Fornito qui è un protocollo che dettaglia i passi per stabilire un modello animale di dolore cronico post-ischemia (CPIP). Questo è un modello ben riconosciuto che imita la sindrome del dolore regionale complesso umano di tipo I. Vengono ulteriormente valutate le ipersensibilità meccaniche e termiche, così come i comportamenti nocifensivi indotti dalla capsaicina osservati nel modello di ratto CPIP.
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Articolo metodologico
Modello di dolore cronico post-ischemia per la sindrome del dolore regionale complessa Tipo-I nei ratti
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In questo articolo
Sommario
Abstract
La sindrome del dolore regionale complessa di tipo I (CRPS-I) è una malattia neurologica che causa forti dolori tra i pazienti e rimane una condizione medica irrisolta. Tuttavia, i meccanismi sottostanti di CRPS-I devono ancora essere rivelati. È noto che l'ischemia/reperfusione è uno dei fattori principali che causa CRPS-I. Per mezzo di ischemia prolungata e di reperfusione dell'arto posteriore, è stato stabilito il modello di dolore post-ischemia del ratto (CPIP) per imitare CRPS-I. Il modello CPIP è diventato un modello animale ben riconosciuto per studiare i meccanismi di CRPS-I. Questo protocollo descrive le procedure dettagliate coinvolte nella creazione del modello di ratto del CPIP, compresa l'anestesia, seguita da ischemia/reperfusione dell'arto posteriore. Le caratteristiche del modello CPIP del ratto vengono ulteriormente valutate misurando le ipersensibilità meccaniche e termiche dell'arto posteriore, nonché le risposte nocifensive all'iniezione acuta di capsaicina. Il modello CPIP ratto presenta diverse manifestazioni CRPS-I-like, tra cui edema dell'arto posteriore e iperemia nella fase iniziale dopo l'istituzione, ipersensibilità termiche e meccaniche persistenti, e aumentato le risposte nocifensive all'iniezione di capsaicina acuta. Queste caratteristiche lo rendono un modello animale adatto per ulteriori indagini sui meccanismi coinvolti in CRPS-I.
Introduzione
Sindrome del dolore regionale complessa (CRPS) reprents sintomi di dolore complesso e cronico risultante da fratture, traumi, chirurgia, ischemia o lesione nervosa1,2,3. CRPS è classificato in due sottocategorie: CRPS tipo-I e tipo-II (CRPS-I e CRPS-II)4. Studi epidemiologici hanno rivelato che la prevalenza di CRPS era di circa 1:20005. Il CRPS-I, che non mostra evidenti danni ai nervi, può provocare dolore cronico e influisce drammaticamente sulla qualità della vita dei pazienti. Gli attuali trattamenti disponibili mostrano effetti terapeutici inadeguati. Pertanto, CRPS-I rimane ancora un problema clinico importante e impegnativo che deve essere affrontato.
Stabilire un modello animale preclinico che imita CRPS-I è fondamentale per esplorare i meccanismi alla base di CRPS-I. Per affrontare questo problema, Coderre et al. ha progettato un modello di ratto applicando ischemia prolungata e reperfusione all'arto posteriore per ricapitolare CRPS-I6. È noto che la lesione ischemia/reperfusione è tra le principali cause di CRPS-I7. Il modello CPIP ratto presenta molti sintomi CRPS-I-like, che includono edema degli arti posteriori e iperemia nella fase iniziale dopo la creazione del modello, seguita da persistenti ipersensibilità termiche e meccaniche6. Con l'aiuto di questo modello, si propone che la sensibilizzazione centrale al dolore, l'attivazione del canale TRPA1 periferico e la generazione di specie reattive di ossigeno, ecc. contribuiscano al CRPS-I8,9,10. Recentemente abbiamo stabilito con successo il modello di ratto CPIP ed eseguito il sequenziamento dell'RNA dei gangli della radice dorsale (DRG) che innervano la zampa posteriore colpita11. Abbiamo scoperto alcuni potenziali meccanismi che sono probabilmente coinvolti nella mediazione delle ipersensibilità del dolore di CRPS-I11. Abbiamo inoltre identificato il potenziale vanilloide 1 (TRPV1) del recettore transitorio nei neuroni DRG come importante contributore alle ipersensibilità meccaniche e termiche di CRPS-I12.
