Modellazione immunitaria predittiva dei tumori solidi

Sommario

L'uso di un approccio basato sull'RNA per determinare i profili immunitari quantitativi dei tessuti tumorali solidi e sfruttare le coorti cliniche per la scoperta di biomarcatori immuno-oncologici è descritto attraverso un protocollo molecolare e informatico.

Abstract

Le immunoterapie mostrano una promessa nel trattamento dei pazienti oncologici, ma l'eterogeneità complessa del microambiente tumorale rende difficile prevedere la risposta al trattamento. La capacità di risolvere le popolazioni relative di cellule immunitarie presenti dentro e intorno al tessuto tumorale ha dimostrato di essere clinicamente rilevante per comprendere la risposta, ma è limitata da tecniche tradizionali come la citometria di flusso e l'immunoistochimica ( IHC), a causa della grande quantità di tessuto richiesto, mancanza di indicatori di tipo cellulare accurati, e molti ostacoli tecnici e logistici. Un test (ad esempio, l'ImmunoPrism Immune Profiling Assay) supera queste sfide accogliendo sia piccole quantità di RNA che RNA altamente degradato, caratteristiche comuni dell'RNA estratto dal tessuto tumorale solido clinicamente archiviato. Il saggio è accessibile tramite un kit di reagenti e un'informatica basata su cloud che fornisce una soluzione di immunoprofiling quantitativa e ad alta velocità finale per le piattaforme di sequenziamento Illumina. I ricercatori iniziano con un minimo di due sezioni di tessuto incorporato in paraffina fissata in formalina (FFPE) o 20-40 ng di RNA totale (a seconda della qualità del campione), e il protocollo genera un rapporto del profilo immunitario che quantifica otto tipi di cellule immunitarie e dieci fuga immunitaria geni, catturando una visione completa del microambiente tumorale. Non è necessaria alcuna ulteriore analisi bioinformatica per utilizzare i dati risultanti. Con le coorti campione appropriate, il protocollo può essere utilizzato anche per identificare biomarcatori statisticamente significativi all'interno di una popolazione di pazienti di interesse.

Introduzione

La quantificazione dei linfociti infiltranti di tumore (TIL) e di altre molecole immunitarie correlate nei campioni di tumore umano solido (FFPE) fissati in formalina e paraffina (FFPE) ha dimostrato valore nella ricerca clinica^1,2,3. Tecniche comuni come la citometria di flusso e il sequenziamento dell'acido ribonucleico a cellule singole (RNA) sono utili per i tessuti freschi e il sangue⁴, ma non sono adatte per l'analisi dei materiali FFPE a causa dell'incapacità di creare sospensioni cellulari vitali. Gli attuali metodi che sono stati utilizzati per quantificare queste cellule nel tessuto FFPE soffrono di grandi sfide. L'immunoistochimica (IHC) e altri flussi di lavoro di imaging simili richiedono anticorpi specifici per rilevare le proteine della superficie cellulare, che possono essere difficili da standardizzare tra i laboratori per consentire la quantificazione riproducibile⁵. Piattaforme come il sistema nCounter si basano sull'espressione di singoli geni per definire le principali cellule immunitarie^6,limitando la sensibilità e la specificità del rilevamento. Sono disponibili metodi di sequenziamento dell'RNA più generici, insieme a strumenti software autonomi, ma richiedono un'ottimizzazione e una convalida significative prima dell'uso^{di 7,8,9,10,11,12}. Recenti progressi nella combinazione della microdissezione di cattura laser (LCM) con il sequenziamento dell'RNA per il tessuto FFPE hanno mostrato una promessa; tuttavia, per gli studi traslazionali, è necessaria una soluzione più ad alta produttività e chiavi in mano, che mira a identificare biomarcatori robusti^13,14. Metodi per generare biomarcatori multidimensionali, come la modellazione immunitaria predittiva, che definiscono le coorti dei pazienti, tra cui i soccorritori terapeutici, i sottotipi di cancro o gli esiti di sopravvivenza con elevata precisione predittiva e significato statistico stanno diventando sempre più importanti nell'era della medicina di precisione e dell'immunoterapia^15,16.

Per rispondere a questa esigenza, è stato sviluppato un test di profilazione immunitaria per consentire la quantificazione sensibile e specifica delle cellule immunitarie nel tessuto FFPE del tumore solido utilizzando reagenti standardizzati di sequenziamento dell'RNA e informazione basata su nubi. Oltre ad accomodare l'RNA degradato dal tessuto FFPE, il protocollo è in grado di ospitare l'RNA derivato dalla limitazione di campioni di tessuto come biopsie di aghi centrali, aspirati di aghi e tessuto micro o macro-sezionato. I dati dell'RNA di ogni campione vengono confrontati con un database di modelli di espressione genica di cellule immunitarie, chiamati modelli di espressione immunitaria dell'integrità, per quantificare le cellule immunitarie come percentuale delle cellule totali presenti nel campione. In breve, questi modelli sono stati costruiti utilizzando metodi di apprendimento automatico per identificare modelli di espressione multigenici unici da dati di interi trascrittiomi generati da popolazioni di cellule immunitarie purificate (utilizzando marcatori di superficie cellulare canonica isolati)^17,18. I modelli multidimensionali di Health Expression Models alla base della tecnologia consentono al saggio di quantificare ogni cellula immunitaria come percentuale delle cellule totali presenti nella miscela eterogenea. Ciò consente al ricercatore di generare confronti di cellule immunitarie tra e intracampioni, che hanno dimostrato di avere un valore clinico^19,20. Altre applicazioni includono la quantificazione della risposta immunitaria pre e post-trattamento, come descritto nei risultati rappresentativi. Il saggio riporta molteplici caratteristiche della contesto immunitaria del microambiente tumorale e tumorale, comprese le percentuali assolute di otto tipi di cellule immunitarie (derivati da modelli di espressione genica): CD4^- cellule T, CD8^- cellule T, CD56^- Cellule Killer naturale, CD19^- cellule B, CD14^- monociti, Treg, macrofagi M1 e macrofagi M2. Inoltre, il saggio riporta l'espressione (in trascrizioni per milione, o TPM) di dieci geni di fuga immunitaria: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1 e ARG1.

