Imaging Dpp Release da un disco ala Drosophila

Sommario

La tempistica dell'esposizione ai ligandi può influire sulle loro conseguenze di sviluppo. Qui mostriamo come visualizzare l'immagine di una proteina morfogenetica ossea della Drosophila (BMP) chiamata Dpp dalle cellule del disco alare.

Abstract

La superfamiglia trasformante Growth Factor-beta (TGF-z) è essenziale per il patterning embrionale precoce e lo sviluppo di strutture adulte in organismi multicellulari. La superfamiglia TGF-z comprende la proteina morfogenetica ossea (BMP), gli Activins, i fattori di crescita e differenziazione e i Nodali. È noto da tempo che la quantità di ligando esposto alle cellule è importante per i suoi effetti. Si pensava che i gradienti di concentrazione a lungo raggio fossero un modello embrionale. Tuttavia, recentemente è diventato chiaro che la tempistica dell'esposizione a questi ligandi è importante anche per le loro conseguenze trascrizionali a valle. Un ligando di superfamiglia TGF -z non può avere una conseguenza di sviluppo fino a quando non viene rilasciato dalla cella in cui è stato prodotto. Fino a poco tempo fa, era difficile determinare quando questi ligando sono stati rilasciati dalle cellule. Qui mostriamo come misurare il rilascio di un BMP Drosophila chiamato Decapentaplegic (Dpp) dalle celle del primordium o disco alare. Questo metodo potrebbe essere modificato per altri sistemi o legature di segnalazione.

Introduzione

Le proteine morfogenetiche ossee (BMP) sono essenziali per l'embriogenesi precoce e la modellazione di strutture adulte. I BMP sono prodotti e secreti per influenzare la trascrizione dei geni bersaglio necessari per la crescita e la differenziazione cellulare nelle cellule che rispondono. Decapentaplegic (Dpp) è un omologo di Drosophila di BMP4 che è importante per lo sviluppo di strutture embrionali e adulte come l'ala^1,2,3,4. Diversi gruppi si sono concentrati sul ruolo del Dpp nel patterning adult ole di mosca perché 1) le ali sono costituite da due fogli di epitelia trasparenti con un modello di venazione coerente che può essere facilmente valutato; 2) i dischi ali sono anche ragionevolmente piatti, possono essere coltivati al di fuori della larva e sono semplici da immaginare e quantificare le differenze di modello; e 3) lo sviluppo del modello alare è sensibile al Dpp in modo tale che piccole perturbazioni nel percorso avranno un impatto sul modello di venazione dell'ala.

Dpp è prodotto in celle situate nel contorno anteriore/posteriore del disco alare^5,6,7,8. Dpp si lega a un complesso di tipo 1 e tipo 2 serine / preonina recettori della chinasi^9,10. Al momento dell'attacco Dpp, il recettore di tipo 2 fa fosforolaili del recettore di tipo 1 che poi fa fosfolato Madri contro Dpp (Mad), un omologa Smad 1/5/8. Phosphorylated SMAD recluta un'ulteriore co-Smad (Medea), che le consente di entrare nel nucleo dove regola i geni bersaglio, portando a effetti a valle come la proliferazione o la differenziazione^4,11.

Recentemente, il Bates Lab ha dimostrato che il rilascio improprio di Dpp all'interno del disco alare può portare a una diminuzione del fosfororylazione pazza, alla riduzione dell'espressione genica bersaglio e ai difetti di patterning^12,13. Diversi canali ionici influenzano lo sviluppo dell'ala della Drosophila e delle strutture associate^14,15. Questi canali ionici potrebbero anche essere coinvolti nel rilascio di Dpp. Nel determinare il meccanismo di rilascio morfogeno, è importante che sia disponibile un metodo per visualizzare gli eventi di rilascio.

I dottori Aurelio Teleman e Stephen Cohen hanno creato una proteina di fusione Dpp-GFP che è in grado di salvare la perdita di Dpp, il che significa che è biologicamente attiva e viene rilasciata in modo biologicamente rilevante¹⁶. Qui, descriviamo come visualizziamo gli eventi di rilascio Dpp utilizzando questo Dpp-GFP. Questa proteina di fusione è particolarmente utile perché la GFP è sensibile al pH in modo tale che quando è in vescicoli acidi, la fluorescenza viene spenta¹⁷. Pertanto, quando una proteina etichettata con GFP viene rilasciata da una vescica nell'ambiente extracellulare più neutro, l'intensità della fluorescenza GFP aumenta^{di 17}. Abbiamo sfruttato la sensibilità al pH di GFP per determinare se Dpp-GFP risiede in vesciche acide. Abbiamo immaginato dischi alari che esprimono Dpp-GFP prima e dopo l'aggiunta di cloruro di ammonio, che neutralizza i compartimenti intracellulari vescicoli¹⁸. Abbiamo trovato un aumento significativo della fluorescenza della puncora dopo l'aggiunta di cloruro di ammonio, suggerendo che il Dpp-GFP intracellulare viene spento prima dell'aggiunta di cloruro di ammonio¹⁸. Concludiamo che il Dpp-GFP intracellulare risiede in compartimenti acidi legati alla membrana, come le vescicle, ed è invaloreso dopo l'aggiunta di cloruro di ammonio per neutralizzare il pH dei compartimenti intracellulari¹⁸. Questo rende l'imaging live di Dpp-GFP una tecnica utile per visualizzare la dinamica di Dpp nel disco alare della Drosophila quando viene rilasciato dai compartimenti acidi nell'ambiente extracellulare.

