Articolo metodologico

Microdissezione laser di cattura della cartilagine embrionale del topo e dell'osso per l'analisi dell'espressione genica

DOI:

10.3791/60503

⸱

18 dicembre 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Icahn Institute for Data Science and Genomic Technology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive la microdissezione di cattura laser per l'isolamento della cartilagine e dell'osso da sezioni fresche congelate dell'embrione di topo. La cartilagine e l'osso possono essere rapidamente visualizzate mediante colorazione viola cresilio e raccolte proprio per produrre RNA di alta qualità per l'analisi trascrittomica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microdissezione di cattura laser (LCM) è un potente strumento per isolare specifici tipi di cellule o regioni di interesse da tessuti eterogenei. La complessità cellulare e molecolare degli elementi scheletrici aumenta con lo sviluppo. L'eterogeneità dei tessuti, come l'interfaccia di elementi cartilanei e ossei tra loro o con tessuti circostanti, è un ostacolo allo studio dello sviluppo della cartilagine e dell'osso. Il nostro protocollo fornisce un metodo rapido di elaborazione dei tessuti e l'isolamento della cartilagine e dell'osso che produce RNA di alta qualità per l'analisi dell'espressione genica. I tessuti congelati freschi di embrioni di topo sono sezionato e breve colorazione viola cresyl viene utilizzato per visualizzare la cartilagine e le ossa con colori distinti dai tessuti circostanti. I vetrini vengono quindi rapidamente disidratati e la cartilagine e l'osso vengono successivamente isolati dalla LCM. La minimizzazione dell'esposizione a soluzioni acquose durante questo processo mantiene l'integrità dell'RNA. La cartilagine e l'osso mandibolare di Mouse Meckel a E16.5 sono stati raccolti con successo e l'analisi dell'espressione genica ha mostrato l'espressione differenziale dei geni marcatori per osteoblasti, osteociti, osteoclasti e condrociti. L'RNA di alta qualità è stato anche isolato da una serie di tessuti ed ere embrionali. Questo protocollo descrive in dettaglio la preparazione del campione per LCM, tra cui crioincorporando, sezionamento, colorazione e disidratazione dei tessuti freschi congelati, e un preciso isolamento della cartilagine e dell'osso da parte di LCM, con conseguente RNA di alta qualità per l'analisi trascrittomica.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il sistema muscolo-scheletrico è un sistema multicomponente composto da muscoli, tessuto connettivo, tendine, legamento, cartilagine e ossa, innervato dai nervi e vascolarizzato dai vasi sanguigni1. I tessuti scheletrici si sviluppano con una crescente eterogeneità cellulare e complessità strutturale. Cartilagine e ossa si sviluppano dallo stesso lignaggio dell'osteochondroprogenitor e sono altamente correlati. La cartilagine embrionale e l'osso si sviluppano in associazione con muscoli, nervi, vasi sanguigni e mesenchyme indifferenziato. La cartilagine può anche essere circondata da ossa, come la cartilagine di Meckel e la cartilagine condilar all'interno dell'osso mandibolare. Questi tessuti sono associati anatomicamente e interagiscono tra loro attraverso segnali extracellulari durante lo sviluppo. Nello studio dell'espressione genica nello sviluppo della cartilagine e dell'osso, un ostacolo è l'eterogeneità delle strutture scheletriche composte da più tipi di tessuto. L'isolamento preciso del tessuto specifico di interesse è fondamentale per un'analisi trascrizionale di successo.

La microdissezione di cattura laser (LCM) è un potente strumento per isolare i tipi di cellule o le regioni di interesse all'interno di tessuti eterogenei, ed è riproducibile ed è sensibile al livello a singola cellula2. Può colpire e catturare con precisione le cellule di interesse per una vasta gamma di analisi a valle in trascrittomica, genomica e proteomica3,4. La qualità dell'RNA, del DNA o della proteina isolata può essere valutata con un bioanalisi o una piattaforma equivalente. Ad esempio, la qualità dell'RNA è indicata dal numero di integrità dell'RNA (RIN)5.

Qui, forniamo un protocollo per la rapida colorazione e isolamento della cartilagine e dell'osso da LCM da tessuti freschi congelati. Usiamo l'embrione di topo per dimostrare che questo protocollo produce RNA di alta qualità per la successiva analisi trascrittomica, come il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I tessuti dei topi sono stati ottenuti in conformità con la Guida Nazionale di Salute per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio, e i protocolli di studio sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso la Icahn School of Medicine del Monte Sinai.

