Qui, abbiamo fornito un metodo per ottenere una trasfezione stabile dei parassiti dell'Eimeria di pollo nucleofecting sporozoiti o merozoiti di seconda generazione. I parassiti eimeri geneticamente modificati che esprimono geni antigenici eterologi potrebbero essere usati come veicoli per la somministrazione di vaccini.
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Articolo metodologico
Nucleofezione e Propagazione In Vivo dei Parassiti dell'Emeria del Pollo
In questo articolo
Sommario
Abstract
La trasfezione è un processo tecnico attraverso il quale il materiale genetico, come il DNA e l'RNA a doppio filamento, vengono consegnati nelle cellule per modificare il gene di interesse. Attualmente, la tecnologia transgenica sta diventando uno strumento indispensabile per lo studio di Eimeria, gli agenti causali della coccidiosi nel pollame e nel bestiame. Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata della trasfezione stabile nei parassiti emerici: purificazione e nucleofezione di sporozoiti o merozoiti di seconda generazione, e propagazione in vivo di parassiti trasmutati. Utilizzando questo protocollo, abbiamo raggiunto la trasfezione in diverse specie di Eimeria. Nel loro insieme, la nucleofezione è uno strumento utile per facilitare la manipolazione genetica nei parassiti emerici.
Introduzione
Eimeria spp. provoca coccidiosi, che porta a notevoli perdite economiche nell'industria zootecnica e avicola. Anche se i farmaci anticcidi, e in una certa misura, attenuati i vaccini anticcidi, sono stati ampiamente utilizzati per il controllo della coccidiosi, ci sono ancora carenze per quanto riguarda la loro resistenza ai farmaci, i residui di farmaci e la potenziale diffusione di ceppi di vaccino che riacquistano la virulenza1. Con lo sviluppo della biologia molecolare, la trasfezione è diventata uno strumento vitale per studiare le funzioni genetiche, sviluppare nuovi vaccini e vagliare nuovi bersagli farmacologici per Eimeria.
Negli ultimi decenni, la trasfezione è stata applicata con successo per parassiti apicomplessi come Plasmodium e Toxoplasma gondii2,3,4,5,6. Uno studio condotto su z-gal come reporter per la trasfezione in E. tenella ha sperimentato tale lavoro in Eimeria7. La trasfezione di E. tenella8,9, E. mitis10ed E. acervulina (et al., dati inediti) ebbe successo nei polli. Recentemente, abbiamo raggiunto la trasfezione usando merozoiti di E. necatrix attraverso la nucleofezione11.
Gli studi hanno dimostrato che Eimeria che esprime un antigene eteologo ha il potenziale per essere sviluppata come vaccino ricombinante, come quelli che esprimono L'antigene A (CjaA) o l'interleumina di pollo 2 (chIL-2)12,13. Pertanto, questo protocollo descrive uno studio di nucleofezione di Eimeria spp. in polli. La procedura descrive la purificazione di sporozoiti o merozoiti, la nucleofezione con DNA plasmide, l'inoculazione cloasnica/iniezione endovenosa e la propagazione in vivo per aiutare i ricercatori ad avviare studi sui parassiti eimeria transgenici.
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Protocollo
I polli per tutti gli esperimenti sugli animali sono stati ospitati e mantenuti secondo le linee guida del Comitato per la cura e l'uso degli animali delle Università Agricola della Cina e hanno seguito i principi guida internazionali per la ricerca biomedica che coinvolgono gli animali. Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato di Animali da Laboratorio dell'Amministrazione di Pechino.
1. Estrazione e purificazione degli sporozoiti di Eimeria spp. (ad esempio, E. tenella)
- Rilascio di sporocisti
- Centrifuga 1 x 107oocisti spororati in soluzione di cromata di potassio (2,5%, m/v) a 2.300 x g per 5 min. Lavarli con PBS (soluzione buffer fosfato) tre volte.
