La tempistica dell'esposizione ai ligandi può influire sulle loro conseguenze di sviluppo. Qui mostriamo come visualizzare l'immagine di una proteina morfogenetica ossea della Drosophila (BMP) chiamata Dpp dalle cellule del disco alare.
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Articolo metodologico
Imaging Dpp Release da un disco ala Drosophila
In questo articolo
Sommario
Abstract
La superfamiglia trasformante Growth Factor-beta (TGF-z) è essenziale per il patterning embrionale precoce e lo sviluppo di strutture adulte in organismi multicellulari. La superfamiglia TGF-z comprende la proteina morfogenetica ossea (BMP), gli Activins, i fattori di crescita e differenziazione e i Nodali. È noto da tempo che la quantità di ligando esposto alle cellule è importante per i suoi effetti. Si pensava che i gradienti di concentrazione a lungo raggio fossero un modello embrionale. Tuttavia, recentemente è diventato chiaro che la tempistica dell'esposizione a questi ligandi è importante anche per le loro conseguenze trascrizionali a valle. Un ligando di superfamiglia TGF -z non può avere una conseguenza di sviluppo fino a quando non viene rilasciato dalla cella in cui è stato prodotto. Fino a poco tempo fa, era difficile determinare quando questi ligando sono stati rilasciati dalle cellule. Qui mostriamo come misurare il rilascio di un BMP Drosophila chiamato Decapentaplegic (Dpp) dalle celle del primordium o disco alare. Questo metodo potrebbe essere modificato per altri sistemi o legature di segnalazione.
Introduzione
Le proteine morfogenetiche ossee (BMP) sono essenziali per l'embriogenesi precoce e la modellazione di strutture adulte. I BMP sono prodotti e secreti per influenzare la trascrizione dei geni bersaglio necessari per la crescita e la differenziazione cellulare nelle cellule che rispondono. Decapentaplegic (Dpp) è un omologo di Drosophila di BMP4 che è importante per lo sviluppo di strutture embrionali e adulte come l'ala1,2,3,4. Diversi gruppi si sono concentrati sul ruolo del Dpp nel patterning adult ole di mosca perché 1) le ali so....
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Protocollo
1. Raccolta di uova per generare larve per la dissezione
- Attraversare 30-40 donne vergini Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu vola a 10-15 maschi Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu.
NOT: Qualsiasi due genotipi contenenti Dpp-GAL4 e UAS-Dpp-GFP possono essere utilizzati a condizione che gli bilanciatori abbiano marcatori larvali che consentono la selezione della progenie appropriata durante la fase larvale. - Per raccogliere le uova, capovolgere le mosche incrociate in una fiala fresca di cibo e permettere loro di posare per 3-4 h prima di rimuoverle dalla fiala. Per incoraggiare la deposizione delle uova, una piccola quantità di pasta di li....
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Risultati
La figura 2 mostra i risultati rappresentativi dell'imaging in tempo reale di questo protocollo. Quando il protocollo ha successo, Dpp-GFP può essere visto come una striscia al centro del disco alare con nuclei visibili come cerchi non fluorescenti all'interno della regione Dpp-GFP (Figura 2). Rilascio Dpp-GFP è visibile come puncta fluorescente che appaiono e scompaiono. Abbiamo osservato la fluorescenza Dpp-GFP che appare e scompare nei corpi cellulari e lonta.......
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Discussione
BMP come Dpp fanno il loro impatto significativo quando legano un complesso di recettori legati alla membrana per causare una cascata di segnalazione intracellulare nelle cellule vicine o apparentemente lontane. Il laboratorio del Dr. Thomas Kornberg ha dimostrato che le cellule che producono le cellule di contatto del segnale Dpp che ricevono il segnale utilizzando strutture sottili filapodia basate su actin chiamati citonemi15,24,25.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo la dott.ssa Sarala Pradhan per aver lavorato su una versione precedente di questo protocollo. Vorremmo ringraziare NSF-IOS 1354282 per il finanziamento mentre abbiamo sviluppato questo protocollo. Ringraziamo NIH-NIDCR RO1DE025311 per aver finanziato il nostro laboratorio.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Lievito di birra | Red Star | ||
| CaCl2 diidrato | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Vetrini coprioggetti | VWR | 484-457 | |
| Nastro biadesivo | Scotch | ||
| Drosophila Agar Tipo II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | Questo stock sarà presto disponibile presso il Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | Questo stock sarà presto disponibile presso il Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Pinze per la dissezione |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Estratto di malto | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Vetrini per microscopio | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Smalto per unghie | Microscopia elettronica Scienze | 72180 | |
| Acido propionico | VWR | U330-09 | |
| Farina di soia | ADM Ingredienti speciali | 062-100 | |
| Saccarosio | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Saccarosio | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trealosio diidrato | Chem-Impex Internazionale, Inc. | 00766 | |
| Farina di mais giallo Quaker | |||
| Zeiss LSM 780 microscopio confocale | Zeiss | Microscopio per imaging dal vivo | |
| Microscopio Zeiss SteREO Discovery.V8 Microscopio | Zeiss | per dissezioni |
Riferimenti
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V.
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Ristampe e permessi
