Caratterizzazione funzionale di RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro e In Planta

La stragrande maggioranza dei legamenti di ubiquitina E3 appartiene a RING(Really Interesting New Gene)-tipo) -tipo. Il dominio RING-finger è stato originariamente identificato da Freemont et al. ¹ e funzionalmente descritto come un dominio che media^{l'interazione}proteina-proteina 2 . Il dito canonico RING è un tipo speciale di dominio di coordinamento dello zinco definito come una sequenza di consenso di otto Cis (C) e His (H) specificamente distanziati da altri residui di aminoacidi (X), C-X₂-C-X_9–39-C-X_1–3-H-X_2–3-C/H-X₂-C-X_4-48-C-X2-C. Due ioni di 2 o n² sono stabilizzati dai residui di nucleo C e H attraverso una topologia "cross-brace" univoca con C₁/C₂ e C/H₅/C_{6 che} coordinano i primi ioni n^2, mentre C₃/H₄ e C₇/C₈ legano il secondo (Figura 1A)^3,4. A seconda della presenza di C o H nel quinto sito di coordinamento di N^2,sono state definite due sottoclassi canoniche di proteine RING-finger: C3HC4 e C3H2C3 (rispettivamente RING-HC e RING-H2). Poiché il dominio RING della ligase elitazione e3 media l'interazione tra enzimi coniugati E2 e substrati, è stata dimostrata la mutazione di questi residui essenziali di C e H per interrompere l'attività delle ligase⁵. Sono state descritte altre cinque sottoclassi meno comuni di legamenti RING E3 (RING-v, RING-C2, RING-D, RING-S/T e RING-G)⁶. I legamenti di ubiquitina e3 di tipo RING possono essere ulteriormente suddivisi in semplici e complessi enzimi E3. La semplice singola sottounità RING E3 lega menti contengono sia il sito di riconoscimento del substrato che il dominio RING di associazione E2. Al contrario, la multisubunit RING-type E3 complesso substrato di reclutamento o media il legame del e2-ubiquitin intermedio al complesso E3. Il dominio RING Lys residue(s) che funge da sito di attacco di ubiquitina primaria per l'auto-ubiquitinazione potrebbe anche essere importante per l'attività di ligase E3.

Non tutte le proteine contenenti RING funzionano come legamenti E3. Pertanto, la previsione bioinformatica del dominio del dito DI RING e la capacità di ubiquitinazione proteica dipendente da E2 devono essere convalidate biochimicamente e collegate al ruolo biologico della proteina testata. Qui, descriviamo un protocollo passo-passo che illustra come rilevare e caratterizzare funzionalmente l'attività enzimatica dei legamenti di ubiquitina E3 di tipo RING, sia in vitro che in planta, attraverso un approccio di mutagenesi site-directed. I risultati rappresentativi di questa pipeline sono indicati per la ligase RHA1B di tipo RING. RHA1B è una proteina eflatrice prodotta dalla cisti parassitaria vegetale Globoderaa per sopprimere l'immunità delle piante e manipolare la morfologia delle cellule della radice vegetale. Per proteggersi dall'invasione patogena/parassita, le piante hanno sviluppato recettori immunitari di tipo di tipo "NB-LRR" che si prospettano recettori immunitari di tipo "gruppo" di nucleotidi e alle colonne sensibili che rilevano il sito di infezione per arrestare la colonizzazione dei patogeni. Uno di questi recettori immunitari è la proteina Gpa2 di patate che conferisce resistenza ad alcuni isolati di G. pallida (popolazioni di campo D383 e D372)⁷.

Utilizzando i protocolli presentati, è stato recentemente scoperto che RHA1B interferisce con la segnalazione del sistema immunitario delle piante in modo dipendente da E3 prendendo di mira l'immunorecettore Gpa2 della pianta per l'ubiquitinazione e la degradazione⁸.

