Microdissezione laser di cattura della cartilagine embrionale del topo e dell'osso per l'analisi dell'espressione genica

Meng Wu; Divya Kriti; Harm van Bakel; Ethylin  Wang Jabs; Greg Holmes

doi:10.3791/60503

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Articolo metodologico

Microdissezione laser di cattura della cartilagine embrionale del topo e dell'osso per l'analisi dell'espressione genica

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DOI:

10.3791/60503

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18 dicembre 2019

Meng Wu¹ , Divya Kriti¹ , Harm van Bakel¹^,² , Ethylin Wang Jabs¹ , Greg Holmes¹

¹Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, ²Icahn Institute for Data Science and Genomic Technology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive la microdissezione di cattura laser per l'isolamento della cartilagine e dell'osso da sezioni fresche congelate dell'embrione di topo. La cartilagine e l'osso possono essere rapidamente visualizzate mediante colorazione viola cresilio e raccolte proprio per produrre RNA di alta qualità per l'analisi trascrittomica.

Abstract

La microdissezione di cattura laser (LCM) è un potente strumento per isolare specifici tipi di cellule o regioni di interesse da tessuti eterogenei. La complessità cellulare e molecolare degli elementi scheletrici aumenta con lo sviluppo. L'eterogeneità dei tessuti, come l'interfaccia di elementi cartilanei e ossei tra loro o con tessuti circostanti, è un ostacolo allo studio dello sviluppo della cartilagine e dell'osso. Il nostro protocollo fornisce un metodo rapido di elaborazione dei tessuti e l'isolamento della cartilagine e dell'osso che produce RNA di alta qualità per l'analisi dell'espressione genica. I tessuti congelati freschi di embrioni di topo sono sezionato e breve colorazione viola cresyl viene utilizzato per visualizzare la cartilagine e le ossa con colori distinti dai tessuti circostanti. I vetrini vengono quindi rapidamente disidratati e la cartilagine e l'osso vengono successivamente isolati dalla LCM. La minimizzazione dell'esposizione a soluzioni acquose durante questo processo mantiene l'integrità dell'RNA. La cartilagine e l'osso mandibolare di Mouse Meckel a E16.5 sono stati raccolti con successo e l'analisi dell'espressione genica ha mostrato l'espressione differenziale dei geni marcatori per osteoblasti, osteociti, osteoclasti e condrociti. L'RNA di alta qualità è stato anche isolato da una serie di tessuti ed ere embrionali. Questo protocollo descrive in dettaglio la preparazione del campione per LCM, tra cui crioincorporando, sezionamento, colorazione e disidratazione dei tessuti freschi congelati, e un preciso isolamento della cartilagine e dell'osso da parte di LCM, con conseguente RNA di alta qualità per l'analisi trascrittomica.

Introduzione

Il sistema muscolo-scheletrico è un sistema multicomponente composto da muscoli, tessuto connettivo, tendine, legamento, cartilagine e ossa, innervato dai nervi e vascolarizzato dai vasi sanguigni¹. I tessuti scheletrici si sviluppano con una crescente eterogeneità cellulare e complessità strutturale. Cartilagine e ossa si sviluppano dallo stesso lignaggio dell'osteochondroprogenitor e sono altamente correlati. La cartilagine embrionale e l'osso si sviluppano in associazione con muscoli, nervi, vasi sanguigni e mesenchyme indifferenziato. La cartilagine può anche essere circondata da ossa, come la cartilagine di Meckel e la cartilagine condilar....