Il kit di reagent viene utilizzato per rendere le librerie di alta qualità pronte per la sequenziazione su una piattaforma Illumina seguendo un metodo di preparazione della libreria ibrida basata sull'acquisizione, come illustrato nella Figura 1. Se un ricercatore non ha una piattaforma di sequenziamento Illumina nel loro laboratorio, possono inviare i loro campioni a un laboratorio di base per il sequenziamento. Una volta generati, i dati di sequenziamento vengono caricati nel portale Prism per l'analisi automatizzata e un profilo quantitativo completo per ogni singolo campione, sotto forma di Rapporto Immunosito(Figura 2A), viene restituito all'utente. Gli utenti possono anche definire raggruppamenti di campioni nel portale Prism per generare un rapporto sui biomarcatori (Figura 2B),evidenziando biomarcatori statisticamente significativi che distinguono due coorti di pazienti. È importante sottolineare che i dati generati dal kit di reagenti sono solo per uso di ricerca e non possono essere utilizzati per scopi diagnostici.

Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro. In questo protocollo, l'RNA viene prima convertito in cDNA. Gli adattatori di sequenziamento sono legati e cDNA con collegamento adattatore viene amplificato e codificato a barre da PCR per creare una libreria di pre-cattura. Le sonde biotinylated vengono quindi ibridate a specifici obiettivi cDNA che vengono poi catturati utilizzando perline streptavidine. Il cDNA non associato e non mirato viene rimosso mediante lavaggio. Un arricchimento PCR finale produce una libreria post-cattura pronta per il sequenziamento. L'RNA totale deve provenire da campioni umani; rna può essere intatto o degradato (FFPE). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Rapporti immunitari rappresentativi. Il flusso di lavoro genera due report, un rapporto immunitario individuale (A) per ogni campione elaborato e un rapporto di biomarcatore (B) per le coorti di pazienti definite. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il protocollo richiede circa 16 h di tempo di preparazione (dall'RNA totale alle librerie pronte per il sequenziamento); tuttavia, esistono diversi punti di arresto facoltativi, come indicato nel protocollo. Il saggio si avvale della natura ricca e dinamica della trascrittomica per andare oltre i biomarcatori a singolo analita legacy a modelli multidimensionali di espressione genica, consentendo così una caratterizzazione biologica completa dei campioni di tessuto con standardizzazione reagenti e strumenti software facili da usare. Permette ai ricercatori di utilizzare una tecnologia contemporanea nel proprio laboratorio, sfruttando l'apprendimento automatico e un database di health Expression Models per ricavare profili immunitari quantitativi più accurati di preziosi campioni clinici e scoprire biomarcatori multidimensionali dell'RNA con analisi statistiche complete.

Protocollo

I campioni di tessuto umano utilizzati nei Risultati Rappresentativi qui illustrati sono stati acquistati da un'entità affidabile (TriStar Technology Group) e hanno informato il consenso dei donatori che consente la ricerca accademica e commerciale, nonché l'approvazione da parte di un'entità etica competente Comitato.

Parte I: Preparazione della libreria pre-cattura

1. Quantificazione e qualificazione dell'RNA

1. Quantificare l'RNA usando un saggio fluorometrico per determinare l'input appropriato per il saggio. Valutare la qualità dell'RNA di input utilizzando l'elettroforesi per determinare il numero di integrità dell'RNA (RIN) e la percentuale di frammenti > 200 nucleotidi (DV₂₀₀) valori.
   1. Per campioni di RNA intatti (RIN > 7) o parzialmente degradati (RIN - da 2 a 7) seguire le fasi di preparazione della libreria per l'RNA di alta qualità/intact, a partire dal passaggio 2.1. La qualità dell'RNA è importante per selezionare il tempo di frammentazione corretto nel programma Thermal Cycler #1 (Tabella supplementare 2).
   2. Per i campioni altamente degradati (ad es. RIN - 1 a 2 o FFPE), determinare il valore DV_200. Questi campioni non richiedono la frammentazione e seguiranno le istruzioni per l'RNA degradato, a partire dal passaggio 2.2.
2. Preparare la quantità appropriata di RNA totale per ogni campione per diluindo 20 ng di RNA (Alta qualità/RNA intatto con RIN > 2) o 40 ng di RNA (RNA degradato/FFPE con DV₂₀₀ > 20%) a 5 l in acqua priva di nuclenonsi. L'elaborazione di campioni con DV₂₀₀ < 20% non è consigliata. Per i campioni di RNA di controllo forniti con il kit, diluire 1 - L dell'RNA appropriato in 4 - L di acqua priva di nucleasi. I campioni di controllo seguiranno la stessa lavorazione descritta per i materiali RNA di alta qualità (intatto) o degradati (FFPE), come etichettato. Vedere la Tabella supplementare 1 per tutti i reagenti inclusi nel kit.

2. Frammentazione e priming dell'RNA

1. Seguite il passo 2.1.1 per l'RNA di alta qualità/Intact con RIN > 2.
   1. Per l'RNA di alta qualità, assemblare la reazione di frammentazione e innesco sul ghiaccio in un tubo PCR privo di nuclesiate secondo la Tabella 1.
      1. Mescolare accuratamente pipetting su e giù più volte. Quindi, brevemente girare verso il basso i campioni in una microcentrifuga
         NOTA: Per tutti i giri di centrifuga nel protocollo, si consiglia una velocità di 1.000 x g per almeno 3 s.
      2. Collocare i campioni in un ciclore termico e utilizzare il programma #1 (tabella supplementare 2).
      3. Trasferire immediatamente i tubi sul ghiaccio e procedere a First Strand cDNA Synthesis for High Quality RNA (Step 3.1). Per la preparazione simultanea di RNA sia di alta qualità che di RNA FFPE, iniziare la preparazione dell'RNA FFPE (fase 2.2) durante l'incubazione della frammentazione.