1. Preparazione di fresco congelato Campione

  1. Dissezionare l'embrione o il tessuto di interesse. Incorporare il campione in uno stampo di incorporamento usa e getta con composto ottimale per la temperatura di taglio (OCT). Regolare l'orientamento del campione con una punta o un ago.
  2. Congelare rapidamente i campioni in un bagno di ghiaccio secco/metil-2-butane. Proseguire con il passo successivo o conservare a -80 gradi centigradi.
    NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

2. Criosezione per Laser Capture Microdissection

  1. Scongelare il criostato e pulire le superfici interne con il 70% di etanolo. Trattare la piastra anti-roll e un paio di pinze con agente di decontaminazione RNase. Impostare il criostato sulla temperatura di taglio desiderata (da -18 a -22 gradi centigradi). Preparare un contenitore scartato con ghiaccio secco, ponendo una lastra di foglio di alluminio sul ghiaccio secco per lo stoccaggio temporaneo dei vetrini di esempio sezionato durante la criosezione.
    ATTENZIONE: Il ghiaccio secco è estremamente freddo. Maneggiare sempre il ghiaccio secco con cura e indossare guanti isolati ogni volta che lo maneggia.
  2. Trasferire il campione fresco congelato in un secchio di ghiaccio secco. Posizionare uno strato di composto oct su un supporto di criostato e posizionare immediatamente il campione sopra lo OCT con una leggera pressione. Quando l'OCT è completamente congelato, fissare il supporto con il campione nel braccio di taglio criostato.
  3. Lasciare il campione nel criostato per 15 min per equilibrato alla temperatura di taglio.
  4. Sezionare il tessuto e raccogliere le fette su vetrini a membrana di polietilene naftalato (PEN) con uno spessore di 12 m. Allineare sezioni consecutive sulla membrana. Una volta completato uno scivolo, lasciare asciugare le sezioni per alcuni minuti e trasferire la diapositiva sulla lamina nel contenitore di ghiaccio secco fino a quando non vengono raccolti tutti i vetrini necessari.
  5. Conservare i vetrini a -80 gradi centigradi in una scatola di diapositive.
    NOT: Lo spessore della sezione è scelto per massimizzare la quantità di tessuto raccolto, consentendo un taglio efficiente del tessuto, e può variare a seconda del tessuto di interesse. Il protocollo può essere messo in pausa qui. Mantenere le diapositive libere dalla contaminazione da RNase. Evitare i cambiamenti di temperatura. Anche se i RIN di RNA dai vetrini immagazzinati per un massimo di 6 mesi possono ancora indicare un'alta qualità dell'RNA, si consiglia di utilizzare i vetrini il prima possibile.

3. Preparazione del campione per la microdissezione di cattura laser

  1. Preparare soluzioni per la colorazione e la disidratazione.
    1. Mettere 45 mL di 80% di etanolo in ciascuno dei tre tubi di centrifugazione da 50 mL sul ghiaccio. Etichettarli come #1, #2 e #3. Diluire l'etanolo con acqua libera RNase/DNase.
    2. Mettere sul ghiaccio 45 mL di 95% di etanolo in un tubo centrifuga 50 mL.
    3. Mettere sul ghiaccio 45 mL di 100% di etanolo in un tubo centrifuga di 50 mL.
    4. Mettere 45 mL di xilene in un tubo di centrifuga 50 mL a temperatura ambiente.
      ATTENZIONE: Xylene deve essere usato in una cappa di fumi.
  2. Scongelare brevemente uno slitta reCIzolo posizionandolo contro una mano guantata, quindi lavare due volte per 30 s ciascuno in 45 mL di etanolo 80% (#1 e #2) con agitazione in tubi di centrifuga 50 mL per rimuovere il OCT.
    NOT: È importante rimuovere lo Strumento di personalizzazione di Office prima della colorazione, per evitare che lo OCT si sciolse durante la colorazione oscuri le sezioni. Le pinze possono essere utilizzate per facilitare la rimozione dello Strumento di personalizzazione di Office che non viene lavato via dall'agitazione.
  3. Posare la diapositiva su un foglio di lamina di alluminio. Pipette 0,8 mL di 0,1% di violetta cresila nel 50% di etanolo sullo scivolo e macchia per 30 s. Lavare il vetrino in 45 mL dell'80% di etanolo (#3) per 30 s, quindi disidratare con passaggio per 30 s ciascuno a 45 mL di 95% di etanolo, 100% etanolo, e xilene in tubi centrifugati 50 mL.
  4. Resistere ai vetrini su un delicato tergicristallo per 5 min per drenare xilene e sezioni secche.
    NOT: I vetrini devono essere asciugati completamente prima di LCM.

