BBI nei modelli murini di disturbi neurologici.
Introduzione
Il liquido cerebrospinale (CSF), un liquido chiaro e incolore che circonda il cervello e il midollo spinale, ha una grande importanza clinica e scientifica di base. Il CSF conserva l'ambiente elettrolitico del sistema nervoso centrale (CNS), bilancia lo stato di base dell'acido sistemico, fornisce nutrienti alle cellule neuronali e gliali, funziona come sistema linfatico per il SNC e trasporta ormoni, neurotrasmettitori, citochine e altri neuropepti in tutto il CNS1. Così, poiché la composizione csF riflette l'attività del SNC, questo fluido offre un prezioso, anche se indiretto, accesso per caratterizzare lo stato fisiologico e patologico del ....
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Protocollo
Tutto il lavoro sugli animali utilizza protocolli esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Geisel School of Medicine di Dartmouth.
1. Raccolta di fluidi
NOTA: sono necessari sia il siero che il CSF. Due protocolli per ogni raccolta di fluidi sono necessari per la sopravvivenza e necropsia.
- Raccolta di siero e CSF con procedure di sopravvivenza
NOTA: Per la raccolta dei fluidi di sopravvivenza, la raccolta del siero dovrebbe precedere la raccolta di CSF in quanto è una procedura meno invasiva. Il CSF deve essere ottenuto entro una settimana dall'estrazione d....
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Risultati
Questo esperimento rappresentativo mirava a confrontare la sintesi intratecala di IgG in due modelli di roditori clinicamente rilevanti della sclerosi multipla (MS): il PLP139-151-indotta recissa sperimentale di encefalomiesi (R-EAE) e la progressiva cronica, La malattia demielinante indotta dal virus dell'encefalomielisi del Telemanolio (TMEV-IDD). R-EAE è un modello utile per comprendere la recidiva delle MS, mentre il modello TMEV-IDD è dotato di MS19progressivo cronico.
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Discussione
I metodi quantitativi per la valutazione delle maggiori concentrazioni di proteine CSF sono strumenti utili per la caratterizzazione dello stato fisiologico e patologico del SNC. Tuttavia, al di là della quantificazione affidabile dei livelli di proteine CSF, il rilevamento delle proteine CSF richiede un'espressione dei risultati che discriminano tra le frazioni derivate dal sangue e il SNC nel CSF. Tuttavia, ad oggi, i saggi di quantificazione delle proteine comunemente utilizzati non consentono la discriminazione tra i.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il personale del Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) di Dartmouth per la cura esperta dei topi utilizzati per questi studi. Il Fondo di Ricerca Bornstein ha finanziato questa ricerca.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa da insulina da 1 mL | BD | 329650 | |
| Siringa da 1 mL | BD | 329622 | |
| ago da 25 gauge | BD | 305122 | |
| Siringa da 3 mL | BD | 309582 | |
| ago da insulina da 30 gauge | BD | 305106 | |
| Tamponi assorbenti | Qualsiasi marca | ||
| Acepromazina | Patterson Vet Supply Inc | ||
| BioPlex Rondella magnetica portatile | BioRad | 171020100 | Magnete |
| BioPlex MAGPIX Lettore multiplex | BioRad | 171015001 | |
| BioPlex Pro Piastre a fondo piatto BioRad | 171025001 | ||
| Anticorpo di rilevamento biotinilato | Qualsiasi fonte | L'anticorpo deve essere diretto contro le specie di la proteina di interesse. | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | A4503 | |
| Buprenorfina cloridrato | PAR Farmaceutico | NDC 42023-179-05 | |
| Tubi capillari | Strumento Sutter | B100-75-10 | OD: 1,0 mm, ID: 0,75 mm Vetro borosilicato 10 cm; tirato su Bunsen per ridurre le dimensioni dell'ID. |
| Provetta da centrifuga, 0,2 mL | VWR | 20170-012 | |
| Provetta da centrifuga, 0,5 mL | VWR | 87003-290 | |
| Provetta da centrifuga, 1,5 mL | VWR | 87003-294 | |
| Diacetato di clorexidina | Nolvasan | E004272 | |
| Puntali per pipette monouso | Qualsiasi marca | ||
| Barre auricolari | KOPF Instruments | 1921 o 1922 | |
| Etanolo | Kopter | V1001 | |
| Congelatore | VWR | VWR32086A | |
| Garza | Medline | NON25212 | |
| Termoforo | Sunbeam | XL King Size SoftTouch, 4 impostazioni di calore con spegnimento automatico, verde acqua, camera di induzione da 12 pollici x 24 pollici | |
| VETEQUIP | |||
| Isoflurane | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
| Ketamina (KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
| MagPlex Microsfere (accoppiate ad anticorpi) | BioRad | Agitatore per micropiastre a sfere magnetiche accoppiate ad anticorpi | |
| Microdivaricatori | Southwest Scientific | SBT1500 | |
| Carfill | Quality | ACD-010 | Blunt - 1 mm |
| Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
| MilliPlex MAP Isotipizzazione delle immunoglobuline del mouse Pannello di perline magnetiche | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | Kit commerciale per la quantificazione tramite Luminex di un pannello di isotipi e sottoclassi di immunoglobuline nei fluidi di topo. |
| Kit ELISA per la cattura dell'albumina di topo | Novus Biological | NBP2-60484 | Kit commerciale per la quantificazione tramite ELISA dell'albumina nei fluidi di topo. |
| Pipetta multicanale | Eppendorf | 3125000060 | |
| Tamponi non sterili | MediChoice | WOD1002 | Necessità di sterilizzazione in autoclave |
| Ossigeno | AIRGAS | OX USPEA | |
| Pasteur Pippettes | Fisher | 13-678-20A | 5 e 3/4" |
| Sutura PDS con ago monouso, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 Taglio inverso, 18" |
| PE-Streptavidina | BD Biosciences | 554061 | |
| Pipettatori | Eppendorf | Research seriers | |
| Tubi | |||
| Centrifuga refrigerata | Coltro Beckman | ALLEGRA X-12R | |
| Scala | Uline | H2716 | |
| Piuma | di bisturiEF7281 | ||
| Rasoio | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
| Proteine standard | Qualsiasi fonte | La scelta migliore per uno standard di riferimento è una concentrazione purificata e nota della proteina di interesse. | |
| Strumento stereotassico | KOPF Instruments Modello | 900LS | Accessori standard |
| Sterile 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Soluzione salina sterile | Baxter | 0338-0048-02 | Irrigazione con cloruro di sodio allo 0,9 |
| Forcipe chirurgica USP curva, 7 (2) | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Forbici chirurgiche | Fine Science Tools | 14094-11 | Vaporizzatore 25x in acciaio inox |
| + Flussometro | Moduflex Anhestesia Instruments | ||
| Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
| Cuscinetto riscaldante | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
| Sonicatore d'acqua | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
| Xylazine | Patterson Vet Supply Inc |
Riferimenti
- Whedon, J. M., Glassey, D. Cerebrospinal fluid stasis and its clinical significance. Alternative Therapies in Health and Medicine. 15 (3), 54-60 (2009).
- Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M.
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