Miscela di frammentazione e priming	Volume (L)
RNA intatto o parzialmente degradato (20 ng)	5
Buffer di reazione di sintesi del primo filamento	4
Primer casuali	1
Volume totale	10

Tabella 1: reazione di frammentazione e priming per RNA di alta qualità. I componenti della reazione di frammentazione e innesco per l'RNA di alta qualità devono essere assemblati e mescolati sul ghiaccio in base ai volumi mostrati. Un mix master di First Strand Synthesis Reaction Buffer e Random Primers può essere fatto e aggiunto ai campioni di RNA.

2. Seguire il passo 2.2.1 per l'RNA Degradato/FFPE con DV₂₀₀ > 20%.
   1. Per l'RNA altamente degradato (FFPE) che non richiede la frammentazione, assemblare la reazione di innesco come descritto nella tabella 2. Per l'RNA intatto, ricordarsi di seguire il passo 2.1.
      1. Mescolare accuratamente pipetting su e giù più volte. Quindi, ruotare brevemente verso il basso i campioni in una microcentrifuga.
      2. Collocare i campioni in un ciclore termico e utilizzare programma #2 (tabella supplementare 2).
      3. Trasferire i tubi sul ghiaccio e procedere a First Strand cDNA Synthesis for Highly Degraded (FFPE) RNA (Step 3.2).

Reazione priming	Volume (L)
RNA FFPE (40 ng)	5
Primer casuali	1
Volume totale	6

Tabella 2: Reazione di innesco casuale per RNA altamente degradato. I componenti della reazione di innesco per l'RNA altamente degradato devono essere assemblati sul ghiaccio in un tubo PCR privo di nucleato.

3. Primo Strand cDNA Sintesi

1. Seguite il passaggio 3.1.1 per l'RNA di alta qualità/Intact con RIN > 2.
   1. Per l'RNA intatto (alta qualità), assemblare la reazione di sintesi del primo filamento sul ghiaccio in un tubo PCR privo di nuclesione secondo la tabella 3.
      1. Mantenere le reazioni sul ghiaccio, mescolare accuratamente pipetting su e giù più volte. Ruotare brevemente i campioni in una microcentrifuga e procedere direttamente all'incubazione della sintesi del primo filamento (passaggio 4).

Sintesi primo filo	Volume (L)
RNA frammentato e innescato (Fase 2.1.3)	10
Reagente di Specificità della Sintesi del Primo Strand	8
Miscela di Enzyme Sintesi Primo Filo	2
Volume totale	20

Tabella 3: Reazione di sintesi del primo filamento per RNA di alta qualità. I componenti della reazione di frammentazione e innesco per l'RNA di alta qualità devono essere assemblati e mescolati sul ghiaccio in base ai volumi dati. Un mix master di First Strand Synthesis Specificity Reagent e First Strand Synthesis Enzyme Mix può essere realizzato e aggiunto ai campioni di RNA frammentati e innescati.

2. Seguire il passaggio 3.2.1 per l'RNA Degraded/FFPE con DV₂₀₀ > 20%.
   1. Per l'RNA altamente degradato (FFPE), assemblare la reazione di sintesi della prima filamento sul ghiaccio in un tubo PCR privo di nucleatosi secondo la tabella 4.
      1. Mantenere le reazioni sul ghiaccio, mescolare accuratamente pipetting su e giù più volte. Ruotare brevemente i campioni in una microcentrifuga e procedere direttamente all'incubazione della sintesi del primo filamento (passaggio 4).

Sintesi primo filo	Volume (L)
RNA primed (Fase 2.2.3)	6
Buffer di reazione di sintesi del primo filamento	4
Reagente di specificità del primo filamento	8
Miscela di Enzyme Sintesi Primo Filo	2
Volume totale	20

Tabella 4: Reazione di sintesi del primo filamento per RNA altamente degradato. I componenti della reazione di frammentazione e innesco per l'RNA altamente degradato devono essere assemblati e mescolati sul ghiaccio in base ai volumi mostrati. Un mix master di First Strand Synthesis Reaction Buffer, First Strand Synthesis Specificity Reagent e First Strand Synthesis Enzyme Mix può essere realizzato e aggiunto ai campioni di RNA innescati.

4. Incubazione di sintesi del primo filo

1. Mantenere i tubi sul ghiaccio, mescolare accuratamente pipetting su e giù più volte. Ruotare brevemente i campioni in una microcentrifuga. Incubare i campioni in un ciclore termico preriscaldato seguendo il programma #3 (Tabella supplementare 2).

5. Secondo Strand cDNA Sintesi

1. Preparare la seconda reazione di sintesi cDNA filamento sul ghiaccio assemblando i componenti elencati nella tabella 5, compreso il primo prodotto di reazione del filamento del passo 4.1.

Reazione di sintesi del secondo filamento	Volume (L)
Primo prodotto di sintesi del filo (passaggio 4.1)	20
Buffer di reazione di sintesi del secondo filamento	8
Secondo Filo Sintesi Enzima Mix	4
Acqua priva di nucle	48
Volume totale	80

Tabella 5: Reazione di Seconda sintesi del filo. I componenti della reazione di sintesi cDNA del secondo filamento devono essere assemblati e mescolati sul ghiaccio in base ai volumi mostrati. Un mix master del secondo buffer di reazione di sintesi filo, secondo filo sintetizzatore mix, e acqua senza Nuclesione può essere fatto e aggiunto al primo prodotto di sintesi filo.

2. Mantenere i tubi sul ghiaccio, mescolare accuratamente pipetting su e giù più volte. Incubare in un ciclore termico seguendo il programma #4 (tabella supplementare 2).