4. Microdissection di cattura laser

NOT: Indossare guanti nitrile privi di polvere durante l'esecuzione di LCM.

  1. Accendere il microscopio LCM, il laser e il computer. Accedere al computer e avviare il software. Ruotare la chiave nella posizione "On" per avviare il laser. Quando la luce verde (Laser) è accesa, premere il pulsante rosso per attivare il laser, quindi la luce (Laser) diventa rossa per indicare che il laser è pronto per l'uso.
    NOT: Il laser ha bisogno di circa 10 min per riscaldarsi.
  2. Impostare i tubi di raccolta.
    1. Inserire il tappo di un tubo di reazione a catena di polimerasi (PCR) da 0,5 mL nel collettore.
      NOT: Scegliere il collettore corrispondente per i tubi PCR desiderati (0,2 o 0,5 mL).
    2. Pipette 50 - L di buffer di estrazione (fornito dal kit di isolamento RNA elencato nella Tabella dei Materiali) nel tappo del tubo di raccolta di 0,5 mL.
    3. Inserire il dispositivo di raccolta nel microscopio.
    4. Nella finestra Cambia dispositivo raccoglitore, fare clic sul pulsante Sposta nel punto di riferimento per spostare il raccoglitore nel punto di riferimento (RP). Regolare lo stato attivo per visualizzare chiaramente il componente. Fare clic sulle frecce per spostare il componente al centro della vista.
  3. Caricare i vetrini dei campioni.
    1. Fare clic sul pulsante Sinistro Scarica nella barra degli strumenti per abbassare il supporto della diapositiva.
    2. Posizionare il vetrino nel supporto, con la sezione del tessuto rivolta verso il basso.
      NOT: Questo orientamento assicura che le sezioni di tessuto catturate cadano nel tappo del tubo di raccolta per gravità.
    3. Inserire nuovamente il supporto nello stage.
  4. Impostare i parametri laser.
    1. Selezionare l'opzione Controllo del menu Laser o fare clic sull'icona Laser.
    2. Regolare questi parametri come desiderato: Potenza, la potenza del laser; Aperture, la larghezza del laser; e Velocità, la velocità di taglio in modalità Disegno e Taglio.
      NOT: Testare il laser in un'area per interesse. Una maggiore potenza o un'apertura più grande facilita il taglio, ma provoca più danni alle cellule. Regolare la combinazione di potenza, apertura e velocità per ottenere un taglio efficiente e danni minimi al tessuto. Ad esempio, Potenza 40, Apertura 5 e Velocità 7 per il tessuto cartilagineo su una sezione di 12 m.
  5. Selezionare e tagliare le aree di interesse.
    1. Inizia con l'obiettivo 5x e trova le aree di interesse, quindi passa all'obiettivo (5x, 10x o 40x) che meglio mostra l'area di interesse.
      NOT: Dopo la colorazione viola cresil, le cartilagini sono macchie magenta e i tessuti mineralizzati appaiono marroni o neri, distinguibili dagli altri tessuti. Le immagini possono essere salvate utilizzando Salva immagine con nome dal menu File.
    2. Scegliere il tubo per la raccolta (A, B, C, D) facendo clic sul contrassegno nel raccoglitore.
    3. Scegliere Sposta e taglia o Disegna e taglia. In modalità Sposta e taglia, il campione viene tagliato manualmente, utilizzando il mouse o la penna touch-screen per disegnare le forme a mano libera. In modalità Disegno e Taglio, le forme possono essere disegnate a mano libera con il mouse o la penna touchscreen per il taglio successivo. Fare clic sul pulsante Avvia taglio per avviare il taglio laser.
    4. Una volta completato il taglio, il tessuto bersaglio con membrana PEN rientra nel tappo del tubo di raccolta per gravità. Ripetere la ripetizione 4.5 per raggruppare più aree di interesse, se necessario.
      NOT: La ripetizione di tagli o l'aumento di Potenza o Apertura possono essere necessari se il tessuto non cade nel tappo del tubo di raccolta a causa di un taglio incompleto. L'osso mineralizzato (marrone o nero) non può essere tagliato direttamente dal laser.
  6. Scaricare il collettore e chiudere con attenzione il tubo PCR. Mettere i tessuti microdispiantati nel ghiaccio secco. Proseguire con il passo successivo o conservare a -80 gradi centigradi.
    NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Ripetere da 4.2 a 4.6 per il campione successivo.

