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Articolo metodologico

Infezione in vivo con Leishmania amazonensis per valutare la virulenza dei parassiti nei topi

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DOI:

10.3791/60617

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20 febbraio 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Institute of Bioscience, University of Sao Paulo

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo compilato per valutare l'infezione cutanea dei topi con Leishmania amazonensis. Questo è un metodo affidabile per studiare la virulenza dei parassiti, consentendo una visione sistemica della risposta dell'ospite vertebrato all'infezione.

Abstract

Leishmania spp. sono parassiti protozoi che causano leishmaniosi, malattie che presentano un ampio spettro di manifestazioni cliniche da lesioni cutanee a lesioni viscerali. Attualmente, si stima che 12 milioni di persone siano infettate dalla Leishmania in tutto il mondo e oltre 1 miliardo di persone viva a rischio di infezione. La leishmania amazonensis è endemica in America centrale e meridionale e di solito porta alla forma cutanea della malattia, che può essere visualizzata direttamente in un modello animale. Pertanto, i ceppi di L. amazonensis sono buoni modelli per gli studi di leishmaniosi cutanea perché sono anche facilmente coltivati in vitro. I topi C57BL/6 imitano la progressione della malattia guidata da L. amazonensisosservata nell'uomo e sono considerati uno dei migliori modelli di ceppi di topi per la leishmaniosi cutanea. Nell'ospite dei vertebrati, questi parassiti abitano i macrofagi nonostante i meccanismi di difesa di queste cellule. Diversi studi utilizzano saggi di infezione da macrofagio in vitro per valutare l'infettività del parassita in diverse condizioni. Tuttavia, l'approccio in vitro è limitato a un sistema cellulare isolato che ignora la risposta dell'organismo. Qui, compiliamo un metodo di infezione murina in vivo che fornisce una panoramica fisiologica sistemica dell'interazione ospite-parassita. Il protocollo dettagliato per l'infezione in vivo di topi C57BL/6 con L. amazonensis comprende la differenziazione dei parassiti in amastigoti infettivi, intorpidimento cutaneo dei topi, sviluppo della lesione e determinazione del carico di parassiti. Proponiamo questo metodo consolidato come il metodo più adeguato per gli studi fisiologici delle risposte immunitarie e metaboliche dell'ospite alla leishmaniosi cutanea.

Introduzione

Le leishmaniosi sono malattie infettive parassitarie prevalenti in tutto il mondo che rappresentano importanti sfide nei paesi in via di sviluppo e sono riconosciute come una delle più importanti malattie tropicali trascurate dall'Organizzazione Mondiale della Sanità1,2. Le leishmaniasi sono caratterizzate da manifestazioni cutanee, mucose e/o viscerali. Cutaneous leishmaniosi è di solito causata da L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica e L. aethiopica3. Questa forma della malattia è spesso auto-guarigione negli esseri umani a causa dell'induzione della risposta immunitaria cellulare protettiva. Tuttavia, la risposta immunitaria cellulare può fallire e la malattia può progredire nella diffusione della leishmaniosi cutanea diffusa4,5. Non esiste un vaccino disponibile a causa della diversità tra le specie di Leishmania e ospitare le provenienze genetiche6,7. Le opzioni di trattamento sono anche limitate in quanto la maggior parte dei farmaci attualmente disponibili sono costosi, tossici e/o possono richiedere un trattamento a lungo termine8,9. Inoltre, ci sono state segnalazioni di resistenza ai farmaci contro i trattamenti disponibili10,11.

L'agente causale delle leishmaniosi è il parassita protozoo Leishmania. Il parassita presenta due forme morfologiche distinte nel suo ciclo di vita: i promastigoti, la forma flagellata trovata nelle libellule; e amastigoti, la forma intracellulare trovata nei vacuoli parassitoforo dei macrofagi ospiti dei mammiferi12,13. La capacità degli amastigoti di invadere, sopravvivere e replicarsi nonostante i meccanismi di difesa dei macrofagi dell'ospite vertebrato sono soggette a molti studi14,15,16,17. Di conseguenza, diversi gruppi di ricerca hanno descritto i saggi di infezione da macrofagio in vitro per valutare l'impatto di specifici fattori ambientali, nonché i geni parassiti e ospiti sull'infettività dei parassiti. Questo test presenta diversi vantaggi, come la capacità di adattare gli studi a un formato ad alta produttività, un periodo di tempo relativamente più breve per ottenere risultati e un numero ridotto di animali da laboratorio sacrificati18. Tuttavia, i risultati dei test in vitro sono limitati perché non sempre replicano studi in vivo14,19,20,21. I saggi in vivo forniscono una panoramica fisiologica sistemica dell'interazione ospite-parassita, che non può essere completamente imitata da analisi in vitro. Ad esempio, gli studi immunologici possono essere eseguiti attraverso saggi immunohistochimici da sezioni di tessuto del piede raccolte o anche da linfonodi poplylitali per l'analisi delle cellule immunitarie recuperate22.

