Stimolazione in vitro e visualizzazione del rilascio di trap extracellulari nei Macrofagi derivati da Monciti Umani differenziati

Il rilascio di ET dai neutrofili è stato identificato per la prima volta come una risposta immunitaria innata innescata da infezione batterica¹. Sono costituite da una spina dorsale del DNA a cui sono legate varie proteine del granulo con proprietà antibatteriche, tra cui l'elastasi neutrofilo e la mieloperossia². Il ruolo principale degli ET neutrofili (NET) è quello di catturare gli agenti patogeni e facilitarne l'eliminazione³. Tuttavia, oltre al ruolo protettivo degli ET nella difesa immunitaria, un numero crescente di studi ha anche scoperto un ruolo nella patogenesi della malattia, in particolare durante lo sviluppo di malattie basate sull'infiammazione (ad es. artrite reumatoide e aterosclerosi⁴). Il rilascio degli ET può essere innescato da varie citochine pro-infiammatorie, tra cui l'interleuchina 8 (IL-8) e il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF)^5,6, e l'accumulo localizzato di ET può aumentare i danni ai tessuti ed evocare risposta pro-infiammatoria⁷. Ad esempio, le ET sono state implicate come un ruolo causale nello sviluppo dell'aterosclerosi^8,promuovendo la trombosi⁹e prevedendo il rischio cardiovascolare¹⁰.

Ora si riconosce che oltre ai neutrofili, altre cellule immunitarie (ad esempio, mastociti, eosofili e macrofagi) possono anche rilasciare ET in caso di esposizione alla stimolazione microbica o pro-infiammatoria^11,12. Questo può essere particolarmente significativo nel caso dei macrofagi, considerando il loro ruolo chiave nello sviluppo, nella regolamentazione e nella risoluzione delle malattie infiammatorie croniche. Pertanto, è importante ottenere una maggiore comprensione della potenziale relazione tra il rilascio di ET dai macrofagi e lo sviluppo di malattie correlate all'infiammazione. Recenti studi hanno dimostrato la presenza di MET e NET in placche aterosclerotiche umane intatte e trombi organizzi¹³. Allo stesso modo, i MET sono stati implicati nel guidare lesioni renali attraverso la regolazione delle risposte infiammatorie¹⁴. Tuttavia, a differenza dei neutrofili, ci sono dati limitati sui meccanismi della formazione MET dai macrofagi. Recenti studi che utilizzano modelli in vitro umano di formazione MET mostrano alcune differenze nei percorsi coinvolti in ogni tipo di cellula (cioè, per quanto riguarda l'assenza di citrigazione istone con macrofagi)⁶. Tuttavia, alcuni hanno dimostrato che il rilascio di NET può verificarsi anche in assenza di citrullination istone¹⁵.

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire un metodo semplice e diretto per valutare il rilascio MET in un modello di macrofago clinicamente rilevante. Ci sono un certo numero di diversi modelli di cellule di macrofago in vitro che sono stati utilizzati per studiare MET (cioè, la linea cellulare monocito umano THP-1 e varie linee cellulari del macrofano murino)¹⁶. Esistono alcune limitazioni associate a questi modelli. Ad esempio, la differenziazione dei monociti THP-1 ai macrofagi richiede solitamente una fase di innesco, come l'aggiunta di acetato di forbol miristatico (PMA), che a sua volta attiva percorsi dipendenti dalla chinasi proteica C (PKC). Questo processo è noto per innescare la^release 4 ET e si traduce in un basso rilascio MET basale da cellule THP-1. Altri studi hanno evidenziato alcune differenze nella bioattività e nelle risposte infiammatorie montate dai macrofagi in vivo rispetto alle cellule THP-1 trattate da^PMA.

Allo stesso modo, il comportamento e le risposte infiammatorie di diverse linee cellulari simili a macrofagi murini non rappresentano completamente lo spettro di risposta dei macrofagi umani primari¹⁸. Pertanto, allo scopo di studiare la formazione di ET macrofaci nell'ambiente clinico, si ritiene che i macrofagi derivati da monofagi (HMDM) primari siano un modello più rilevante piuttosto che linee cellulari monocitiche o murine simili a macrofagi.