- Risospendere i pellet con 1 mL di PBS e trasferirli in un tubo da 15 mL. Aggiungere un volume uguale di perline di vetro (1 mm x 1 mm di diametro gamma) e oscillare la sospensione dell'oocisti utilizzando un mixer vortice per rilasciare le sporocisti.
- Monitorare il rilascio di sporocisti in microscopia ogni minuto. Smettere di vortice quando più del 90% delle oocisti sono rotti.
NOTA: La maggior parte delle ovocisti (come E. tenella, E. necatrixed E. acervulina) sono stati interrotti dopo 1 min utilizzando il mixer vortice. - Trasferire la sospensione sporocisti in nuovi tubi da 1,5 mL e centrifugare a 1.600 x g per 5 min.
- Risospendere il precipitato con una soluzione di gradiente di densità del 50%, combinare in un tubo da 1,5 mL e centrifugare a 10.000 x g per 1 min.
NOTA: per la composizione del gradiente di densità, fare riferimento alla Tabella 1. Il gradiente di densità è un mezzo colloidale a base di silice, costituito da particelle di silice colloidali di 15-30 nm di diametro (23% w/w in acqua), che sono stati rivestiti con polivinylpyrrolidone (PVP).
- Rilascio di sporozoiti
- Risospendere il precipitato con il tampone di escissione (Tabella 1) e incubare in un bagno d'acqua a 42 gradi per 40-60 min per rilasciare le sporozoiti. Smettere di incubare quando più del 90% delle sporozoites vengono rilasciate. Quindi centrifugare a 600 x g per 10 min.
NOTA: Agitare i tubi una volta ogni 5 minuti durante l'escissione. - Risospendere la precipitazione con una soluzione di gradiente di densità del 55% del 55% e centrifugare a 10.000 x g per 1 min.
- Risospendere la precipitazione con 1 mL di PBS e contare gli sporozoiti utilizzando un emocitometro.
- Risospendere il precipitato con il tampone di escissione (Tabella 1) e incubare in un bagno d'acqua a 42 gradi per 40-60 min per rilasciare le sporozoiti. Smettere di incubare quando più del 90% delle sporozoites vengono rilasciate. Quindi centrifugare a 600 x g per 10 min.
2. Raccolta e purificazione dei merozoiti di E. necatrix
NOTA: utilizzare i polli da carne Arbor Acre di età compresa tra 7 e 14 d nell'esperimento. I polli senza coccidia (n. 3) sono stati inoculati con 2 x 105 ovociti di E. necatrix. A 109 h dopo l'infezione, gli uccelli sono stati sacrificati dalla lussazione cervicale. L'intestino è stato rimosso per la raccolta dei merozoiti di 2di maestra. Per diverse specie di Eimeria, c'era un tempo diverso per la raccolta dei merozoiti di secondagenerazione: E. necatrix a 109 h, ed E. tenella a 112 h post-inoculazione. Per la trafezione di E. necatrix,i merozoiti sono la scelta ottimale in quanto i secondi merozoiti sono facili da purificare.
- Collezione dei merozoiti di seconda generazione di E. necatrix
- Tagliare il pollo alla longitudine, dal gambo del tuorlo (al centro dell'intestino tenue) all'orifizio ileocecal, e lavarlo con PBS o HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) delicatamente tre volte in un piatto Petri.
- Tagliare l'intestino a pezzi di 0,5 cm x 0,5 cm e metterlo in un pallone conico con un buffer di digestione (Tabella 1). Collocare il flacone su un miscelatore magnetico a 37 gradi centigradi con una barra di agitazione per 30-60 min per rilasciare i merozoiti. Dopo 30 min di incubazione, monitorare il rilascio di merozoiti con esame microscopico ogni 5 min.
- Purificare i merozoiti filtrazione e centrifugazione.
- Filtrare le sospensioni contenenti merozoiti digeriti utilizzando quattro strati di garza14e centrifugare a 600 x g per 10 min.