6. cDNA Cleanup Utilizzando SPRI (Solid Phase Reversible Immobilization) Perline

1. Lasciare riscaldare le perline SPRI a temperatura ambiente per almeno 30 min prima dell'uso, quindi vortice SPRI Beads per circa 30 s per risospendere.
2. Aggiungere 144 l di perline risospese alla reazione di sintesi del secondo filamento (80 dollari l. Mescolare bene pipettando su e giù almeno 10 volte e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
3. Ruotare brevemente i tubi in una microcentrifuga e posizionarli su un rack magnetico per separare le perline dal supernatante. Dopo che la soluzione è chiara, rimuovere con attenzione e scartare il supernatale. Fare attenzione a non disturbare le perline, che contengono DNA.
4. Aggiungere 180 ll di etanolo appena preparato 80% ai tubi mentre si è sul rack magnetico. Incubare a temperatura ambiente per 30 s, quindi rimuovere e scartare con cura il supernatante.
5. Ripetere il passaggio 6.4 una volta per un totale di 2 passaggi di lavaggio.
6. Rimuovere completamente l'etanolo residuo. Lasciare i tubi sul rack magnetico e asciugare l'aria le perline per circa 3 min con il coperchio aperto, o fino a quando visibilmente asciugare. Non asciugare le perline, in quanto ciò può comportare un minor recupero del DNA.
7. Rimuovere i tubi dal magnete e aggiungere 53 buffer TE 0,1x (incluso nel kit reagente, vedere Tabella supplementare 1) alle perline. Pipette su e giù almeno 10 volte per mescolare accuratamente. Incubare per 2 min a temperatura ambiente.
8. Posizionare i tubi su un rack magnetico, permettendo alle perline di separarsi completamente dal supernatante. Trasferire 50 - L del supernatante per pulire tubi PCR privi di nuclea. Fare attenzione a non disturbare le perline. Questo è un punto di arresto opzionale nel protocollo, i campioni cDNA possono essere memorizzati a -20 gradi centigradi.

7. Termina riparazione della libreria cDNA

1. Assemblare la reazione di riparazione finale sul ghiaccio assemblando i componenti elencati nella tabella 6 al prodotto di sintesi del secondo filamento del punto 6.8.

Termina reazione di riparazione	Volume (L)
Secondo prodotto di sintesi filo (passaggio 6.8)	50
Termina buffer di reazione di riparazione	7
Mix di enzimi di riparazione finale	3
Volume totale	60

Tabella 6: Reazione di riparazione finale. I componenti della reazione di riparazione finale devono essere assemblati e mescolati sul ghiaccio in base ai volumi indicati. Un mix master del buffer di reazione di riparazione finale e il mix enzimatico di riparazione finale può essere fatto e aggiunto al secondo prodotto di sintesi filo.

2. Impostare una pipetta a 50 o più, quindi pipettare l'intero volume su e giù almeno 10 volte per mescolare accuratamente. Centrifuga brevemente per raccogliere tutti i liquidi dai lati dei tubi. È importante mescolare bene. La presenza di una piccola quantità di bolle non interferisce con le prestazioni.
3. Incubare i campioni in un ciclore termico seguendo il programma #5 (tabella supplementare 2).

8. Legatura dell'adattatore

1. Prima di impostare la reazione di legatura, diluire l'adattatore nel buffer di diluione dell'adattatore a freddo ghiaccio, come mostrato nella tabella 7, moltiplicando per il numero di campioni richiesto, più il 10% in più. Tenere l'adattatore diluito sul ghiaccio.

Diluizione legamentosa	Volume (L)
Adattatore	0.5
Buffer di diluizione dell'adattatore	2
Volume totale	2.5

Tabella 7: Diluizione dell'adattatore. L'adattatore deve essere diluito sul ghiaccio con cuscinetto di diluizione dell'adattatore in base ai volumi mostrati.

2. Assemblare la reazione di legatura sul ghiaccio aggiungendo i componenti come descritto nella tabella 8, nell'ordine elencato, al prodotto di reazione di preparazione finale dal punto 7.3. Si noti che il Ligation Master Mix e Ligation Enhancer può essere mescolato in anticipo. Questa miscela è stabile per almeno 8 h a 4 gradi centigradi. Non premiare il Ligation Master Mix, il Ligation Enhancer e l'Adattatore prima dell'uso nella fase di ligazione dell'adattatore.

Reazione di ligazione	Volume (L)
Fine DNA preparato (Passaggio 7.3)	60
Adattatore diluito (Fase 8.1)	2.5
Potenziatore di ligazione	1
Mix Master di ligazione	30
Volume totale	93.5

Tabella 8: Reazione di legatura. I componenti della reazione di legatura dell'adattatore devono essere assemblati sul ghiaccio in base ai volumi indicati nell'ordine indicato. Un mix master di Ligation Enhancer e Ligation Master Mix può essere realizzato e aggiunto al DNA End Prepped con Diluied Adaptor. Non mescolare l'adattatore diluito e il Ligation Master Mix o Ligation Enhancer prima di mescolare il con il DNA End Prepped.

3. Impostare una pipetta a 80 o poi pipetta l'intero volume su e giù almeno 10 volte per mescolare accuratamente. Eseguire un rapido giro per raccogliere tutti i liquidi dai lati dei tubi. Il Ligation Master Mix è molto viscoso. Prestare attenzione a garantire un'adeguata miscelazione della reazione di legatura, in quanto la miscelazione incompleta comporterà una riduzione dell'efficienza della legatura. La presenza di una piccola quantità di bolle non interferisce con le prestazioni.
4. Incubare seguendo il programma #6(Tabella supplementare 2),quindi rimuovere la miscela di ligazione dal ciclore termico e aggiungere 3 -L di Adaptor Processing Enzyme, con un volume totale di 96,5 .
5. Pipette su e giù più volte per mescolare bene, e poi incubare seguendo programma #7 (Tabella supplementare 2) prima di procedere immediatamente alla purificazione della reazione di ligazione.