Il rilascio di ET dagli HMDM polarizzati M1 è stato dimostrato in seguito all'esposizione di queste cellule a diversi stimoli infiammatori, tra cui l'acido ipocilno ossidante derivato da mieloperossia derivato da minidrica (HOCl), PMA, TNF e IL-8⁶. Descritto qui è un protocollo per polarizzare gli HMDM al fenotipo M1 e visualizzare il successivo rilascio MET dopo l'esposizione a questi stimoli infiammatori. PMA è usato come stimolo del rilascio MET per facilitare il confronto con studi precedenti che hanno usato neutrofili. È importante sottolineare che, HOCl, IL-8, e TNF , sono utilizzati anche per stimolare il rilascio di MET, che si crede di essere modelli migliori dell'ambiente infiammatorio in vivo. Il metodo microscopico per la visualizzazione del rilascio di ET consiste nel macchiare il DNA extracellulare nelle colture di cellule vive utilizzando il verde SYTOX, una macchia di acido nucleico verde fluorescente impermeabile che è stata applicata con successo nei precedenti studi neutrofili. Questo metodo consente una valutazione rapida e qualitativa del rilascio di ET, ma non è appropriato come metodo autonomo per la quantificazione dell'estensione del rilascio ET. La metodologia alternativa deve essere utilizzata se è necessaria la quantificazione per confrontare l'entità del rilascio di ET derivante da diverse condizioni o interventi di trattamento.

L'HMDM è stato isolato dai preparati per le mani di bufala umana forniti dalla banca del sangue con l'approvazione etica del distretto sanitario locale di Sydney.

1. Cultura HMDM

1. Isolare i monociti dai preparati del camice buffo preparati dal sangue periferico di donatori umani sani utilizzando una preparazione disponibile in commercio per isolare i linfociti, seguita da eluriazione centrifuga contrastata^{19, 20}.
2. Confermare la presenza di monociti per citospinning e colorazione con macchie Giemsa modificate per caratterizzazione monocite¹⁹.
3. In condizioni sterili, regolare la densità dei monociti a 1 x 10⁶ cellule/mL utilizzando il supporto RPMI-1640 senza siero. Aggiungere 1 mL di questa sospensione cellulare a ogni pozzo di una piastra di coltura dei tessuti a 12 pozzetto. Coltura in un'incubatrice cellulare a 37 gradi centigradi in presenza del 5% di CO₂ per 2 h per promuovere l'aderenza alla piastra di coltura tissutale.
4. In condizioni sterili, rimuovere il supporto cellulare e sostituirlo con supporti di coltura RPMI-1640 completi contenenti 10% (v/v) siero umano in pool e 20 mM L-glutamine.
5. Coltura le cellule a 37 gradi centigradi in presenza del 5% di CO₂ in un'incubatrice cellulare per 8 giorni, cambiando i media ogni 2 giorni.

2. Polarizzazione di HMDM

1. In condizioni sterili, preparare i supporti di innesco M1 aggiungendo l'interferone z (IFN; 20 ng/mL) e il lipopolioaccharide (LPS; 1 g/mL) ai mezzi di coltura RPMI-1640 completi. Preparare il supporto di priming M2 aggiungendo l'interleucina 4 (IL-4; 20 ng/mL) al supporto di coltura RPMI-1640 completo.
2. In condizioni sterili, aspirare i media dei pozzi della piastra di coltura dei tessuti che contengono l'HMDM, che sono stati semiati e coltivati come descritto nella sezione 1.
3. Lavare con cura i pozze contenenti le cellule 3x con PBS sterile (preriscaldato a 37 gradi centigradi), utilizzando 1 mL di aliquote di PBS.
4. Aggiungere 1 mL del supporto di innesco M1 o M2 a ogni pozzo contenente l'HMDM (a seconda di quale sia appropriato per l'esperimento).
5. Incubare le cellule per 48 h a 37 gradi centigradi in presenza del 5% di CO₂ in un'incubatrice cellulare.