5. Lisi dei tessuti microdisseci e isolamento dell'RNA

  1. Scongelare i tessuti microabpati a temperatura ambiente. Centrifuga brevemente e incubare i campioni per 30 min a 42 gradi centigradi.
  2. Dopo l'incubazione, far girare il buffer di lisi verso il basso nel tubo PCR da 0,5 mL. Eseguire il trattamento DNase e l'estrazione dell'RNA utilizzando un kit di isolamento RNA (vedere la Tabella dei materiali)seguendo le istruzioni del produttore.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sezioni coronali di tessuti murini congelati freschi a E16.5 sono stati utilizzati per dimostrare l'isolamento e la raccolta della cartilagine di Meckel (MC), della cartilagine condilare e dell'osso mandibolare di LCM. Gli embrioni di topo all'E16.5 sono stati sezionati e incorporati in stampi criogenici con composto oct. I campioni negli stampi sono stati rapidamente congelati in un ghiaccio secco e in un bagno di metile-2-butano e conservati a -80 gradi centigradi.

Per dimostrare la colorazi...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LCM consente l'isolamento di popolazioni cellulari arricchite o omogenee da tessuti eterogenei. I suoi vantaggi includono la cattura rapida e precisa delle cellule nel loro contesto in vivo, mentre i potenziali svantaggi includono che richiede tempo, costoso e limitato dalla necessità per l'utente di riconoscere sottopopolazioni distinte all'interno di un campione specificato30. Questo protocollo fornisce dettagli di LCM della cartilagine embrionale e dell'osso del topo, evidenziando l'us...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Dental and Craniofacial Research (R01DE022988) e dall'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (P01HD078233). Gli autori ringraziano il Biorepository e Pathology Core per l'accesso alla piattaforma Leica LMD 6500 presso la Icahn School of Medicine del Monte Sinai.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Bioanalizzatore 2-metilbutanoThermoFisher ScientificO3551-4
AgilentG2939BA
Provette da centrifugaThermoFisher Scientific339653coniche sterili in polipropilene, 50 mL
Cresil violetto acetatoSigma-AldrichC5042
CriostatoLeica BiosystemsCM3050 S
Tergicristallo per attività delicateThermoFisher Scientific06-666
Stampo per inclusione monousoThermoFisher Scientific1220
Acqua distillataInvitrogen10977-015Senza DNasi/RNasi
Etanolo, assoluto (200 proof)ThermoFisher ScientificBP2818
Vetrinoa membrana in vetro PEN per biologia molecolareLeica Microsystems11505158
sistema LCMLeica MicrosystemsLeica LMD6500
Vetro di copertura per microscopioThermoFisher Scientific12-545FP
Vetrini per microscopioThermoFisher Scientific12-550-15
OCT compostoMicroscopia elettronica Sciences102094-106
Provetta per PCR con tappo piatto, 0,5 mLAxygenPCR-05-CProvette di raccolta LCM
Terreno di montaggio permanentedell'RNA H-5000Vector Laboratories
ThermoFisher ScientificKIT0204
Agente decontaminante con RNasiSigma-AldrichR2020Agente decontaminante con RNasi per la pulizia delle superfici
XileneSigma-Aldrich214736
Provetta da centrifuga Kit di isolamento