9. Purificazione della reazione di ligazione utilizzando SPRI Neads

1. Lasciare riscaldare le perline SPRI a temperatura ambiente per almeno 30 min prima dell'uso, quindi vortice SPRI Beads per circa 30 s per risospendere.
2. Aggiungere 87 -L di perline SPRI risospese e mescolare bene convogliando su e giù almeno 10 volte. Incubare per 10 min a temperatura ambiente.
3. Ruotare brevemente i tubi in una microcentrifuga e posizionarli su un rack magnetico per separare le perline dal supernatante. Dopo che la soluzione è stata chiara (5 min), rimuovere con cura e scartare il supernatante. Non scartare le perline.
4. Aggiungere 180 ll di etanolo appena preparato 80% ai tubi mentre si è sul rack magnetico. Incubare a temperatura ambiente per 30 s, quindi rimuovere e scartare con cura il supernatante. Ripetere il passaggio 9.4 una volta per un totale di 2 passaggi di lavaggio.
5. Rimuovere completamente l'etanolo residuo. Lasciare i tubi sul rack magnetico e asciugare l'aria le perline per circa 3 min con il coperchio aperto, o fino a quando visibilmente asciugare. Non asciugare le perline, in quanto ciò può comportare un minor recupero del DNA.
6. Togliere i tubi dal magnete e aggiungere 17 l of 0.1x TE tampone alle perline. Pipette su e giù almeno 10 volte per mescolare accuratamente. Incubare per 2 min a temperatura ambiente, quindi posizionare i tubi su un rack magnetico, permettendo alle perline di separarsi completamente dal supernatante.
7. Trasferire 15 ll l del supernatante per pulire tubi PCR privi di nuclea. Fare attenzione a non disturbare le perline. Questo è un punto di arresto opzionale nel protocollo, il DNA con collegamento adattatore può essere immagazzinato a -20 gradi centigradi.

10. Arricchimento PCR del DNA Ligated adattatore

1. Impostare la reazione PCR come descritto nella tabella 9. Un Master Mix contenente il Pre-Capture PCR Master Mix e l'Universal Primer può essere realizzato e aggiunto al DNA ligate dall'adattatore. Per la sequenza multiplex, usare primer di indice univoco per ogni reazione e aggiungerle a ogni campione singolarmente.

Arricchimento PCR	Volume (L)
Adattatore DNA ligato (Passaggio 10.1)	15
Miscela Master PCR pre-cattura	25
Primer PCR universale	5
Indice (X) Primer	5
Volume totale	50

Tabella 9: Arricchimento PCR del DNA ligato dell'adattatore. I componenti dell'arricchimento DELLA PCR della reazione del DNA ligate dell'adattatore devono essere assemblati e mescolati sul ghiaccio in base ai volumi mostrati. Un mix master del Pre-Capture PCR Master Mix e dell'Universal PCR Primer può essere realizzato e aggiunto al DNA ligate dell'adattatore. Per la sequenza multiplex, a ogni campione deve essere assegnato un Primer indice univoco.

2. Mescolare bene pipettando delicatamente su e giù 10 volte. Girare brevemente i tubi in una microcentrifuga ed essere posizionati in un ciclore termico ed eseguire l'amplificazione PCR utilizzando il programma #8 (Tabella supplementare 2).

11. Purificazione della reazione PCR utilizzando perline SPRI

1. Lasciare riscaldare le perline SPRI a temperatura ambiente per almeno 30 min prima dell'uso, quindi vortice SPRI Beads per circa 30 s per risospendere.
2. Aggiungere 45 -L di perline risospese ad ogni reazione PCR (50 dollari l). Mescolare bene pipettando su e giù almeno 10 volte, prima di incubare per 5 min a temperatura ambiente.
3. Ruotare brevemente i tubi in una microcentrifuga e posizionarli su un rack magnetico per separare le perline dal supernatante. Dopo che la soluzione è stata chiara (5 min), rimuovere con cura e scartare il supernatante. Fare attenzione a non disturbare le perline che contengono DNA.
4. Aggiungere 180 l di etanolo appena preparato 80% ai tubi mentre si è nel rack magnetico. Incubare a temperatura ambiente per 30 s, quindi rimuovere e scartare con cura il supernatante. Ripetere il passaggio 11.4 una volta per un totale di 2 passaggi di lavaggio.
5. Rimuovere completamente l'etanolo residuo. Lasciare i tubi sul rack magnetico e asciugare l'aria le perline per circa 3 min con il coperchio aperto, o fino a quando visibilmente asciugare. Non asciugare le perline, in quanto ciò può comportare un minor recupero del DNA.
6. Togliere i tubi dal magnete e aggiungere 23 -l 0,1x TE Buffer alle perline. Pipette su e giù almeno 10 volte per mescolare accuratamente. Incubare per 2 min a temperatura ambiente.
7. Posizionare i tubi su un rack magnetico, permettendo alle perline di separarsi completamente dal supernatante. Trasferire 20 ll l del supernatante per pulire tubi PCR privi di nuclea. Fare attenzione a non disturbare le perline. Si tratta di un punto di arresto facoltativo nel protocollo, le librerie di pre-cattura possono essere archiviate a -20 .

12. Convalidare e quantificare la libreria di acquisizione preliminare

1. Misurare la concentrazione della libreria di pre-cattura utilizzando un fluorometro e un kit di analisi ad alta sensibilità. Per passare alla parte II: ibridazione e acquisizione, è necessario un rendimento minimo di 200 ng.
   1. Eseguire 1 l di libreria su un sistema digitale di elettroforesi. Se necessario, diluire il campione per evitare di sovraccaricare il chip ad alta sensibilità, secondo le raccomandazioni del protocollo del produttore.
   2. Verificare che l'elettroperoigramma mostri una distribuzione ridotta con una dimensione di picco di circa 250-400 bp (vedere Risultati rappresentativi, Figura 3 e Figura 4).
   3. Se nelle tracce di Bioanalyzer è visibile un picco di 128 bp (adaptor-dimer) e l'intensità del segnale è l'intensità del segnale di libreria a 250-400 bp (vedere Risultati rappresentativi, Figura 5),quindi visualizzare il volume del campione (dal passaggio 11,7) al valore 50 con 0,1x buffer TE e ripetere la purificazione SPRI Bead (Passaggio 11). Questo è un punto di arresto facoltativo nel protocollo, le librerie di pre-cattura possono essere memorizzate a -20 gradi centigradi prima di passare alla parte II: ImmunoPrism Hybridization and Capture.

Parte II: ibridazione e acquisizione

13. Combinare Oligos Bloccante, DNA Cot-1, Pre-cattura Library DNA e Dry

1. Mescolare la libreria con codice a barre preparata nel passo 11 e quantificato nel passaggio 12, con DNA Cot-1 e Oligos di blocco in un tubo PCR privo di nucleato o microtubo da 1,5 mL, come mostrato nella tabella 10.