Gli animali sono spesso utilizzati come modello per le malattie umane nella ricerca biologica e biomedica per comprendere meglio i meccanismi fisiologici sottostanti delle malattie23. Nel caso della leishmaniosi, il percorso, il sito o la dose di inoculazione influenzano l'esito della malattia24,25,26,27. Inoltre, la suscettibilità e la resistenza all'infezione nell'uomo e nei topi sono altamente regolate dagli sfondi genetici dell'ospite e del parassita4,5,22,28,29,30,31. I topi BALB/c sono altamente sensibili all'infezione cutanea di L. amazonensis, mostrando una rapida progressione della malattia con la diffusione dei parassiti ai linfonodi, alla milza e al fegato32. Poiché la malattia può progredire verso metastasi cutanee, l'infezione può essere fatale. Al contrario, i topi C57BL/6 spesso sviluppano lesioni croniche con carichi di parassiti persistenti nei saggi dell'infezione da L. amazonensis 33. Di conseguenza, l'infezione da L. amazonensis con questa particolare specie di topi è stata considerata un ottimo modello per studiare le forme croniche di leishmaniosi cutanea negli esseri umani, perché imita la progressione della malattia meglio del modellodiinfezione dei topi BALB/c 5,34.

Quindi, proponiamo che l'infezione murina in vivo sia un metodo utile per gli studi fisiologici della virulenza Leishmania applicabili alla malattia umana, consentendo una visione sistemica dell'interazione ospite-parassita. Rivisitando i saggi consolidati22, presentiamo qui un protocollo graduale compilato dell'infezione in vivo di topi C57BL/6 con L. amazonensis che comprende la differenziazione del parassita in amastigoti assici, topi pedana cutanea inoculazione, sviluppo delle lesioni, determinazione del carico di parassiti. Questo protocollo può essere adattato ad altri ceppi di topi e specie di Leishmania che causano leishmanie cutanee. In conclusione, il metodo qui presentato è fondamentale per identificare nuovi bersagli e vaccinianti-Leishmania, nonché negli studi fisiologici delle risposte immunitarie e metaboliche dell'ospite all'infezione da Leishmania.

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Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dall'Animal Care and Use Committee presso l'Istituto di Bioscienze dell'Università di San Paolo (CEUA 342/2019) e sono state condotte in conformità con le raccomandazioni e le politiche per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dello Stato di San Paolo (Lei Estadual 11.977, 25/08/2005) e il governo brasiliano (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Tutti i passaggi descritti nelle sezioni da 1 a 5 devono essere eseguiti apartire aquanto in armadi a flusso laminare. Le attrezzature di protezione personale dovrebbero essere utilizzate durante la manipolazione di parassiti della Leishmania vivi.

1. Differenziazione in Vitro di L. amazonensis Promastigotes in Amastigotes axenic15,20,35,36,37,38

NOTA: in questo saggio è stato utilizzato l'uso del parassita L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269) (La). A seconda dello scopo dello studio, la forma di parassita infettiva può essere ottenuta sia attraverso la purificazione della forma metaclica utilizzando un gradiente di densità, come descritto in precedenza14, o differenziando i promastigoti in amastigoti assici, secondo il seguente protocollo.

  1. Coltivare I promastigoti in un flacone di coltura cellulare 25 cm2 contenente 10 mL di mezzo per promastigotes (pro-medio) (pH - 7,0).
  2. Incubare a 25 gradi centigradi per 3 giorni.
    NOTA: Utilizzare colture promastigote che sono state passaggiate in vitro meno di 10x per evitare la perdita di virulenza e cambiamenti di aneuploidia dei parassiti39,40,41,42,43,44.
  3. Pipette 5 mL di fase di crescita logaritmica della coltura promastigote in un nuovo flacone di 25 cme 2.
  4. Aggiungere 5 mL di mezzo per amastigotes axeni (ama-medio) (pH - 5,2).
  5. Incubare a 34 gradi centigradi per 3-4 giorni.
  6. Dividere la coltura diluindo con ama-medium ad un rapporto di 1:3 in un nuovo pallone da 25 cm2.
  7. Incubare a 34 gradi centigradi per 3-5 giorni.
    NOTA: Incubare gli amastigoti axenic fino a 5 giorni, in quanto rappresenta la fine della maturazione37.