- Dopo la centrifuga, scartare il supernatante contenente i detriti intestinali. Trasferire la precipitazione con merozoiti purificati a tubi da 1,5 mL.
- Risospendere la precipitazione con 1 mL di PBS e contare i merozoiti utilizzando un emocitometro.
3. Nucleofezione di merozoiti o sporozoiti
- Preparazione prima della nucleofezione dei parassiti
- Preparare circa 107 merozoiti o sporozoiti in un tubo. Se trasfecare i merozoiti, preparare 3-4 tubi.
- Preparare una quantità di DNA plasmide o frammento di PCR purificato maggiore o uguale a 10 g.
NOTA: Il plasmide utilizzato in questo studio contiene 2 geni: proteina fluorescente gialla avanzata (EYFP) e sintesi diidrofolata reducitto tiromidillatico derivata da Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS)15. - Preparare 25 U di enzima di restrizione. Se i plasmidi sono linearizzati, l'enzima di restrizione può migliorare l'efficienza della trasfezione. Se i plasmidi sono circolari, omettere l'enzima di restrizione.
- Preparare 85 l di buffer di nucleofezione: mescolare 20 l di buffer di nucleofezione I e 1 mL di buffer di nucleofezione II, e utilizzare una parte della soluzione. Il volume del buffer totale è 100.
- Nucleofezione
- Centrifugare la sporozoite o la sospensione di merozoite a 600 x g per 10 min. Poi scartare il super-natante.
- Nell'ordine seguente, aggiungere 85 l di buffer di trasfezione nucleare, 10 g di plasmide (frammento PCR) e 25 U di enzima di restrizione (di solito 5) nel tubo da 1,5 mL contenente sporozoiti o merozoiti.
- Trasferire la sospensione in una coppa di trasfezione nucleare. Metti la tazza in una scanalatura di trasferimento nucleare.
- Accendere il dispositivo di nucleofezione utilizzando il pulsante di accensione e selezionare la procedura di trasfezione U-033. Se il dispositivo di nucleofezione si avvia nella modalità Scelta programma libero, uscire da questa modalità premendo il pulsante X.
- Al termine del programma, premere il pulsante X del dispositivo di nucleofezione e sullo schermo dovrebbe essere visualizzato OK, a indicare che la nucleoflessione ha esito positivo.
- Aggiungere 0,5-1 mL di Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)8 alla coppa di nucleofezione per fermare la reazione e trasferire la sospensione a tubo da 1,5 mL dopo aver miscelato delicatamente.
4. Inoculazione cloaca o iniezione endovenosa
- Inoculare i parassiti nucleofettati in polli vecchi di 7 giorni. Inoculare le merozoites di E. necatrix o le sporozoites di E. tenella attraverso il percorso cloacale, ma inoculare E. acervulina sporozoites tramite iniezione endovenosa. Inoculare circa 2 x 107 milioni di sporozoiti in ogni pollo, e incoluate merozoites 107 per ogni uccello.
5. Propagazione e smistamento FACS
- Raccogliere le oocisti dalle feci 5-9 giorni dopo l'inoculazione con sporozoiti trasmutati. Raccogliere le oocisti il terzo giorno dopo l'inoculazione con merozoiti trasmissi.
- Utilizzare lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS) e 150 mg/kg di pirilatamina8 per aumentare successivamente il rapporto tra popolazione transgenica.
NOTA: Utilizzare la pirimethamina aggiungendola direttamente nel feed. Per un uso più conveniente, preparare pirrimethamina solubile in acqua. Sciogliere 1 g di pirithamina in 0,2 mL pf H2SO4 e 9,8 mL di pirrododone n-metilico (NMP), quindi aggiungere 1,5 mL di questa soluzione di stock in 1 L di acqua potabile per gli uccelli.
6. Purificazione facoltativa colonna
NOTA: Se sono necessari più sporozoiti o merozoiti puri, c'è un metodo opzionale che li purifica attraverso una colonna di cellulosa dietilaminoethyl-52 (DE-52 cellulosa).