1. Mutagenesi diretta al sito (Figura 1)

1. Identificare i Cis conservati e i suoi aminoacidi nel dominio RING (Figura 1A) e i primer di progettazione che portano il codone di sostituzione degli interessi affiancato da 15 coppie di basi su entrambi i lati del sito di mutazione (Figura 1B).
2. Introdurre la mutazione desiderata per amplificazione basata sulla PCR del plasmide che ospita il gene di interesse utilizzando primer mutageni e polimerasi di DNA ad alta fedeltà contenenti Pfu in 50 : L del volume totale di reazione PCR, come mostrato nella Tabella 1 e nella Tabella 2 secondo il protocollo del produttore.
3. Digerire ilDNA metilato e semimetilato dei genitori con l'aggiunta di 3 -L dell'enzima di restrizione DpnI direttamente alla reazione PCR (passaggio 1.2) e l'incubazione a 37 gradi centigradi per 2 h.
   NOTA: La metilazione è una modifica della proteina posttranziale che viene aggiunta al plasmide prodotto e isolato dai batteri. Nuove copie di plasmide generato da PCR mancano di metilazione, quindi, le nuove copie rimarranno intatte durante il trattamento DpnI.
4. Purificare i plasmidi mutagenizzati utilizzando un kit di estrazione del DNA commerciale basato sulla tecnologia della colonna di spin ed eluire il DNA con 50 gradi d'acqua.
5. Trasformare le cellule chimicamente competenti del DH5, con 0,5 litri del DNA plasmico mutagenizzato recuperato secondo il protocollo del produttore. In breve, incubare celle competenti con DNA sul ghiaccio per 30 min, poi riscaldarle per 20 s a 42 gradi centigradi, e mettere di nuovo i tubi sul ghiaccio per 2 min. incubare le cellule con 500 LL di supporti LB a 37 gradi centigradi per 1 h a 250 rpm e poi distribuirli su polpi selettivi.
6. Verificare la mutazione desiderata da Sanger sequenziando i plasmidi di DNA isolati da E. coli.

2. Purificazione delle proteine ricombinanti e analisi dell'ubiquitazione in vitro

1. Clonare il tipo selvaggio RING e i geni RING mutati di interesse nel vettore pMAL-c2 (seguire il protocollo del produttore; Tabella n. 3) fondere questi geni con il tag dell'epitopo MBP che permette la purificazione in un solo passaggio usando la resina di amilosio. Introdurre i costrutti risultanti nel ceppo E. coli BL21 come descritto al punto 1.5.
2. Coltivare il ceppo E. coli BL21 che ospita il costrutto desiderato in un mezzo liquido da 50 mL a 37 gradi centigradi per 2-3 h fino a raggiungere la fase logaritmica (OD₆₀₀ di 0,4–0,6).
3. Aggiungere IPTG a una concentrazione finale di 0,1-1 mM per indurre l'espressione della proteina ricombinante con etichettatura MBP di interesse e incubare la coltura di E. coli per 2-3 h a 28 gradi centigradi. Posizionare la coltura sul ghiaccio dopo l'incubazione.
   NOTA: Eseguire i passi 2.4–2.13 sul ghiaccio per proteggere le proteine dalla degradazione.
4. Per verificare l'efficienza di induzione, raccogliere 1,5 mL di cellule indotte, ruotarle verso il basso a 13.000 x g per 2 min, rimuovere il supernatante, e risospendere nuovamente le cellule in 20 :L di 2x SDS-PAGE buffer di carico (24 mM Tris-HCl pH 6.8, 0.8% SDS, 10% (v/v) glicerol, 4 mM DTT, 0.04% (w/v) bromopheno blu).
5. Far bollire i campioni per 5 min ed eseguirli su un gel 10% SDS-PAGE. Per valutare visivamente l'accumulo di proteina di fusione mbP (peso molecolare della proteina di interesse - 42,5 kDa MBP), macchiare il gel per 20 min agitando con buffer di colorazione Coomassie (50% di metanolo, 10% acido acetico, 0,1% Coomassie blu) e destaining con buffer di destaining (20% metanolo, 10% acido acetico).
6. Raccogliere le restanti cellule E. coli per centrifugazione a 1.350 x g per 6 min, eliminare il supernatore e risospendere nuovamente il pellet cellulare con 5 mL di buffer di colonna (20 mM Tris HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, inibitore proteasi batterica).
   NOTA: Questo è un buon posto per fermare il protocollo durante la notte. Le cellule congelate possono essere conservate fino a -20 gradi centigradi.
7. Abbattere le cellule di E. coli posizionando il tubo contenente i batteri in un bagno d'acqua ghiacciata e applicando 10 cicli di sonicazione: la sonicazione di 10 s al 30% dell'amplificatore seguito da 20 s si rompe.
8. Centrifuga a 13.000 x g a 4 gradi centigradi per 10 min e salvare il super-natante (estratto di greggio).
9. Preparare 500 l di resina di amilosia in un tubo da 15 mL. Lavare la resina aggiungendo 10 mL di buffer a colonna fredda e centrifugando a 1.800 x g, 4 gradi centigradi per 5 min. Fallo 2x.
10. Aggiungere 5 mL di estratto grezzo al tubo con la resina di amilosino e incubare pernottando a 4 gradi centigradi.
11. Centrifuga a 1.800 x g a 4 gradi centigradi per 5 min e scartare il supernatante.
12. Aggiungere 10 mL di buffer di colonna al pellet di resina e incubare per 20 min. Quindi centrifugare a 1.800 x g a 4 gradi centigradi per 5 min. Ripetere questo passaggio 2x.
13. Esolute la proteina di fusione con 0,5 mL di cuscinetto di colonna contenente 10 mM di maltosio incubando un campione per 2 h a 4 gradi centigradi. Centrifuga a 1.800 x g a 4 gradi centigradi per 5 min e raccogliere la proteina eluita. Ripetere questo passaggio 2x.
14. Dialisci 1 mL della frazione proteica contro il PBS freddo. Proteina artigliante in tubi monouso (10-20 - L) per evitare lo scongelamento e conservare a -80 gradi fino a quando necessario.
15. Misurare la concentrazione proteica utilizzando il prosaggio Bradford⁹.
16. Impostare la reazione di ubiquitinazione in vitro in un volume totale di 30 gradi mescolando fino a 40 ng di E1 (ad esempio, AtUBA1), 100 ng di E2 (ad esempio, AtUBC8, SlUBC1/4/6/7/12/13/17/20/22/27/32), 1g di tipo RINGP, 1 g di proteine di tipo RINGP, e 2 g di FLAG-Ub (o HA-Ub) nel buffer di ubiquitinazione (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 mM ATP, 5 mM MgCl₂, 30 mM di creatina fosfato, 50 g/mL di creatina fosforosi). Incubare il composto a 30 gradi centigradi per 2 h.
    NOTA: Premake 20x buffer di ubiquitinazione e conservarlo fino a -6 mesi a -20 gradi centigradi in piccoli aliquote per un singolo utilizzo. La creatina fosforokinase perde facilmente la sua attività enzimatica quando il buffer viene scongelato e congelato ripetutamente.
17. Terminare la reazione mescolando i 30 campioni ll con 7,5 xL di 5x buffer di carico SDS-PAGE (60 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 25% (v/v) glicerol, 10 mM DTT, 0,1% (w/v) bronofenolo blu) e bollente per 5 min.
18. Separare le proteine con il 7,5% di elettroforesi gel SDS-polyacrilimide (SDS-PAGE), quindi trasferire sulla membrana PDVF e rilevare l'ubiquitazione mediante gonfiore occidentale utilizzando l'anti-FLAG (o anti-HA).
19. Macchia rescherine la membrana PVDF con Coomassie blue per verificare l'uguale carico della proteina di tipo MBP-RING testata.

