Articolo metodologico

Sistema di cocultura multidimensionale per modellare la progressione del carcinoma squamoso polmonare

DOI:

10.3791/60644

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17 marzo 2020

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1Oncology R&D group, Pfizer Worldwide Research and Development

In questo articolo

Sommario

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È stato sviluppato un sistema di modelli in vitro per catturare i cambiamenti architettonici dei tessuti durante la progressione del carcinoma squamoso polmonare (LUSC) in una co-coltura tridimensionale (3D) con fibroblasti associati al cancro (CAF). Questo sistema organoide fornisce una piattaforma unica per studiare i ruoli dei diversi cambiamenti delle cellule tumorali-intrinseche ed estrinseci che modulano il fenotipo tumorale.

Abstract

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Le interazioni tumora-stroma svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo del carcinoma squamoso polmonare (LUSC). Tuttavia, comprendere come queste interazioni dinamiche contribuiscono ai cambiamenti architettonici dei tessuti osservati durante la tumorigenesi rimane difficile a causa della mancanza di modelli appropriati. In questo protocollo viene descritta la generazione di un modello di cocultura 3D utilizzando una coltura cellulare primaria LUSC nota come TUM622. Le cellule TUM622 sono state create da un xenotrapianto derivato dal paziente LUSC (PDX) e hanno la proprietà unica di formare strutture acinariche quando seminate in una matrice di membrana seminterrato. Dimostriamo che TUM622 acini nella cocultura 3D riassume le caratteristiche chiave dell'architettura tissutale durante la progressione del LUSC, nonché le interazioni dinamiche tra le cellule LUSC e i componenti del microambiente tumorale (TME), compreso l'extracellulare (ECM) e fibroblasti associati al cancro (CAF). Adattiamo ulteriormente il nostro principale protocollo di coltura 3D per dimostrare come questo sistema potrebbe essere utilizzato per varie analisi a valle. Nel complesso, questo modello organoide crea una piattaforma biologicamente ricca e adattabile che consente di ottenere informazioni sui meccanismi cellulari-intrinseci ed estrinseci che promuovono l'interruzione delle architetture epiteliali durante la progressione carcinoma e aiuteranno la ricerca di nuovi bersagli terapeutici e marcatori diagnostici.

Introduzione

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Il cancro del polmone è la principale causa di mortalità legata al cancro in tutto il mondo. Il carcinoma a cellule squamose polmonari (LUSC), che è il secondo tipo più comune di cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC) e rappresenta circa il 30% di tutto il cancro del polmone, viene spesso diagnosticato in fase avanzata e ha una prognosi infausta1. Le opzioni di trattamento per i pazienti affetti da LUSC sono un'importante necessità insoddisfatta che può essere migliorata da una migliore comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari sottostanti che guidano la tumorigenesi LUSC.

Come per la maggior parte....

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Protocollo

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1. Passare e coltivare TUM622 Cellule e CAF in colture 2D

  1. Passare e coltivare cellule TUM622
    1. Reagenti di dissociazione di dissociazione di coltura 3D caldi (vedi Tabella dei materiali)per le cellule TUM622 a 37 gradi centigradi.
    2. Passaggio delle cellule TUM622 con l'80% di confluenza nei flaconi 2D. Di solito, questo si verifica 1 settimana dopo il passaggio.
    3. Eliminare il vecchio mezzo da un flacone T75 e lavare una volta con 6 mL di buffer HEPES. Evitare di pipettare direttamente sulle cellule.
    4. Aspirati il buffer HEPES. Aggiungere 4 mL di trypsin/EDTA (0,25 mg/mL, vedere Tabella dei materiali<....

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Risultati

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TUM622 e CAF nelle impostazioni cultura 2D
Figura 1 presenta la morfologia tipica delle cellule TUM622 e CAF nella coltura 2D. Le cellule TUM622 sono arrotondate con grandi nuclei, mentre i CAF sono piatti e allungati. Le cellule TUM622 possono raggiungere l'80%-90% di confluenza nella coltura. Un'ulteriore proliferazione porta a più, ma le cellule più piccole aggregate in colonie che non entrano in contatto diretto. Al contrario, i CAF pr.......