2. C57BL/6 Footpad Infezione con L. amazonensis

NOTA: I topi C57BL/6 femminili (6-8 settimane) sono stati ottenuti e mantenuti presso l'Animal Center dell'Istituto di Scienze Biomediche dell'Università di San Paolo. Gli animali hanno ricevuto cibo e acqua al libitum.

  1. Contare la cultura degli amastigoti axenic trasferendo una sospensione parassita diluita in PBS a una camera di Neubauer (cioè emocitometro). Contare i parassiti non flagellati, che rappresentano forme di amastigotes.
    NOTA: In alternativa, Trypan blu (1:1) può essere utilizzato per il conteggio del numero di amastigotes vitali (cioè quelli non macchiati di blu Trypan).
  2. Diluire gli amastigoti axenic in PBS in base alla dose di inoculum desiderata e si raccomanda il numero di inoculum (1 x 106 amastigotes axenici in 50 - L di PBS).
  3. Caricare una siringa di tubercolina con un ago da 27 G con la sospensione parassita preparata.
  4. Anestesizzare un topo C57BL/6 utilizzando 3-5% isoflurane, come raccomandato da Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee45. Valutare la profondità anestetica testando la risposta del mouse a un pizzico di punta.
  5. Inoculare 50 L della sospensione del parassita omogeneizzato (1 x 106 amastigotes axenic o la dose di inoculum desiderata) nel tessuto subplanare del piede posteriore sinistro, utilizzando la siringa di tubercolina precedentemente caricata (passaggio 2.3).

3. Sviluppo della lesione del piede del mouse

  1. Misurare la progressione della lesione una volta alla settimana misurando lo spessore delle pedane sinistra (infetto) e destra (non infettate) utilizzando una pinza.
  2. Calcolare la differenza di spessore tra i piedi posteriori sinistro e destro settimanale per valutare la progressione della lesione.
  3. Tracciare le differenze calcolate sull'asse Y e il tempo dell'infezione sull'asse X e calcolare la significatività statistica.
    NOTA: Secondo le raccomandazioni dei Comitati per la cura degli animali e l'uso, gli animali devono essere sacrificati prima che la lesione infetta diventi ulcerata, perché le ulcere cutanee possono portare a infezioni secondarie. Come mostrato nella Figura supplementare 1, ci vogliono circa 10 settimane perché le lesioni presentino segni di ulcerazione con la dose parassitaria (106 amastigoti assici) e ceppo ospite (C57BL/6) utilizzato in questo protocollo. I topi devono essere sacrificati per l'estrazione della lesione prima che si osservino i segni di ulcerazione.