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
  2. Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139(2016).
  3. Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of Biomolecular Techniques. 21 (3), 120-125 (2010).
  4. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  5. Schroeder, A., Mueller, O., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  6. Motch Perrine, S. M., Wu, M., et al. Mandibular dysmorphology due to abnormal embryonic osteogenesis in FGFR2-related craniosynostosis mice. Disease Models & Mechanisms. 12 (5), (2019).
  7. Holmes, G., O'Rourke, C., et al. Midface and upper airway dysgenesis in FGFR2-craniosynostosis involves multiple tissue-specific and cell cycle effects. Development. 145 (19), (2018).
  8. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
  9. Tromp, G., Kuivaniemi, H., et al. Structure of a full-length cDNA clone for the preproα1(I) chain of human type I procollagen. Biochemical Journal. 253 (3), 919-922 (1988).
  10. De Wet, W., Bernard, M., et al. Organization of the human pro-alpha 2(I) collagen gene. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16032-16036 (1987).
  11. Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
  12. Toyosawa, S., Shintani, S., et al. Dentin matrix protein 1 is predominantly expressed in chicken and rat osteocytes but not in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (11), 2017-2026 (2001).
  13. Guo, D., et al. Identification of osteocyte-selective proteins. Proteomics. 10 (20), 3688-3698 (2010).
  14. Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., Karsenty, G. Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 89 (5), 747-754 (1997).
  15. Nakashima, K., Zhou, X., et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108 (1), 17-29 (2002).
  16. Termine, J. D., et al. Osteonectin, a bone-specific protein linking mineral to collagen. Cell. 26 (1), 99-105 (1981).
  17. Baldwin, C. T., Reginato, A. M., Prockop, D. J. A new epidermal growth factor-like domain in the human core protein for the large cartilage-specific proteoglycan. Evidence for alternative splicing of the domain. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 15747-15750 (1989).
  18. Strom, C. M., Upholt, W. B. Isolation and characterization of genomic clones corresponding to the human type II procollagengene. Nucleic Acids Research. 12 (2), 1025-1038 (1984).
  19. Ninomiya, Y., Olsen, B. R. Synthesis and characterization of cDNA encoding a cartilage-specific short collagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 81 (10), 3014-3018 (1984).
  20. Muragaki, Y., Mariman, E. C. M., et al. A mutation in the gene encoding the alpha 2 chain of the fibril-associated collagen IX, COL9A2, causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2). Nature Genetics. 12 (1), 103-105 (1996).
  21. Brewton, R. G., Wood, B. M., et al. Molecular cloning of the alpha 3 chain of human type IX collagen: linkage of the gene COL9A3 to chromosome 20q13.3. Genomics. 30 (2), 329-336 (1995).
  22. Newton, G., Weremowicz, S., et al. Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics. 24 (3), 435-439 (1994).
  23. Hiraki, Y., Mitsui, K., et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. European Journal of Biochemistry. 260 (3), 869-878 (1999).
  24. Smits, P., Li, P., et al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Developmental Cell. 1 (2), 277-290 (2001).
  25. Hayman, A. R., Jones, S. J., et al. Mice lacking tartrate-resistant acid phosphatase (Acp 5) have disrupted endochondral ossification and mild osteopetrosis. Development. 122 (10), 3151-3162 (1996).
  26. Dai, X. -M., Ryan, G. R., et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 99 (1), 111-120 (2002).
  27. Gowen, M., Lazner, F., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
  28. Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F. P., Teitelbaum, S. L. c-Fms and the αvβ3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 749-758 (2003).
  29. Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201-209 (2002).
  30. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. 11723, 1-17 (2018).
  31. Goldsworthy, S. M., Stockton, P. S., Trempus, C. S., Foley, J. F., Maronpot, R. R. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Molecular Carcinogenesis. 25 (2), 86-91 (1999).
  32. Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
  33. Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized method for robust transcriptome profiling of minute tissues using laser capture microdissection and low-input RNA-seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185(2017).
  34. Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
  35. Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A stainless protocol for high quality RNA isolation from laser capture microdissected Purkinje cells in the human post-mortem cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
  36. Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11 (95), (2010).
  37. Takahashi, N., Tarumi, W., Hamada, N., Ishizuka, B., Itoh, M. T. Cresyl violet stains mast cells selectively: Its application to counterstaining in immunohistochemistry. Zoological Science. 34 (2), 147-150 (2017).
  38. Sheldon, A. R., Almli, L., Ferriero, D. M. Copper/zinc superoxide dismutase transgenic brain in neonatal hypoxia-ischemia. Methods in Enzymology. 353, 389-397 (2002).
  39. Kolijn, K., Van Leenders, G. J. L. H. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Research Notes. 9, 17(2016).
  40. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  41. Filliers, M., et al. Laser capture microdissection for gene expression analysis of inner cell mass and trophectoderm from blastocysts. Analytical Biochemistry. 408 (1), 169-171 (2011).
  42. Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: Should an ultraviolet or infrared laser be used? Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
  43. Ayturk, U. RNA-seq in skeletal biology. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 178-185 (2019).
  44. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  45. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  46. Chen, J., et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature Protocols. 12 (3), 566-580 (2017).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Isolamento del tessuto osseoColorazione con cresyl violettoPreservazione dell integrit dell RNATecnica di criosezionamentoProtocollo di disidratazione del tessutoCartilagine di MeckelOsso mandibolare

Articoli correlati