Reagente	Quantità/Volume
Libreria a barre dal passaggio 10.10	200 ng
Cot-1 DNA	2 g
Blocco di Oligos	2 ll

Tabella 10: Preparazione dell'ibridazione e essiccazione. I componenti da combinare per l'essiccazione delle librerie in preparazione dell'ibridazione devono essere assemblati in base alle quantità indicate.

2. Asciugare il contenuto del tubo utilizzando un concentratore a vuoto impostato su 30-45 gradi centigradi. Si tratta di un punto di arresto facoltativo nel protocollo. Dopo l'essiccazione, i tubi possono essere conservati durante la notte a temperatura ambiente (15-25 gradi centigradi) o più a lungo a -20 gradi centigradi.

14. Ibrida le sonde di acquisizione del DNA con la libreria

1. Thaw 2x Bead Wash Buffer e Hybridization Buffer, Hybridization Buffer Enhancer, ImmunoPrism Probe Panel, 10x Wash Buffer 1, 10x Wash Buffer 2, 10x Wash Buffer 3 e 10x Stringent Wash Buffer a temperatura ambiente. Prima dell'uso, controllare il buffer di ibridazione per la cristallizzazione dei sali. Se i cristalli sono presenti, riscaldare il tubo a 65 gradi centigradi, agitando ad intermittenza, fino a quando il tampone è completamente solubile.
2. A temperatura ambiente, creare il Hybridization Master Mix in un tubo. Moltiplicare i volumi per il numero di campioni e aggiungere il 10% in più, seguendo la tabella 11.

Mix Master di ibridazione	Volume (L)
Buffer di ibridazione	8.5
Enhancer del buffer di ibridazioneHybridization Buffer Enhancer	2.7
Pannello sonda immunoprisma	5
Acqua priva di nucle	0.8
Volume totale	17

Tabella 11: Hybridization Master Mix. I componenti di Hybridization Master Mix devono essere assemblati e miscelati a temperatura ambiente in base ai volumi indicati.

3. Vortice o pipetta su e giù per mescolare bene. Quindi, aggiungere 17 l del Mix Master di ibridazione ad ogni tubo contenente DNA essiccato. Sigillare i tubi e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
4. Vorticare i campioni, assicurandosi che siano completamente mescolati, e girare giù i campioni brevemente in una microcentrifuga. Se applicabile, trasferire ogni campione da un microtubo da 1,5 mL a un tubo PCR privo di nucle.
5. Collocare i campioni in un ciclore termico ed eseguire il programma #9 (Tabella supplementare 2).
   1. Durante l'incubazione, preparare i tamponi di lavaggio (Fase 15) e le perline streptavidin (Fase 16), lasciando un tempo sufficiente per preriscaldare i tamponi ed equiparlina.

15. Preparare i tamponi di lavaggio

NOTA: i buffer di lavaggio sono forniti come soluzioni concentrate 2x (Bead Wash Buffer) o 10x (tutti gli altri buffer di lavaggio).

1. Durante l'incubazione dell'ibridazione, diluire il 2x Bead Wash Buffer e il 10x Wash Buffers per creare soluzioni di lavoro 1x, moltiplicando per il numero richiesto di campioni e aggiungendo il 10% in più, seguendo la tabella 12. Se 10x Wash Buffer 1 è torbido, riscaldare la bottiglia in un bagno d'acqua da 65 gradi centigradi o in un blocco di riscaldamento per risospendere il particolato. I tamponi di lavaggio congelati 1x devono essere mescolati dopo lo scongelamento.

Buffer di lavaggio	Buffer concentrato (L)	Acqua priva di nuclea (L)	Totale (L)
Buffer lavare per talloni	150	150	300
Buffer lavaggio 1	25	225	250
Buffer lavaggio 2	15	135	150
Buffer lavaggio 3	15	135	150
Buffer di lavaggio rigoroso	30	270	300

Tabella 12: Diluizione del buffer di lavaggio. I tamponi di lavaggio della concentrazione devono essere diluiti con acqua priva di nuclesione a temperatura ambiente in base ai volumi indicati.

2. Aliquota in tubi PCR privi di nuclenon e collocati alle temperature appropriate come indicato nella tabella 13. Assicurati di includere un numero sufficiente di sovrafprobabilità per il pipettaggio. Per i tamponi riscaldati, utilizzare un ciclore termico impostato su 65 gradi centigradi con il coperchio impostato su 70 .

Buffer di lavaggio	Temperatura di tenuta	Volume/Tubo (L)	Numero di tubi/campione
Buffer lavare per talloni	RT (15-25 gradi centigradi)	100	3
Buffer lavaggio 1	65 gradi centigradi	100	1
Buffer lavaggio 1	RT (15-25 gradi centigradi)	150	1
Buffer lavaggio 2	RT (15-25 gradi centigradi)	150	1
Buffer lavaggio 3	RT (15-25 gradi centigradi)	150	1
Buffer di lavaggio rigoroso	65 gradi centigradi	150	2

Tabella 13: Buffer lavaggi diluiti. I cuscinetti di lavaggio diluiti devono essere suddivisi in tubi separati in base ai volumi e al numero di tubi per campione indicato. I cuscinetti di lavaggio devono essere tenuti alla temperatura indicata prima dell'uso.

3. Preparare il Bead Resuspension Mix a temperatura ambiente come mostrato nella tabella 14, moltiplicando per il numero di campioni richiesto e aggiungendo il 10% in più.

Mix di sospensione del tallone	Volume (L)
Buffer di ibridazione	8.5
Enhancer del buffer di ibridazioneHybridization Buffer Enhancer	2.7
Acqua priva di nucle	5.8
Volume totale	17

Tabella 14: Bead Resuspension Mix. I componenti del Bead Resuspension Mix devono essere assemblati e miscelati a temperatura ambiente in base ai volumi indicati.