4. Topi Footpad Lesion Extraction and Parasite Limiting Diluizione

  1. Preparare una piastra di 96 pozze (fondo piatto) per il diluizione limitante46,47 aggiungendo 180 -L di pro-medio a tutti i pozzetti.
    NOTA: Utilizzare quattro corsie di piastra (metà della piastra) per ogni animale, che rappresentano i saggi quadruplicati (cioè, animale 1 - corsie A-D; animale 2 - corsie E-H).
  2. Aggiungere 1 mL di pro-medio in un tubo di smerigliatrice di tessuto di vetro per lesione e pesare il tubo.
    NOTA: Il tubo deve essere mantenuto sterile, in modo da utilizzare un coperchio sterile e pesare il tubo con il coperchio chiuso, se pesa all'esterno dell'armadio a flusso laminare.
  3. Sacrificare l'animale in una camera di CO2, seguendo le raccomandazioni dei Comitati per la cura e l'uso degli animali. Disinfettare l'animale spruzzando con il 70% di etanolo.
  4. Accisa il piede dell'animale alle talloni per estrarre il piede infetto e spruzzare 70% di etanolo sul piede per la disinfezione. Garantire la sterilizzazione delle forbici e delle pinze mantenendole imbevute del 70% di etanolo.
  5. Posizionare il pedonale infetto in una parabola Petri sterile e dissezionare usando pinze sterili e un bisturi per raccogliere tutti i tessuti molli. Scartare le ossa.
    NOTA: L'uniformità nella fase di dissezione è consigliata per evitare il recupero dei tessuti di parte.
  6. Trasferire i tessuti raccolti al tubo di smerigliatrice del tessuto di vetro con pro-medio, quindi pesare nuovamente il tubo per determinare il peso della lesione.
    NOTA: Evitare di posizionare le pinze e il bisturi direttamente nel mezzo, in quanto piccoli volumi possono essere rimossi, con conseguente sottovalutazione del peso del tessuto. Il peso della lesione viene calcolato sottraendo il peso del tubo contenente pro-medio con il tessuto raccolto dal peso del tubo contenente solo pro-medio.
  7. Omogeneizzare il tessuto 10x utilizzando la smerigliatrice per la rottura completa dei tessuti.
  8. Lasciare sedimentare la miscela per 10 min, quindi raccogliere 20 .
  9. Caricare 20 -L del supernatante nella colonna 1st della corsia 1st della 96 piastra ben preparato al passo 4.1. Ripetere questa operazione per le tre corsie successive per avere quadruplicati per ogni animale (ad esempio, per l'animale 1 aggiungere 20 L a ciascun pozzo e etichettare A1, B1, C1 e D1).
  10. Omogeneizzare ogni pozzo nella colonna 1st 10x utilizzando una pipetta multicanale. Quindi, trasferire 20 l dei campioni diluiti dalla colonna 1st alla colonna 2nd.
    NOTA: È importante omogeneizzare ogni pozzo 10x da una colonna all'altra.
  11. Ripetere il passaggio 4.10 in tutte lecolonne rimanenti fino all'ultima colonna (12th ) ed eliminare gli ultimi 20 l del campione diluito.
    NOTA: Modificare le punte dopo ogni diluizione per evitare contaminazioni incrociate.
  12. Sigillare le piastre con un film e incubare a 25 gradi centigradi per 7 giorni in una camera umida.

5. Determinazione del carico del parassita della lesione

  1. Analizzare le piastre dopo 7 giorni di incubazione utilizzando un microscopio invertito per determinare l'ultimo pozzo contenente parassiti per ogni corsia.
    NOTA: È anche possibile avere un'indicazione della crescita dei parassiti, o densità cellulare, attraverso l'analisi visiva dei cambiamenti di colore e della torbidità del mezzo.
  2. Calcolare il carico del tessuto reitino per ogni corsia dividendo il fattore di diluizione per peso della lesione.
    NOTA: In una corsia specifica, se i parassiti sono presenti solo nelle colonne 1-5 (cioè, i pozzi A1-A5 sono positivi per la crescita dei parassiti), ciò significa che la colonna 5 conteneva solo 1 parassita, la colonna 4 conteneva 10 parassiti e così via, in multipli di dieci. La colonna 1 contiene 104 parassiti, che rappresenta il numero di parassiti nei 20 - L iniziali di supernatante (il campione non diluito nel passaggio 4.7). Poiché questo 20 l è stato diluito con 180 gradi L di pro-medio, il tubo iniziale conteneva 5 x 105 parassiti: (1 x 104) / (0,02 mL) - 5 x 105 parassiti/1 mL. Quindi, il carico del parassita in tale lesione può essere calcolato dividendo la concentrazione iniziale del parassita per il peso della lesione: (5 x 105) / peso della lesione (vedi passo 4.6).
  3. Tracciare la media del risultato quadruplicato per ogni animale con una scala Y del tronco.

6. Analisi statistiche

  1. Rappresentano i dati come media: deviazione standard utilizzando almeno cinque animali per gruppo sperimentale come repliche.
  2. Eseguire l'analisi statistica utilizzando un test a due code non accoppiato, considerando significativo un valore p < 0,05.

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Risultati

I parassiti della Leishmania protozoi esistono in due forme di sviluppo durante il loro ciclo di vita invertebrati e ospiti di vertebrati: promastigoti, le forme proliferanti che si trovano nel lume della landanella femmina; e amastigoti, le forme proliferanti che si trovano nei vacuoli parassofosi delle cellule ospiti dei mammiferi. I promastigoti hanno un corpo allungato di circa 1,5 m di larghezza e di 20 m di larghezza, con un flagello che emerge tipicamente dall'estremità an...