3. Stimolazione dell'HMDM per indurre MET Release

1. In condizioni sterili, preparare i mezzi di coltura contenenti diversi stimolatori del rilascio MET (a seconda di quale sia appropriato per l'esperimento) al supporto RPMI-1640 completo: PMA (25 nM), TNF (25 ng/mL) o IL-8 ricombinante umano (50 ng/mL (50 ng/mL ).
2. Per gli esperimenti con la stimolazione HOCl, preparare HOCl (200 m) in HBSS (preriscaldato a 37 gradi centigradi), immediatamente prima dell'aggiunta alle cellule. Assicurarsi che l'HOCl non sia preparato in un supporto completo della cella.
   NOT: La concentrazione della soluzione stock di HOCl viene quantificata misurando l'assorbimento UV della soluzione a 292 nm e pH 11⁶ e utilizzando un coefficiente di estinzione di 350 M^-1cm^-121.
3. Dopo il trattamento di polarizzazione descritto nella sezione 2, aspirare il supporto cellulare da ogni pozzo e lavare con cura le cellule 3x con 1 mL aliquote di: PBS sterile (per PMA, TNF e IL-8) o HBSS (per HOCl), che sono stati preriscaldati a 37 gradi centigradi.
4. Per gli esperimenti con PMA, TNF o IL-8: aggiungere 1 mL del supporto completo contenente PMA, TNF o IL-8 dopo la rimozione del PBS nella fase finale di lavaggio.
5. Per gli esperimenti con il TNF, incubare le cellule per 6 h a 37 gradi centigradi in presenza del 5% di CO₂ in un'incubatrice cellulare. Per esperimenti con PMA e IL-8, incubare le cellule per 24 h a 37 gradi centigradi in presenza del 5% di CO₂ in un'incubatrice cellulare.
6. Per gli esperimenti con HOCl, aggiungere 1 mL di HOCl in HBSS dopo aver rimosso l'HBSS nella fase finale di lavaggio. Quindi, incubare le cellule per 15 min a 37 gradi centigradi in presenza del 5% di CO₂ in un'incubatrice cellulare.
   1. Aspirare con attenzione il supernatante cellulare e lavare le cellule 3x con 1 mL aliquote di HBSS come descritto al punto 3.3.
   2. Dopo aver rimosso l'HBSS dalla fase finale del lavaggio, aggiungere 1 mL di supporti di coltura RPMI-1640 completi. Quindi, incubare le cellule per 24 h a 37 gradi centigradi in presenza del 5% di CO₂ in un'incubatrice cellulare.

4. Visualizzazione di MET nella cultura delle cellule vive

1. Preparare il coloranti verde SYTOX in HBSS ad una concentrazione di 40 M.
2. Alla fine dei trattamenti descritti nella sezione 3 per indurre il rilascio di MET, aggiungere direttamente 25 :L di 40 M del coloranti ad ogni pozzo contenente HMDM.
3. Incubare le cellule a temperatura ambiente (RT) per 5 min al buio.
4. Posizionare l'HMDM nei pozzi di coltura tissutale sullo stadio del microscopio di un microscopio fluorescente invertito per l'imaging.
5. Procedure per il microscopio
   1. Accendere una fonte di luce fluorescente ad ampio spettro, una fonte di luce del campo luminoso e un microscopio invertito installato con una fotocamera digitale a colori ad alta risoluzione (vedere Tabella dei materiali).
   2. Ruotare la ruota del filtro fino alla posizione di "numero 2" per la fluorescenza verde (eccitazione - 504 nm, emissione 523 nm) per l'imaging dei campioni macchiati di verde contenuti all'interno dei pozzi di coltura dei tessuti.
   3. Utilizzando l'obiettivo 5x, mettere a fuoco l'immagine con la messa a fuoco grossolana, quindi le manopole di messa a fuoco fine sul microscopio, fino a quando l'immagine appare nitida, chiara e messa a fuoco quando viene visualizzata attraverso l'oculare del microscopio.
   4. Impostare il microscopio alla modalità fotocamera.
   5. Avviare il software associato.
   6. Selezionare la scheda Acquisizione nel software.
   7. Fare clic sul pulsante Riproduci per visualizzare l'anteprima dell'immagine e regolare la manopola di messa a fuoco fine sul microscopio fino a quando l'immagine non appare nitida, chiara e messa a fuoco nella finestra di anteprima del software.
   8. Fare clic sul pulsante Acquisisci.
      NOT: L'immagine acquisita verrà visualizzata automaticamente nel software di accompagnamento.
   9. All'interno del software, fare clic su File Salva come tipo di file immagine richiesto.
   10. Al microscopio, ruotare la ruota del filtro fino alla posizione "numero 5" per l'imaging del campo luminoso e ripetere i passaggi da 4.5.2–4.5.9 per ottenere l'immagine del campo luminoso corrispondente.
   11. Ripetere i passaggi da 4.5.2– 4.5.10 se necessario per la successiva acquisizione dell'immagine.