3. Agrobacterium- espressione proteica transitoria mediata nelle foglie di Nicotiana benthamiana e nell'assaggio di ubiquitinazione planta

1. Streak appropriato Agrobacterium tumefaciens ceppi recanti il gene di interesse epitope (ad esempio, HA-RHA1B, HA-RHA1B^C135S, HA-RHA1B^K146R, HA-Ub) e vettore vuoto come un controllo sul supporto LB contenente gli antibiotici di selezione appropriati.
2. Dopo 2 giorni di crescita a 28 gradi centigradi, raccogliere colonie singole e coltivarle in un mezzo liquido LB con gli antibiotici appropriati a 28 gradi centigradi/250 rpm per altri 24 h.
3. Trasferire 100 l di coltura agrobatterica a 3 mL di LB fresco con gli antibiotici appropriati e incubare la coltura per ulteriori 4-6 h a 28 gradi centigradi con rotazione (250 rpm) alla fase di crescita esponenziale tardiva.
4. Abbassare le cellule agrobatteriche a 1.800 x g per 6 min, eliminare il supernatante e risospendere le cellule con 3 mL di buffer di lavaggio (50 mM MES pH 5,6, 28 mM di glucosio, 2 mM NaH₂PO₄). Ripetere questo passaggio 2x.
5. Dopo il secondo lavaggio, risospendere le cellule nel buffer di induzione (50 mME MES pH 5,6, 28 mM di glucosio, 2 mM NaH₂PO_4, 200 acetosyringone, 37 mM NH₄Cl, 5 mM MgSO₄.7H₂O, 4 mM KCl, 18 .M FeSO₄.7H_2OM. Incubare le cellule con buffer di induzione per un ulteriore 10-12 h a 28 .
   NOTA: Acetosyringone induce il trasferimento T-DNA.
6. Centrifugare le cellule a 1.800 x g per 6 min, scartare il supernatante e risospendere nuovamente le cellule con 2 mL di buffer di infiltrazione (10 mM MES pH 5,5, 200 acetosyringone).
   NOTA: Se gli Agrobatteri si aggregano dopo l'incubazione con tampone di induzione, lasciare che le cellule aggregate affondino sul fondo del tubo lasciandolo sul banco per alcuni minuti e trasferire la chiara sospensione dell'Agrobacterium in un nuovo tubo prima di procedere con il passaggio 3.6.
7. Misurare la concentrazione di batteri utilizzando il valore OD₆₀₀ (la densità ottica ad assorbimento di 600 nm). Regolare i valori OD₆₀₀ in base a quelli desiderati.
   NOTA: Di solito un valore OD₆₀₀ compreso tra 0,2–0,4 funziona meglio per una singola espressione di macchia agrobatterica. Se viene applicata una combinazione di diversi ceppi agrobatterici, il totale dei valori di OD₆₀₀ dei ceppi agrobatterici non deve superare 1.
8. Agroinfiltrate N. bethamiana di 4 settimane, lascia pungendole delicatamente con un ago, seguita dall'iniezione a mano di Agrobacterium con una siringa senza l'ago. Cerchiare l'area della foglia infiltrata con il marcatore (di solito 1–2 cm di diametro).
9. Raccogliere i tessuti foglia infiltrati 36 h post-infiltrazione. Macinare il tessuto in polvere fine con azoto liquido.
10. Polvere tissutale risospesa con 300 s l di buffer di estrazione delle proteine (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glicerolo, 1% polivigliopolilicodolidone, 1 mM PMSF, cocktail inibitore della proteasi vegetale) e centrifugaa a 15.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi.
11. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo. Aggiungere 5x buffer di caricamento SDS-PAGE ad una concentrazione finale di 1x e far bollire per 5 min.
12. Separare le proteine grezze su gel 10% SDS-PAGE, trasferire su membrane PVDF e sondare con anti-HA per rilevare in platani.

