Lo scopo di questo protocollo è quello di fondere due diversi tipi di cellule per creare cellule ibride. L'analisi della microscopia a fluorescenza delle cellule fuse viene utilizzata per tracciare la cellula di origine degli organelli cellulari. Questo saggio può essere usato per esplorare come la struttura cellulare e la funzione rispondono alla perturbazione con la fusione cellulare.
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Articolo metodologico
Fusione cellulare di linee cellulari modificate per la perturbazione della struttura cellulare e della funzione
In questo articolo
Sommario
Abstract
La vita è suddivisa spazialmente all'interno di membrane lipidiche per consentire la formazione isolata di stati molecolari distinti all'interno di cellule e organelli. La fusione cellulare è la fusione di due o più cellule per formare una singola cellula. Qui forniamo un protocollo per la fusione cellulare di due diversi tipi di cellule. Le cellule ibride fuse sono arricchite da uno smistamento a base di citometria di flusso, seguito dalla microscopia a fluorescenza della struttura e funzione delle cellule ibride. Le proteine fluorescenti etichettate generate dall'editing del genoma sono immagini all'interno delle cellule fuse, consentendo di identificare le strutture cellulari in base all'emissione di fluorescenza e di tornare al tipo di origine della cellula. Questo metodo robusto e generale può essere applicato a diversi tipi di cellule o organelli di interesse, per comprendere la struttura cellulare e la funzione in una serie di domande biologiche fondamentali.
Introduzione
La manutenzione omeostatica della struttura cellulare è fondamentale per la vita. Le cellule hanno morfologie caratteristiche, numeri di orgelli subcellulari e composizione biochimica interna. Comprendere come vengono generate queste proprietà fondamentali e come vanno in stato di sfago durante la malattia richiede strumenti di laboratorio per perturbarli.
La fusione cellulare è la fusione di due o più celle separate. La fusione cellulare potrebbe essere stata fondamentale per l'emergere della vita eucarica1. Nel corpo umano, la fusione cellulare è relativamente rara, che si verifica durante circostanze di sviluppo e....
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Protocollo
1. Etichettatura differenziale delle cellule fluorescenti
- Tagging genico con CRISPR Cas9
- Utilizzare l'editing del genoma di CRISPR Cas9 per taggare la radiceletina (o altri geni di interesse) con le proteine fluorescenti meGFP o mScarlet-I nelle linee cellulari del cancro umano.
NOT: I protocolli dettagliati per l'editing del genoma sono coperti altrove24,25,26.
- Utilizzare l'editing del genoma di CRISPR Cas9 per taggare la radiceletina (o altri geni di interesse) con le proteine fluorescenti meGFP o mScarlet-I nelle linee cellulari del cancro umano.
- Etichettatura dei dinescenti fluorescente
- Crescere le cellule tumorali dell'aquila (DMEM) modificate da Dulbecco e 100 penicillina di Dulbec....
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Risultati
Le celle etichettate in modo appropriato sono visibili durante la citometria di flusso mediante segnale di fluorescenza superiore alle celle di controllo non etichettate (Figura 2A). I cancelli sono impostati per la selezione di cellule doppie positive, arricchendo questa popolazione direttamente in piatti di imaging per ulteriori analisi microscopiche. Le cellule fuse sono rilevabili come cellule doppie fluorescenti fluorescenti distinte e c.......
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Discussione
Dimostriamo un protocollo facile ed economico per fondere le cellule e visualizzare la successiva architettura di ibridi cellulari con microscopia, impiegando circa due giorni dall'inizio alla fine. Le parti critiche di questo protocollo sono l'arricchimento delle cellule fuse mediante l'ordinamento delle cellule (sezione protocollo 3) e un'attenta convalida delle cellule fuse mediante microscopia (sezione protocollo 4). Queste sezioni assicurano che le cellule fuse siano facilmente ottenute e siano eteoka fideeeoni. Le .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato da una Wellcome Trust Henry Wellcome Fellowship a R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant numero 100090/12/ s). Il funder non ha avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicazione o nella preparazione del manoscritto. Ringraziamo Ashok Venkitaraman e Paul French per la consulenza critica e la guida sul progetto. Ringraziamo Chiara Cossetti e Gabriela Grondys-Kotarba presso lo stabilimento Cytometry del Cambridge Institute for Medical Research Flow per un eccellente supporto. Ringraziamo Liam Cassiday, Thomas Miller e Gianmarco Contino per aver revisionato il manoscrit....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tubo da 15 mL | Sarstedt | 62554502 | |
| soluzione di formaldeide al 37% | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 Microscopio confocale a scansione laser Airisscan Piastre | di imaging a 8 pozzetti Carl Zeiss | ||
| Ibidi | 80826 | ||
| Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody | Chromotek | gba-488 | |
| BD Afflusso Selezionatore di cellule | BD Biosciences Albumina | ||
| Sigma-Aldrich | A7906 | ||
| Filtri cellulari (70 μ m) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), glucosio alto, GlutaMAX, piruvato | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| Siero fetale bovino | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 nanocorpo di alpaca anti-mScarlet-I NanoTag | Biotechnologies | N1302-At565 | |
| L15 CO2 mezzo di imaging indipendente | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| Penicillina/streptomicina | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
| DMEM senza rosso fenolo, alto glucosio | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS) | 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2HPO4, dH2O fino a 1 L | ||
| di polietilenglicole Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| Provette in polipropilene | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | tensioattivo non ionico |
| Tripsina | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | detergente non ionico |
Riferimenti
- Lane, N. Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2006).
- Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
- Köhler, G., Milstein, C.
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Ristampe e permessi