Le immagini di Brightfield che mostrano i cambiamenti morfologici dell'HMDM in risposta agli stimoli per la differenziazione cellulare sono mostrate nella Figura 1. I macrofagi polarizzati M1 da esperimenti con HMDM esposti a IFN e LPS hanno mostrato una forma di cella allungata e simile a un mandrino, come indicato dalle frecce nere nella Figura 1 (pannello centrale). Per fare un confronto, la morfologia dei macrofagi polarizzati M2 dopo l'esposizione dell'HMDM a IL-4 per 48 h erano tipicamente rotonde e piatte, come indicato dalle frecce nere nella Figura 1 (pannello all'estrema destra).

La capacità di fenotipi HMDM differenziati di rilasciare MET è stata visualizzata mediante imaging a fluorescenza delle cellule vive con verde SYTOX, come illustrato nella Figura 2. La figura 2A mostra i dati di controllo ottenuti da ogni fenotipo HMDM incubato per 24 h in assenza di stimoli pro-infiammatori. In questo caso, c'era una colorazione verde molto limitata, come ci si aspettava, data la natura impermeant della cellula di questa macchia. La figura 2B ha mostrato una colorazione positiva per le MET, risultante dall'esposizione degli HMDM M1 a HOCl, PMA, IL-8 o TNF. I MET sono indicati dalle frecce bianche, mostrate come striature verdi, risultanti dai filamenti di DNA extracellulare. Con HOCl, oltre a colorare il DNA extracellulare, c'era qualche colorazione verde apparente nelle cellule. Questa colorazione cellulare è stata osservata anche in una certa misura con gli altri stimoli e si ritiene che rifletta la perdita di integrità della membrana risultante dalla morte cellulare indipendente da ET a causa delle condizioni di trattamento.

La figura 2B mostra anche gli esperimenti corrispondenti eseguiti con M2 HMDM, che sono stati esposti a IL-4. In questo caso, non c'è stato alcun rilascio di DNA dalle cellule, come indicato dall'assenza di filamenti / strisce di DNA extracellulare; però, c'è stato un certo assorbimento cellulare di colorante fluorescente verde con l'HOCl e il TNF. Ai fini comparativi, la figura 3 mostra dati rappresentativi che indicano il rilascio MET dai macrofagi THP-1 esposti a TNF , 50 ng/mL per 4 h. In questo caso, va notato che è stata utilizzata una popolazione non polarizzata di cellule, e i monociti THP-1 sono stati differenziati ai macrofagi per pre-trattamento con PMA (50 ng/mL per 72 h) come descritto in precedenza22.

Figura 1: Cambiamenti morfologici degli HMDM polarizzati in modo differenziale. Rappresentativo delle immagini da HMDM non differenziati e differenziati (n . 5). Gli HMDM sono stati coltivati con supporti completi contenenti siero e glutammina umana per 8 giorni prima dell'innesco al fenotipo M1 o M2 dopo l'esposizione a IFN e LPS o IL-4, rispettivamente, per 48 h. Barra della scala di 200 m. Le frecce indicano esempi di celle che mostrano le caratteristiche morfologiche degli HMDM M1 o M2.

Figura 2: MET prodotti da M1 HMDM in seguito alla stimolazione HOCl, PMA, IL-8 e TNF. Immagini rappresentative di HMDM macchiati verdi SYTOX da (A) Gli HMDM M1 e M2 non stimolati incubati per 24 h in assenza di stimoli infiammatori sono stati utilizzati come controllo, dimostrando l'assenza di rilascio MET. (B) M1 e M2 Gli HMDM sono stati trattati con 1) HOCl (200 m, 15 min), PMA (25 nM), o IL-8 (50 ng/mL) con incubazione per 24 ore o 2) TNF (25 ng/mL) con incubazione per 6 h per indurre il rilascio di MET. I MET sono stati visualizzati con l'aggiunta del verde SYTOX, come indicato da frecce bianche nel pannello superiore da M1 HMDM. Negli esperimenti corrispondenti con gli M2 HMDMs non sono stati osservati METS. Barra della scala: 500 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: MET prodotti da macrofagi THP-1 non polarizzati a seguito della stimolazione TNF. Immagini rappresentative dei macrofagi TNP-1 saldati in verde, differenziati per pre-trattamento con PMA (50 ng/mL per 72 h) prima di un'ulteriore incubazione per 4 h in assenza o presenza di TNF (50 ng/mL) per indurre il rilascio di MET. I MET sono stati visualizzati con l'aggiunta di Verde SYTOX. I dati sono rappresentativi dei pozzi di coltura di replica da esperimenti n - 3. Barra della scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.