16. Preparare le perline Streptavidin

1. E Streptavidin perline a temperatura ambiente per almeno 30 min prima dell'uso. Mescolare accuratamente le perline vortice per 15 s e 50 gradi l una di perline per cattura in un tubo PCR privo di nucleato.
2. Aggiungete 100 l of 1x Bead Wash Buffer (preparati al passo 15.1) ad ogni tubo. Delicatamente pipette su e giù 10 volte per mescolare. Posizionare il tubo su un rack magnetico, permettendo alle perline di separarsi completamente dal supernatante.
3. Rimuovere e scartare il supernatante chiaro. Fare attenzione a non disturbare le perline.
4. Eseguire il seguente lavaggio.
   1. Togliere dal rack magnetico. Aggiungere 100 luna di 1x Bead Wash Buffer ad ogni tubo contenente perline, quindi pipette su e giù 10 volte per mescolare.
   2. Posizionare il tubo nel rack magnetico, permettendo alle perline di separarsi completamente dal supernatante.
   3. Rimuovere e scartare con attenzione il supernatante chiaro.
5. Ripetere il passaggio 16.4 una volta per un totale di due fuorti.
6. Togliere dal rack magnetico. Aggiungete 17 l of Bead Resuspension Mix dal passo 15.3 ad ogni tubo. Pipette su e giù più volte per mescolare accuratamente. Assicurarsi che le perline non siano attaccate ai lati dei tubi. Se necessario, ruotare brevemente i tubi per raccogliere le perline nella parte inferiore.

17. Legare target ibrido per le perline Streptavidin

1. Una volta completata l'incubazione dell'ibridazione di 4 ore, togliere i campioni dal ciclore termico e impostare il ciclore termico per l'incubazione a 65 gradi centigradi con il coperchio riscaldato impostato a 70 gradi centigradi.
2. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 17 -L di perline completamente omogeneizzate ai campioni. Mescolare accuratamente pipetting su e giù 10 volte.
3. Legare il DNA alle perline posizionando i tubi nel ciclore termico seguendo il programma #10 (Tabella supplementare 2). Durante l'incubazione, rimuovere brevemente i tubi a strisce ogni 10-12 min e vortice delicatamente per 3 s per garantire che le perline rimangano in sospensione. In alternativa, mescolare pipeting su e giù più volte. Procedere immediatamente a Lavare Streptavidin Perline (Passo 18).

18. Lavare le perline Streptavidin per rimuovere il DNA non legato

1. Utilizzare i 1x Wash Buffers del passo 15.2 e conservare i tamponi riscaldati nel ciclore termico durante i lavaggi.
2. Aggiungere 100 l preriscaldato 1x Wash Buffer 1 ai tubi del punto 17.3. Mescolare accuratamente pipetting su e giù 10 volte. Posizionare i tubi su un rack magnetico, permettendo alle perline di separarsi completamente dal supernatante.
3. Pipetta e scartare il supernatante, che contiene DNA non legato. Togliere dal rack magnetico.
4. Eseguire il seguente lavaggio a 65 gradi centigradi.
   1. Aggiungete 150 l di cuscinetto di lavaggio stringente preriscaldato.
   2. Mescolare accuratamente pipetting su e giù almeno 10 volte. Evitare le bolle durante la pipettatura. Assicurarsi che le perline siano completamente risospese in tutti i tubi.
   3. Incubare nel ciclore termico a 65 gradi centigradi per 5 min.
   4. Posizionare i tubi su un rack magnetico, permettendo alle perline di separarsi completamente dal supernatante. Pipetta e scartare il supernatante, che contiene DNA non legato. Togliere dal rack magnetico.
   5. Ripetere il passaggio 18.4 per un totale di due washe stringenti.
5. Eseguire il primo lavaggio della temperatura ambiente.
   1. Aggiungere 150 l di temperatura ambiente 1x Lavaggio Buffer 1.
   2. Pipette su e giù 10 a 20 volte per risospendere completamente le perline.
   3. Sigillare i tubi e incubare per 2 min, alternando tra vortice delicatamente per 30 s e riposo per 30 secondi. Assicurarsi che le perline in tutti i pozzi rimangano completamente sospese in tutti i tubi durante l'intera incubazione.
   4. Centrifugare brevemente i tubi.
   5. Posizionare i tubi su un rack magnetico, permettendo alle perline di separarsi completamente dal supernatante. Pipetta e scartare il supernatante.
   6. Sigillare i tubi e centrifugare brevemente. Ritornare al rack magnetico e utilizzare una pipetta da 10 ll per rimuovere qualsiasi tampone di lavaggio residuo.
6. Eseguire il secondo lavaggio della temperatura ambiente.
   1. Aggiungere 150 l di temperatura ambiente 1x Lavaggio Buffer 2.
   2. Pipette su e giù 10 a 20 volte per risospendere completamente le perline.
   3. Sigillare i tubi e incubare per 2 min, alternando tra vortice delicatamente per 30 s e riposo per 30 secondi. Assicurarsi che le perline in tutti i pozzi rimangano completamente sospese in tutti i tubi durante l'intera incubazione.
   4. Centrifugare brevemente i tubi.
   5. Trasferire l'intero volume di perline risospese in Wash Buffer 2 per pulire i tubi PCR privi di nucle. Importante: Il trasferimento delle perline su tubi freschi è importante per evitare la contaminazione fuori bersaglio.
   6. Posizionare i tubi su un rack magnetico, permettendo alle perline di separarsi completamente dal supernatante. Pipetta e scartare il supernatante.
   7. Sigillare i tubi e centrifugare brevemente. Ritornare al rack magnetico e utilizzare una pipetta da 10 ll per rimuovere qualsiasi tampone di lavaggio residuo.
7. Eseguire il lavaggio della temperatura della terza stanza.
   1. Aggiungere 150 l di temperatura ambiente 1x Lavaggio Buffer 3.
   2. Pipette su e giù 10 a 20 volte per risospendere completamente le perline.
   3. Sigillare i tubi e incubare per 2 min, alternando tra vortice delicatamente per 30 s e riposo per 30 secondi. Assicurarsi che le perline in tutti i pozzi rimangano completamente sospese in tutti i tubi durante l'intera incubazione.
   4. Centrifugare brevemente i tubi.
   5. Posizionare i tubi su un rack magnetico, permettendo alle perline di separarsi completamente dal supernatante. Pipetta e scartare il supernatante.
   6. Sigillare i tubi e centrifugare brevemente. Tornare al rack magnetico e utilizzare una pipetta da 10 ll per rimuovere qualsiasi tampone di lavaggio residuo.
   7. Togliere dal rack magnetico e aggiungere 20 - L di acqua senza nuclesino alle perline.
   8. Pipetta su e giù 10 volte per garantire eventuali perline attaccate al lato dei tubi sono stati risospesi.
8. Importante: Non scartare le perline. Utilizzare l'intero 20 -L di perline risospese con DNA catturato nel passaggio 19.