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Discussione

L'analisi dell'infezione in vivo descritta in questo protocollo consente a qualsiasi ricercatore di valutare la leishmaniosi cutanea in vivo considerando l'interazione ospite-parassita in uno scenario sistemico. Questi saggi sono stati utilizzati da molti gruppi22,24,27,29,31,32,34,

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Ringraziamo la prof.ssa Niels Olsen Saraiva Camara dell'Animal Center dell'Istituto di Scienze Biomediche dell'Università di San Paolo per il supporto e la prof.ssa Silvia Reni Uliana per aver fornito il macinino di tessuto di vetro. Questo lavoro è stato sostenuto da Sao Paulo Research Foundation (FAPESP - sovvenzione 2017/23933-3).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra a 96 pozzettiGreiner bio-ne655180Una piastra a fondo piatto per limitare il saggio di diluizione
adeninaSigmaA8626Supplemento aggiunto al calibro M199 per terreni di coltura cellulare
Mitutoyo700-118-20Un calibro per misurare lo spessore del
pallone per colture cellulariCorning353014Un pallone per colture cellulari da 25 cm2 per coltivare la centrifuga antiparassitaria Leishmania
Eppendorf5804RUn'apparecchiatura utilizzata per separare i campioni in base alla sua densità
CO2 incubatore 34 ° CThermo Scientific3110Un incubatore per la differenziazione degli amastigoti
etanoloMerckK50237083820Un disinfettante per articoli generici
siero fetale bovinoGibco12657-029Integratore aggiunto al terreno di coltura cellulare M199 tubo
di macinazione per tessuti in vetroThomasScientific 3431 E04Un tubo per raccogliere e distruggere il tessuto
del cuscinetto del piede infettoglucosioSynthG1008.01.AHSupplemento aggiunto ai terreni di coltura cellulare M199
GraphPad Prism SoftwareGraphPadUn software utilizzato per tracciare i dati e calcolare la significatività statistica
heminSigmaH-2250Supplemento aggiunto ai terreni di coltura cellulare M199
HEPESPromegaH5303Supplemento aggiunto all'incubatore per terreni di coltura cellulare M199
25 ° CFanem347CDUn incubatore per la coltivazione di promastigoti
microscopio invertitoNikonTMSUn'apparecchiatura utilizzata per analizzare visivamente le colture di promastigote e amastigote
isofluranoUn anestetico inalante per topi (3-5%)
cabina a flusso laminareVecoVLFS-09Una cabina di biosicurezza utilizzata per l'area di lavoro asettica
Cella M199 terreni di colturaGibco31100-035Un terreno di coltura cellulare per la microprovetta per microcentrifuga per la coltivazione di Leishmania
AxygenMCT150CUna microprovetta utilizzata per la raccolta, l'elaborazione e la conservazione dei campioni
pipetta multicanaleLabsystemsF61978Una pipetta multicanale utilizzata per limitare il saggio di diluizione
NaHCO3Merck6329Supplemento aggiunto ai terreni di coltura cellulare M199
NaOHSigmaS8045Supplemento aggiunto ai terreni di coltura cellulare M199
Camera NeubauerHBG2266Un emocitometro per contare il
microscopio otticoNikonE200Un'apparecchiatura ottica utilizzata per contare
parafilmdei parassiti Bemis349Una plastica flessibile e resistente per sigillare il piastra
penicillina/streptomicinaGibco15140122Integratore aggiunto ai terreni di coltura cellulare M199
Piastre di PetriTPP93100Una piastra sterile per sezionare il pipetman tissutale del poggiapiedi
KitGilsonF167360Un kit di micropipette contenente quattro pipettatori (P2 P20 P200 P1000)
bilanciaQuimisBG2000Un'attrezzatura utilizzata per pesare il cuscinetto plantare raccolto bisturi per lesioni
Solidor10237580026Un bisturi per tagliare e raccogliere la pipetta sierologica tissutale del cuscinetto
plantare 10 mLNest327001Una pipetta sterile utilizzata per il trasferimento di punte di volumi di millilitri
AxygenUna punta di pipetta utilizzata per il trasferimento di volumi di microlitri
Trypan blueGibco15250-061Un colorante utilizzato per contare i parassiti vitali
tripticasi peptoneMerckM199 per colture cellulari
BD305945Una siringa con ago da 27G per inoculare la sospensione antiparassitaria
al a sospensione dei parassiti il Integratore aggiunto alla siringa di tubercolina

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