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Discussione

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I tumori sono tessuti eterogenei composti da cellule tumorali coesistenti fianco a fianco con cellule stromali come fibroblasti associati al cancro, cellule endoteliali e cellule immunitarie all'interno dell'ECM. Insieme, questi diversi componenti si incrociano e influenzano il microambiente tumorale, svolgendo un ruolo attivo nel guidare la tumorigenesi, un processo che comporta cambiamenti progressivi nell'architettura tumorale. Idealmente, un modello in vitro di sviluppo del tumore dovrebbe essere in grado di catturar.......

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Dichiarazioni

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Gli autori sono dipendenti e azionisti di Pfizer Inc.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Magali Guffroy, John Kreeger e Stephani Bisulco del gruppo Pfizer-Oncology Histopathology and Biomarker per il supporto patologico/istologico e Michael Arensman per la revisione critica del manoscritto. Ringraziamo anche il pfizer Postdoctoral Program e il gruppo Oncology R&D, in particolare Robert Abraham, Puja Sapra, Karen Widbin e Jennifer Tejeda per il loro sostegno al programma.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Terreno di crescita epiteliale bronchialeLonzaCC-3170BEGM
Cell Strainer 40umThermoFisher352340Per il passaggio di cellule TUM622
Caspasi scissa 3 anticorpoTecnologia di segnalazione cellulare9661 (RRID:AB_2341188)Rabbit
CoolRack CFT30BiocisionBCS-138Per coltura 3D
CoolSink XT96FBiocisionBCS-536Per colture 3D
Kit di raccolta cellulare 3D CultrexBio-Techne3448-020-K
Cultrex (preferito per la co-coltura)Bio-Techne3443-005-01Per colture 3D
Anticorpo CXCR4AbcamAbcam Ab124824 (RRID:AB_10975635)
Anticorpo E-caderinaBD Biosciences610182 (RRID:AB_397581)Topo
GelCountOxford OptronixPer la conta e la misurazione degli Acini
Anticorpo GM130BD Biosciences610822 (RRID:AB_398141)Siero di capra di topo
Vector LabsS1000 (RRID:AB_2336615)Per l'immunofluorescenza
FBS inattivato termicamenteGibco10082-147Per CAF
Gel per campioni istologiciRichard Allan ScientificHG-4000-012Per l'immunofluorescenza
Integrina alfa 6 anticorpoMillipore SigmaMab1378 (RRID:AB_2128317)Rat
Involucrin antibodyAbcamAb68 (RRID:AB_305656)Topo
Ki67 anticorpoAbcam Ab15580(RRID:AB_443209)Rabbit
Lab-Tec II camerato #1.5 German Coverglass SystemNalge Nunc International155379 (2)Per la cultura 3D
Lab-Tec II camerato #1.5 German Coverglass SystemNalge Nunc International155409 (8)Per colture 3D
L-GlutamminaGibco25030-081Per CAFs
Matrigel (preferito per mono-coltura)Corning356231Per colture 3D
anticorpi p63Cell Signaling Technology13109 (SRRID:AB_2637091)
Rabbit Pen/StrepGibco15140-122Per CAFs
ReagentPack Reagenti per sottocolturaLonzaCC-5034Per dissociazione cellulare TUM622
RPMIThermoFisher11875-093Per CAFs
Sox2 anticorpoCell Signaling Technology3579 (RRID:AB_2195767)Rabbit
TrypLE ExpressGibco12604-021Per dissociazione CAF
Vi-CellBechman CoulterContatore automatico di cellule
Anticorpo VimentinaAbcam AbcamAb92547 (RRID:AB_10562134)Coniglio
β-cateninaanticorpo Cell Signaling Technology2677s (RRID:AB_1030943)Topo
di coniglio

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
  2. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Ma....

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Sistema di cocultura 3Dinterazioni tra stroma e tumorematrice di membrana basalefibroblasti associati al cancrocellule TUM622modello di organoideanalisi di immunofluorescenzacitometria a flussoscreening di farmaci

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