Qui descriviamo il metodo che usiamo per visualizzare gli eventi di rilascio Dpp utilizzando Dpp-GFP. Dpp-GFP può essere espresso nel suo modello nativo nei dischi alari della Drosophila utilizzando il sistema UAS-GAL4¹⁹. Questo è il metodo utilizzato per determinare che i canali Irk influiscono sulla versione¹⁸di Dpp. Abbiamo convalidato il metodo con z-stack di imaging live. Non vediamo Puncta Dpp-GFP muoversi all'interno del piano di messa a fuoco in serie temporali se abbiamo acquisito in un piano di messa a fuoco. Inoltre non vediamo il movimento di Puncta Dpp-GFP se abbiamo immagine in uno z-stack. Concludiamo che la puncta Dpp-GFP vista con questo metodo sono eventi di rilascio piuttosto che movimento di vescicoli intracellulare. Questo metodo di imaging live di Dpp-GFP potrebbe essere potenzialmente utilizzato per testare altri modificatori putatti del rilascio di Dpp per il loro impatto sulla dinamica Dpp o potrebbe essere modificato per esaminare le dinamiche di altri ligandi

Protocollo

1. Raccolta di uova per generare larve per la dissezione

1. Attraversare 30-40 donne vergini Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu vola a 10-15 maschi Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu.
   NOT: Qualsiasi due genotipi contenenti Dpp-GAL4 e UAS-Dpp-GFP possono essere utilizzati a condizione che gli bilanciatori abbiano marcatori larvali che consentono la selezione della progenie appropriata durante la fase larvale.
2. Per raccogliere le uova, capovolgere le mosche incrociate in una fiala fresca di cibo e permettere loro di posare per 3-4 h prima di rimuoverle dalla fiala. Per incoraggiare la deposizione delle uova, una piccola quantità di pasta di lievito fatta di lievito granulato mescolato con una piccola quantità di acqua può essere aggiunto alla parte superiore del cibo prima che le mosche vengono introdotte nella fiala. Lo stesso set di mosche incrociate può essere mantenuto e utilizzato per un massimo di 7 giorni di collezioni di uova.
   NOT: Qualsiasi ricetta standard di farina di mais della Drosophila dovrebbe essere accettabile. Utilizzato qui è la ricetta alimentare descritta da Hazegh e Reis²⁰.
3. Tenere le fiale di raccolta delle uova a 25 gradi centigradi per circa 144 h fino a quando le larve sono al terzo stadio instar (wandering).
4. Per selezionare le larve appropriate per la dissezione (quelle che esprimono sia Dpp-GAL4 che UAS-Dpp-GFP) scelgono prima le larve che non sono Tb. Queste larve saranno di lunghezza normale piuttosto che corte e grasse.
5. Tra le larve non Tb ci saranno larve che esprimeranno CyO-GFP e larve che esprimono Dpp-GFP. Per selezionare le larve che esprimono Dpp-GFP, visualizzale sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza. Mentre sia Dpp-GFP che CyO-GFP che esprimono larve avranno una certa fluorescenza GFP, le larve che esprimono Dpp-GFP possono essere distinte in quanto la GFP è limitata ai dischi ali e la fluorescenza è molto meno luminosa delle larve che esprimono CyO-GFP. Selezionare queste larve meno luminose per la dissezione.

2. Preparazione della soluzione per l'imaging e la dissezione larvale

1. Per l'imaging dal vivo dei dischi ali, preparare i supporti HL3 modificati²¹ (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,5 mM CaCl₂ disidratarsi, 4 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 5 mM trehalose dyhydrate, 115 mM di saccarosio, 5 mM HEPES). Questo supporto consente di mantenere in vita il disco alare per l'imaging²¹.
2. Regolare il pH a 7,1 utilizzando HEPES e filtrare con un filtro di 0,22 m. Utilizzare questo supporto sia per le dissezioni del disco alache che come supporto di montaggio per l'imaging live.

3. Preparazione dei vetrini per il montaggio del disco dell'ala

1. Posizionare due pezzi di nastro a doppio lato incolore in modo ampio su un vetrino del microscopio, lasciando uno spazio di circa 5 mm tra di loro. I pezzi di nastro dovrebbero essere abbastanza lunghi che le estremità del nastro giacciono a filo con i bordi del vetrino del microscopio.
2. Utilizzare un bordo piatto (ad esempio l'estremità della maniglia di una coppia di pinze dissetiche) per premere il nastro saldamente sulla diapositiva in modo che nessun supporto possa penetrare sotto di esso.
3. Posizionare 25 l di supporti HL3 modificati tra i due pezzi di nastro adesivo. Il disco alare sarà montato in questa goccia di supporti tra pezzi di nastro in modo che il nastro impedisca alla coverslip di schiacciare il disco (Figura 1A).