In questo studio, abbiamo descritto le procedure dettagliate coinvolte nella creazione del modello di ratto di CPIP. Abbiamo ulteriormente valutato il modello CPIP del ratto misurando le ipersensibilità meccaniche e termiche e la sua reattività alla sfida della capsaicina acuta. Proponiamo che il modello CPIP del ratto possa essere un modello animale affidabile per ulteriori indagini sui meccanismi coinvolti in CRPS-I.
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Protocollo
I protocolli sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico Animale dell'Università Medica Cinese .
1. Animali
- Ottenere topi Maschi Sprague-Dawley (SD) (280-320 g, 8-10 settimane di età) da Shanghai Laboratory Animal Center. Ospitate gli animali nel Laboratorio Animal dell'Università Medica Cinese di zhejiang. Si noti che le condizioni di allevamento devono includere cicli di luce/buio 12 h/2h e mantenere la temperatura costante a 24 gradi centigradi. Fornire acqua e cibo al libitum. Si noti che un totale di 48 ratti sono utilizzati in questo studio. Una nota, in questo modello, abbiamo bisogno di osservare la risposta al dolore durante l'intero processo. Se viene applicato il farmaco antidolorifico, allora non possiamo stabilire con successo il modello di dolore. Dopo gli esperimenti, i ratti vengono sacrificati.
2. Stabilimento del modello CPIP
- Anestesizzare tutti i ratti (compresi i gruppi di modelli finto e CPIP) con fenobarbital di sodio (50 mg/kg, iniezione intraperitale [i.p.]). Mantenere l'anestesia con un massimo di 20 mg/kg/h fenobarbital [i.p.], se necessario. Controllare i riflessi di ogni animale pizzicando la zampa posteriore o la punta della coda con la pinze. Assicurarsi che i ratti non siano reattivi prima della creazione del modello. Posizionare l'unguento veterinario sugli occhi per evitare la secchezza durante la procedura. Posizionare i ratti anestesi su un cuscinetto riscaldato mantenuto a 37 gradi centigradi per la procedura seguente.
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Ischemia e reperfusione della zampa posteriore
- Lubrificare la zampa posteriore destra e la caviglia con glicerolo una volta che il ratto è anetizzato.
- Far scorrere un Nitrile 70 Durometer O-ring con un diametro interno di 7/32" (5,5 mm) nel lato più grande di un tubo Eppendorf da 1,5 ml (con tappo a scatto tagliato prima dell'uso). Inserire con attenzione la zampa posteriore nel tubo Eppendorf cavo fino a raggiungere il fondo.
- A poco a poco far scorrere l'anello O dal tubo all'arto posteriore destro vicino all'articolazione della caviglia e posto per 3 h. Applicare lo stesso trattamento a un gruppo finto di ratti, tranne che un O-ring rotto, che viene tagliato e non dovrebbe indurre ischemia, dovrebbe essere posizionato intorno alla caviglia.
- Tagliare l'O-ring 3 h dopo il passo ischemia. Osservare attentamente il ratto fino a quando non recupera abbastanza coscienza per mantenere la recumbenza sternale. Si noti che il ratto che ha ricevuto l'anestesia non deve essere rimesso alla compagnia di altri ratti fino a quando non completamente recuperato.
3. Test comportamentali nocifensivi
- Posizionare il ratto in una camera trasparente in plexiglas seduta su un pavimento in rete. Abituare il ratto per 0,5 h prima di qualsiasi test comportamentale.
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Allodica meccanica
- Utilizzare filamenti von Frey (0,4, 0,6, 1,0, 2,0, 4.0, 6.0, 8.0, 15.0 e 26,0 g) per il test. Iniziare il test dal filamento medio (4,0 g). Applicare verticalmente i filamenti sulla superficie plantare centrale della zampa posteriore. Applicare leggermente la forza adatta per piegare il filamento fino a 5 s. Un'improvvisa retrazione della zampa posteriore in risposta agli stimoli è considerata un comportamento nocifensivo. Condurre la prova di allodinia meccanica nei giorni -3, -2, -1 e ogni altro giorno fino al giorno 13.
