Articolo metodologico

Stimolazione in vitro e visualizzazione del rilascio di trap extracellulari nei Macrofagi derivati da Monciti Umani differenziati

DOI:

10.3791/60541

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1 novembre 2019

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1Heart Research Institute, 2Sydney Medical School, University of Sydney, 3Department of Biomedical Sciences, University of Copenhagen

In questo articolo

Sommario

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Presentato qui è un protocollo per rilevare la produzione di trap extracellulari macrofalo (MET) nella coltura di cellule vive utilizzando microscopia e colorazione a fluorescenza. Questo protocollo può essere ulteriormente esteso per esaminare specifici marcatori proteici MET mediante colorazione immunofluorescenza.

Abstract

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Il rilascio di trappole extracellulari (ET) da parte dei neutrofili è stato identificato come un fattore che contribuisce allo sviluppo di malattie legate all'infiammazione cronica. Neutrophil ETs (NETs) sono costituiti da una rete di DNA, proteine istone, e varie proteine granulo (cioè, mieloperossiasi, elastasi, e cathepsin G). Altre cellule immunitarie, compresi i macrofagi, possono anche produrre ET; tuttavia, fino a che punto ciò si verifica in vivo e se le trappole extracellulari dei macrofazini (MET) svolgono un ruolo nei meccanismi patologici non è stato esaminato in dettaglio. Per comprendere meglio il ruolo delle MET nelle patologie infiammatorie, è stato sviluppato un protocollo per visualizzare il rilascio di MET dai macrofagi umani primari in vitro, che può essere sfruttato anche negli esperimenti di immunofluorescenza. Ciò consente un'ulteriore caratterizzazione di queste strutture e il loro confronto con gli ET rilasciati dai neutrofili. I macrofagi derivati dai monofati umani (HMDM) producono MET dopo l'esposizione a diversi stimoli infiammatori a seguito della differenziazione al fenotipo pro-infiammatorio M1. Il rilascio di MET può essere visualizzato mediante microscopia utilizzando una macchia di acido nucleico fluorescente verde che è impermeantto alle cellule vive (ad esempio, verde SYTOX). L'uso di macrofagi primari appena isolati, come l'HMDM, è vantaggioso nella modellazione di eventi infiammatori in vivo rilevanti per potenziali applicazioni cliniche. Questo protocollo può essere utilizzato anche per studiare il rilascio di MET da linee cellulari monocitiche umane (ad esempio, THP-1) a seguito di differenziazione in macrofagi con acetato di mirino phorbol o altre linee cellulari di macrofalo (ad esempio, le cellule J774A.1 simili a murini.

Introduzione

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Il rilascio di ET dai neutrofili è stato identificato per la prima volta come una risposta immunitaria innata innescata da infezione batterica1. Sono costituite da una spina dorsale del DNA a cui sono legate varie proteine del granulo con proprietà antibatteriche, tra cui l'elastasi neutrofilo e la mieloperossia2. Il ruolo principale degli ET neutrofili (NET) è quello di catturare gli agenti patogeni e facilitarne l'eliminazione3. Tuttavia, oltre al ruolo protettivo degli ET nella difesa immunitaria, un numero crescente di studi ha anche scoperto un ruolo nella patogenesi della malattia, in partic....

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Protocollo

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L'HMDM è stato isolato dai preparati per le mani di bufala umana forniti dalla banca del sangue con l'approvazione etica del distretto sanitario locale di Sydney.

1. Cultura HMDM

  1. Isolare i monociti dai preparati del camice buffo preparati dal sangue periferico di donatori umani sani utilizzando una preparazione disponibile in commercio per isolare i linfociti, seguita da eluriazione centrifuga contrastata19, 20.
  2. Confermare la presenza di monociti per citospinning e colorazione con macchie Giemsa modificate per caratterizzazione monocite19....

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Risultati

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Le immagini di Brightfield che mostrano i cambiamenti morfologici dell'HMDM in risposta agli stimoli per la differenziazione cellulare sono mostrate nella Figura 1. I macrofagi polarizzati M1 da esperimenti con HMDM esposti a IFN e LPS hanno mostrato una forma di cella allungata e simile a un mandrino, come indicato dalle frecce nere nella Figura 1 (pannello centrale). Per fare un confronto, la morfologia dei macrofagi polarizzati M2 dopo l'esposizione dell'HMDM.......

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Discussione

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La generazione e la visualizzazione della formazione MET utilizzando HmDM differenziate M1 rappresenta un nuovo modello in vitro che può essere utile per studiare il potenziale ruolo patologico di queste strutture macrofaghe, in particolare sotto l'infiammatorio cronico Condizioni. Fornisce un protocollo robusto per la stimolazione dei macrofagi umani primari per rilasciare MET, che può anche essere utilizzato in studi correlati con linee cellulari monociti o macrofagi murini. La riuscita implementazione di questo protoc.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da un perpetual IMPACT Grant (IPAP201601422) e da Novo Nordisk Foundation Biomedical Project Grant (NNF17OC0028990). L'Australian Postgraduate Award da parte dell'Università di Sydney riconosce anche la ricezione di un Australian Postgraduate Award. Ringraziamo Pat Pisansarakit e la signora Morgan Jones per l'assistenza nell'isolamento dei monociti e nella cultura dei tessuti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sorgente luminosa fluorescente ad ampio spettro 120QEXFO Photonic Solutions, Toronto, Canadaserie x-cite
Corning CellBIND Piastra a pozzetti multipli (12 pozzetti)Sigma-AldrichCLS3336Per colture cellulari
Kit di colorazione Quik differenziale (Modified Giemsa)Polysciences Inc.24606Caratterizzazione dei monociti
salina bilanciata di Hanks (HBSS)Thermo-Fisher14025050Per fasi di lavaggio e trattamento HOCl
Acido ipocloroso (HOCl)Sigma-Aldrich320331Per stimolazione MET
Interferone gammaThermo-FisherPMC4031Per priming M1
Interleuchina 4Integrated Sciencesrhil-4Per l'innesco M2
Interleuchina 8Miltenyl Biotec130-093-943Per la stimolazione MET
L-GlutamminaSigma-Aldrich59202CAggiunto ai terreni di coltura
LipopolisaccarideScienze integratetlrl-eblpsPer l'innesco M1
LymphoprepAxis-Shield PoC AS1114544Per l'isolamento dei monociti
Olympus IX71 invertito microscopioOlympus, Tokyo, Giappone
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)Sigma-AldrichP8139Per la stimolazione MET
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Sigma-AldrichD5652Per le fasi di lavaggio
RPMI-1640 terreniSigma-AldrichR8758Per colture cellulari
SYTOX greenLife TechnologiesS7020Per MET sorgente luminosa a
campo chiaro TH4-200Olympus, Tokyo, Giapponeserie x-cite Fattore
di necrosi tumorale alfaLonza300-01A-50Per stimolazione MET
Soluzione

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host ....

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Polarizzazione M1colorazione con SYTOX Greenmicroscopia a fluorescenzastimolazione con acido ipoclorosostimolazione con PMAstimolazione con TNF alfastimolazione con interleuchina 8visualizzazione del MET

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