4. Dissezione e montaggio di dischi alari per l'imaging

1. Le larve di dissect nel supporto HL3 modificato preparato²⁶.
2. Larve lacrimano delicatamente a metà usando due coppie di pinze e scartano la metà posteriore della larva.
3. Afferra la metà centrale della larva con un paio di pinze e usa un altro paio di pinze chiuse per spingere i ganci della bocca nella larva fino a quando la larva non è completamente invertita.
4. I dischi ali possono essere trovati più facilmente cercando le curve strette nei due rami primari di colore più scuro della trachea che corrono lungo entrambi i lati delle larve. I dischi ali si trovano direttamente sotto queste curve nella trachea in una larva rovesciata.
5. Rimuovere delicatamente i dischi d'ala e trasferirli al supporto HL3 da 25 gradi sul vetrino preparato al microscopio. È importante assicurarsi che nessun pezzo di trachea sia lasciato attaccato ai dischi delle ali sezionate in quanto ciò può causare il galleggiamento dei dischi, rendendo difficile l'imaging.
6. Disporre il disco dell'ala in modo che il lato peripodico del sacchetto dell'ala sia rivolto verso l'alto dal vetrino del microscopio con il disco sdraiato (vedere Figura 1A,B).
7. Coprire il disco e il nastro dell'ala con una coverslip e sigillare la coverslip con smalto. Una volta che lo smalto è asciutto, procedere immediatamente ai passaggi di imaging riportati di seguito.

5. Rilascio Dpp di imaging

1. Immagina il disco dell'ala montato utilizzando un microscopio a scansione laser confocale con un obiettivo di olio 40x e un laser da 488 nm. Il Dpp-GFP dovrebbe apparire come una striscia di fluorescenza GFP lungo il centro del disco alare con piccolo puncta di Dpp-GFP essere rilasciato da questa striscia centrale di cellule.
2. Raccogli immagini a una velocità di 2 Hz per 2 min per visualizzare il rilascio di Dpp. Per ottenere risultati ottimali, impostare il laser su un'impostazione sufficientemente forte da ottenere un'immagine chiara delle celle che rilasciano Dpp per evitare lo sbiancamento eccessivo durante la raccolta delle immagini. Le immagini possono essere raccolte come una serie temporale che può quindi essere esportata come file AVI (nessuna compressione, 3 fotogrammi / s) per ottenere i file video della release Dpp.

Risultati

La figura 2 mostra i risultati rappresentativi dell'imaging in tempo reale di questo protocollo. Quando il protocollo ha successo, Dpp-GFP può essere visto come una striscia al centro del disco alare con nuclei visibili come cerchi non fluorescenti all'interno della regione Dpp-GFP (Figura 2). Rilascio Dpp-GFP è visibile come puncta fluorescente che appaiono e scompaiono. Abbiamo osservato la fluorescenza Dpp-GFP che appare e scompare nei corpi cellulari e lonta...

Discussione

BMP come Dpp fanno il loro impatto significativo quando legano un complesso di recettori legati alla membrana per causare una cascata di segnalazione intracellulare nelle cellule vicine o apparentemente lontane. Il laboratorio del Dr. Thomas Kornberg ha dimostrato che le cellule che producono le cellule di contatto del segnale Dpp che ricevono il segnale utilizzando strutture sottili filapodia basate su actin chiamati citonemi^15,24,25...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Lievito di birra	Red Star
CaCl2 diidrato	Fisher Scientific	C79-500
Vetrini coprioggetti	VWR	484-457
Nastro biadesivo	Scotch
Drosophila Agar Tipo II	Apex	66-104
Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu			Questo stock sarà presto disponibile presso il Bloomington Drosophila Stock Center
Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu			Questo stock sarà presto disponibile presso il Bloomington Drosophila Stock Center
Dumont Tweezers #5	World Precision Instruments	500233	Pinze per la dissezione
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
KCl	Fisher Scientific	AC193780010
Light Corn Syrup	Karo
Estratto di malto	Breiss
MgCl2	Fisher Scientific	AC223210010
Vetrini per microscopio	Sigma Aldrich	S8400
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
NaHCO3	RPI	S22060-1000.0
Smalto per unghie	Microscopia elettronica Scienze	72180
Acido propionico	VWR	U330-09
Farina di soia	ADM Ingredienti speciali	062-100
Saccarosio	Fisher Scientific	S5-3
Saccarosio	Fisher	S512
Tegosept	Genesee Scientific	20-259
Trealosio diidrato	Chem-Impex Internazionale, Inc.	00766
Farina di mais giallo Quaker
Zeiss LSM 780 microscopio confocale	Zeiss		Microscopio per imaging dal vivo
Microscopio Zeiss SteREO Discovery.V8 Microscopio	Zeiss		per dissezioni