- Applicare il metodo di test verso l'alto per testare la soglia. Applicare il metodo Dixon per calcolare la soglia di prelievo della zampa del 50% (PWT)13,14,15.
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Iperalgesia termica
- Utilizzare il metodo di Hargreaves per esaminare l'iperalgesia termica. Puntare direttamente il fascio di luce emesso da una lampadina (50 W) alla zampa posteriore per misurare la latenza di ritiro della zampa (PWL). Impostare 20 s come soglia di taglio per evitare lesioni eccessive dal riscaldamento.
- Ripetere ogni test 3x in intervalli di 5 min per ogni zampa posteriore. Prendere la media di questi tre test come il PWL di ogni ratto16. Eseguire il test di iperalgesia termica nei giorni -3, -2, -1 e ogni altro giorno fino al giorno 13.
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Comportamento nocifensivo acuto indotta da capsaicina
- Preparare la soluzione di riserva di capsaicina (200 mM) utilizzando il solfuro dimetile (DMSO) e diluire ulteriormente a 1:1000 in salina sterile con buffer di fosfato (PBS) per l'iniezione di zampe posteriori. La concentrazione finale di DMSO in PBS è dello 0,1% (il veicolo contiene lo 0,1% di DMSO solo in PBS). Iniettare capsaicina o veicolo nella zampa posteriore (iniezione intraplanare) ad un volume di 50 gradi centigradi utilizzando un ago da 30 G attaccato a 1 mL di siringa.
- Registrare il comportamento nocifensivo (ad esempio, leccare, mordere o indietreggiare della zampa iniettata) utilizzando una videocamera per 10 min subito dopo l'iniezione e quantificata successivamente come descritto in precedenza17,18,19.
- Valutazione dell'edema della zampa posteriore: valutare l'edema della zampa posteriore misurando l'aumento del diametro della zampa. Misurare con una pinza digitale e calcolare la differenza tra il valore basale e il valore di prova osservato in diversi punti temporali. Valutare le variazioni dello spessore della zampa a 15 min, 24 h, 48 h e 72 h dopo l'istituzione del modello.
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Risultati
Dopo aver posizionato l'Anello O sulla caviglia, la pelle della zampa posteriore ipsilaterale ha mostrato cianosi, un'indicazione di ipossia tissutale (Figura 1A). Dopo aver tagliato l'anello O, la zampa posteriore ipsilaterale ha cominciato a riempirsi di sangue e ha mostrato un robusto gonfiore, che ha dimostrato un intenso segno di iperemia (Figura 1A). Il gonfiore della zampa è gradualmente diminuito e riportato alla normali...
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Discussione
Questo protocollo descrive i metodi dettagliati per stabilire un modello CPIP di ratto applicando l'ischemia/reperfusione agli arti posteriori dei ratti. Si tratta di valutare l'aspetto degli arti posteriori, l'edema, le ipersensibilità meccaniche/termiche e i comportamenti nocifensivi acuti in risposta all'iniezione di capsaicina.
L'ischemia/reperfusione degli arti è un fattore comune che contribuisce alla CRPS-I nei pazienti umani12. Questo protocollo descrive come st...
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse in quest'opera.
Ringraziamenti
Questo progetto è stato sponsorizzato dalla National Natural Science Foundation of China (81873365 e 81603676), dai Fondi Provinciali di Scienze Naturali di Ehejiang per giovani studiosi distinti (LR17H270001) e dai fondi di ricerca dell'Università Cinese di Medicina dello Q2019J01, 2018 -Y37, 2018-Y19).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tubo Eppendorf da 1,5 ml | Eppendorf | 22431021 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D1435 | |
| Capsaicina | APEXBIO | A3278 | |
| Calibro digitale | Meinaite | NA | |
| O-ring | O-ring West | Nitrile 70 Durometro | 7/32 in. diametro interno |
| Apparecchio per test plantare | UGO Basile, Italia | 37370 | |
| filamenti von Frey | UGO Basile, Italia | NC12775 |
Riferimenti
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