4. Stabilire il legame tra attività ezimatica e funzione in planta

NOTA: Ad esempio, RHA1B promuove la degradazione della proteina resistente Gpa2 per sopprimere la morte delle cellule HR. In questo passaggio viene illustrato come verificare che tali attività virulente di RHA1B siano dipendenti da E3.

1. Streak appropriato Agrobacterium tumefaciens ceppi che trasportano geni taggati di interesse (in questo esempio HA-RHA1B, HA-RHA1B^C135S, HA-RHA1B^K146R, myc-Gpa2, RBP1) e vettore vuoto come controllo. Segui i passaggi da 3.1 a 3.8 per la preparazione e l'iniezione dell'Agrobacterium sulle foglie di N. bethamiana.
2. Per la degradazione delle proteine del substrato dipendente dall'E3, seguire i passaggi da 3,9 a 3,12 ed eseguire il gonfiore occidentale utilizzando anticorpi appropriati per rilevare l'accumulo di proteine nelle cellule vegetali (ad esempio, anti-HA e anti-MYC).
3. Per la risposta ipersensibile dipendente dall'E3 (HR) ha mediato l'inibizione della morte cellulare, monitorare le foglie agroinfiltrate per i sintomi di morte delle cellule HR 2-4 giorni dopo l'infiltrazione.

In questa sezione vengono forniti risultati rappresentativi per il protocollo utilizzato per l'esame di una singola sottounità E3 ubiquitin ligase RHA1B che dispone di un dominio di tipo RING-H2 PROSITE (132–176 aminoacidi)10. Come illustrato nella Figura 1, per ottenere una proteina mutante carente di E3, almeno una delle otto C o H conservate nel dominio RING (Figura 1A) deve essere mutagenizzata (Figura 1B). Così, come primo passo, sono state generate due versioni mutanti di RHA1B, RHA1BC135S (una sostituzione di Cys by Ser nel conservato C3 del dominio RING) e RHA1BK146R (una sostituzione di Lys da Arg nell'unico Lys presente in RHA1B). Anche se una singola sottounità E3 media il trasferimento dell'ubiquitina dall'ubiquitina che ospita l'E2 al substrato piuttosto che interagire direttamente con l'ubiquitina, l'auto-oniquitazione dell'E3 a Lys potrebbe essere necessaria per la sua massima attività enzimatica.