- Preparare la colonna di cellulosa DE-52 con almeno un giorno di anticipo.
- Preparare il buffer eluente della glicina (tabella 1). Regolare il pH del buffer eluente di glicina da 7,6 a 8,0 e preriscaldato a 41 gradi centigradi.
- Aggiungere 2,5 g di cellulosa DE-52 alla colonna. Aggiungere acqua e ammollo durante la notte. Scartare il super-attardato.
- Aggiungere acqua e ammollo per 1 h. Scartare il supernatante.
- Aggiungere 0,1 M di NaOH e immergere per almeno 2 ore. Ripetere questo passaggio.
- Sostituire il supernatante con acqua. Dopo che la cellulosa si deposita completamente verso il basso (circa mezz'ora), ripetere questo passaggio.
- Scartare il supernatante, aggiungere 0,1 M HCl e immergere per almeno 2 ore. Ripetere questo passaggio.
- Scartare il supernatante e immergere la cellulosa due volte con tampone eluente di glicina.
- Misurare e regolare il pH da 7,6 a 8,0 aggiungendo 0,1 M HCl o 0,1 M NaOH.
NOTA: In questa parte, il liquido ha almeno 5 volte più volume di quello della cellulosa DE-52.
- Regolare la portata tra 40-50 r/min.
- Quando la sedimentazione della cellulosa è completata, aggiungere la sporozoite o la sospensione della merozoite alla colonna cromatografica. Regolare la portata a 30-40 r/min.
NOTA: Risospendere la sporozoite o la precipitazione di merozoite con tampone eluente di glicina prima di aggiungere la colonna cromatografica. - Raccogliere con tampone eluente di glicina in tubi da 50 mL. Interrompere la raccolta in base ai risultati dell'esame microscopico di sporozoiti o merozoiti durante il processo di eluizione.
- Centrifugare il buffer eluente di glicina raccolto a 600 x g per 10 min. Trasferire la precipitazione sporozoite o merozoite a nuovi tubi da 1,5 mL.
- Contare gli sporozoiti o i merozoiti usando un emocitometro.
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Risultati
Questo protocollo è stato utilizzato per trasfect parassiti eimeri. In questo studio, le merontes di 2nd generazione e merozoites di E. necatrix sono stati mostrati in Figura 2A e Figura 2B, mentre Figura 2C e Figura 2D ha mostrato le sporocisti e sporozoites di E. tenella do...
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Discussione
Negli anni '90, è stato sviluppato un sistema di trasfezione per i parassiti apicomplessi, ed è stato utilizzato per studi sui parassiti eimeri. Recentemente, la trasfezione stabile è stata condotta in E. tenella8,9 e E. nieschulzi15. Abbiamo raggiunto la trasfezione stabile di E. necatrix traducendo merozoiti di seconda generazione11. L'inoculazione delle sporozoiti trasfette di E. ac...
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Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (2017YFD0501200) e dalla National Natural Science Foundation of China (31572507, 31772728 e 31873007).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| ATP-disodico | Sigma | A26209 | |
| Cellulosa DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| Pompa a flusso costante | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | ||
| Perle di vetro | Sigma | Z250473-1PAK | |
| Glucosio | Sigma | n. V900116 | |
| Glicina | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | n. V900041 | |
| Centrifuga a bassa velocità | BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| Miscelatore magnetico | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| Selezionatore cellulare MoFlo | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| Dispositivo di nucleofeczione | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll (soluzione madre a gradiente DG) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Taurodesossicolato di sodio idrato | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuga | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| La composizione del DMEM: 4,5 g/L di glucosio con piruvato di sodio, L-glutammina e 25 mM di HEPES. | |||
| Trypsin | Solarbio | T8150 | |
| Miscelatore a vortice | Pechino Nord TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| Termostato per bagnomaria | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