I risultati del gonfiore occidentale nella Figura 2A mostrano un tipico risultato positivo positivo del saggio in vitro, con uno striscio multibandante che inizia dal peso molecolare della proteina testata (ad esempio, RHA1B in vitro- 100 kDa) e progredisce verso l'alto. L'anticorpo anti-HA riconobbe l'Ub marcato HA incorporato nella catena poli-ubiquitinazione di diverse lunghezze, creando questo tipico striscio associato all'ubiquitina. Per convalidare i risultati positivi, Figura 2A presenta anche tutti i controlli negativi importanti mancanti singoli componenti (E1, E2, Ub, o MBP-RHA1B) o utilizzando MBP come controllo e privo del segnale di ubiquitinazione spalmato. Inoltre, la colorazione blu Coomassie della membrana PVDF ha mostrato un carico uguale di MBP-RHA1B o MBP in tutti i controlli.

La figura 2mostra come i risultati dell'ubiquitinazione in vitro variavano a seconda della specifica combinazione E2/E3. In questo esempio sono stati testati 11 diversi E2 che rappresentano 10 diverse famiglie E2. L'attività di ubiquitinazione rilevata variava da nessun segnale (nessuna macchia) a uno striscio multibandante a partire da diversi pesi molecolari, indicando diversi modelli di ubiquitazione.

La figura 3 mostra i risultati dell'espressione di ubiquitinazione per le versioni RING- e K-mutante delle proteine testate. La mancanza di attività enzimatica per RHA1BC135S è supportata dalla sua incapacità di generare uno striscio multibandante in vitro (Figura 3A) o di promuovere il segnale poli-ubiquitination in planta (Figura 3B). È da notare che la sovraespressione di HA-tagged Ub in planta ha dato ubiquitinazione livello basale in tutti i campioni testati, compreso il controllo vettoriale, in contrasto con il forte segnale di ubiquitinazione conferito dall'attività zigmatica di tipo selvaggio RHA1B. Inoltre, l'analisi sul mutante RHA1BK146R suggerisce che il residuo K146 è anche essenziale per l'attività E3 di RHA1B. Sebbene sia stato rilevato in vitro un segnale marginale di auto-onniquitazione (Figura 3A), l'indice in planta ha determinato che il mutante è carente di E3 (Figura 3B, viene rilevato solo il segnale di ubiquitinazione di fondo).

Dopo aver generato e convalidato biochimicamente il mutante carente di E3, gli studi funzionali possono essere progettati per determinare il ruolo biologico associato all'E3 della liga ubiquitina RING E3 collaudati. Nel caso di RHA1B, questo effettore nematode sopprime la segnalazione immunitaria delle piante, come si manifesta con la soppressione della morte delle cellule HR innescate da Gpa2. Come presentato nella Figura 4A, a differenza del tipo selvaggio RHA1B, il mutante RHA1BC135S privo di attività ligase E3 non ha interferito con la morte delle cellule HR. Dato che il risultato più comune dell'ubiquitinazione proteica è la sua degradazione mediata dal proteasoso, le mutazioni che risiedono nel dominio RING possono essere utilizzate anche per verificare una capacità dipendente dall'E3 di innescare la degradazione dei loro substrati diretti e/o indiretti. Così, significativamente, risultati di gonfiore occidentale in Figura 4B confermano che Gpa2 non si è accumulato in presenza di tipo selvaggio RHA1B ma RHA1BC135S non ha avuto alcun impatto sulla stabilità della proteina Gpa2.

Figura 1: Rappresentazione schematica del principio e dei passaggi coinvolti nella mutagenesi diretta al sito. (A) Evidenziato il dominio RING-CH/H2 con Cis conservati e i Suoi aminoacidi. (B) Un esempio di progettazione di primer mutageni. (C) Passi della mutagenesi diretta al sito. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Analisi dell'ubiquitazione rappresentativa in vitro. (A) Il gel superiore mostra il saggio di ubiquitinazione, compresi tutti i controlli negativi, e il gel inferiore mostra un carico uguale. (B) La gamma di risultati attesi a seconda degli enzimi E2. Questa cifra è stata modificata da Kud et al8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Risultati del test dell'ubiquitazione per i mutanti RING e K (RHA1BC135S e RHA1BK146R). (A) Risultati dell'ubiquitazione in vitro per RHA1BC135S e RHA1BK146R. (( B) In planta risultati di prova di ubiquitinazione per RHA1BC135S e RHA1BK146R. Questa cifra è stata modificata da Kud et al8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Studio funzionale rappresentativo per le funzioni biologiche dipendenti dall'E3. Un esempio di studi funzionali che mostrano la funzione biologica dipendente da E3. (A) Soppressione della morte delle cellule HR dipendenti dall'E3 e degradazione (B) di un immunorecettore vegetale Gpa2. Questa cifra è stata modificata da Kud et al8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: impostazione della reazione PCR

Tabella 2: Programma termociclista PCR

Tabella 3: Reazione di ligazione impostata per l'esempio RHA1B.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.