19. Eseguire l'arricchimento PCR finale e post-cattura

1. Preparare il PCR Master Mix post-cattura secondo la seguente tabella, moltiplicando per il numero di campioni richiesto e aggiungendo il 10% in più, secondo la tabella 15.

Componente miscela master PCR post-cattura	Volume (L)
PCR MasterMix post-cattura	25
Miscela PCR Primer post-cattura	1.25
Acqua priva di nucle	3.75
Volume totale	30

Tabella 15: Miscela master PCR post-cattura. I componenti di PCR Master Mix post-cattura devono essere assemblati e miscelati sul ghiaccio in base ai volumi mostrati.

2. Aggiungete 30 l del mix PCR Master post-cattura ad ogni campione per un volume di reazione finale di 50 -L. Mescolare accuratamente pipettando su e giù per 10 volte.
3. Posizionare i tubi PCR nel ciclore termico e incubare seguendo il programma #11(tabella supplementare 2).

20. Purificare frammenti PCR post-cattura

1. Lasciare riscaldare le perline SPRI a temperatura ambiente per almeno 30 min prima dell'uso, quindi vortice SPRI Beads per circa 30 s per risospendere.
2. Aggiungete 75 -L di perline risospese ad ogni cattura arricchita di PCR (50 o L). Mescolare bene pipettando su e giù almeno 10 volte. Le perle streptavidin non interferiscono con la purificazione del tallone SPRI. Incubare per 5 min a temperatura ambiente.
3. Ruotare brevemente i tubi in una microcentrifuga e posizionarli su un rack magnetico per separare le perline dal supernatante. Dopo che la soluzione è chiara, rimuovere con attenzione e scartare il supernatale. Fare attenzione a non disturbare le perline, che contengono DNA.
4. Aggiungere 180 l l di etanolo appena preparato 80% al tubo mentre si è nel rack magnetico. Incubare a temperatura ambiente per 30 s, quindi rimuovere e scartare con cura il supernatante.
5. Ripetere il passaggio 20.4 una volta per un totale di 2 passaggi di lavaggio.
6. Rimuovere completamente l'etanolo residuo. Lasciare il tubo sul rack magnetico e asciugare ad aria 3 min con il coperchio aperto, o fino a quando visibilmente asciutto. Non asciugare troppo le perline. Ciò può comportare un minore recupero del DNA.
7. Rimuovere il tubo dal magnete. Eluire il DNA dalle perline aggiungendo 22 loff di 0,1 x TE Buffer. Mescolare bene pipetting su e giù più volte. Incubare per 2 min a temperatura ambiente. Posizionare il tubo sul rack magnetico fino a quando la soluzione è chiara.
8. Rimuovere 20 - L del supernatante e trasferirlo in un tubo PCR privo di nuclesi, facendo attenzione a non disturbare le perline. Si tratta di un punto di arresto facoltativo nel protocollo, le librerie possono essere memorizzate a -20 gradi centigradi.

21. Convalidare e quantificare la libreria

1. Misurare la concentrazione della biblioteca catturata utilizzando un fluorometro e un kit di analisi ad alta sensibilità.
2. Misurare la lunghezza media dei frammenti della libreria catturata utilizzando un chip DNA ad alta sensibilità elettroforesi digitale e calcolare la dimensione media dei frammenti per ogni libreria utilizzando il software di sistema. La dimensione media dei frammenti deve essere di circa 250-400 bp (vedere Risultati rappresentativi, Figura 6 e Figura 7). Si tratta di un punto di arresto facoltativo nel protocollo, le librerie completate possono essere archiviate a -20 .

22. Sequenziamento su una piattaforma di sequenziamento

1. Per il sequenziamento, diluire le librerie a 2 nM e seguire le linee guida del produttore per il caricamento e il funzionamento del sequencer. Librerie di sequenze ad una profondità minima di 15 milioni di letture a estremità singola di almeno 50 bp di lunghezza.

23. Analisi dei dati di sequenziamento per generare profili immunitari e scoprire biomarcatori con il portale Prism, uno strumento di informatica basato su cloud

1. Crea un account Prism visitando https://prism.cofactorgenomics.com/
2. Una volta effettuato l'accesso, fai clic su Invia nuovo progetto nella barra degli strumenti superiore da qualsiasi pagina di Prism per caricare i file di sequenziamento FASTQ demultiplexed o caricare i file memorizzati su BaseSpace con l'account Prism.
3. Compilare il modulo Nuovo progetto includendo il nome del progetto e gli esempi per gruppo o coorte. Il raggruppamento dei campioni e i nomi di raggruppamento corrispondenti sono necessari per generare il Biomarker Discovery Report. Si noti che sono necessari almeno 3 campioni per gruppo per generare il Biomarker Discovery Report. Fare clic sul pulsante Avvia applicazione per inviare il modulo; se l'operazione ha esito positivo, verrà visualizzata una pagina di conferma.
4. Al termine dell'accesso, fare clic su Visualizza risultati nella barra degli strumenti superiore o in qualsiasi pagina di Prism. Prism consente a un utente di visualizzare lo stato dei progetti inviati e di visualizzare i report di campioni e biomarcatori per progetto. Ci sarà una tabella di progetti che l'utente ha creato su Prism. La tabella include tre colonne per lo stato, il nome e la data di invio.
   NOTA: lo stato di ogni progetto può essere:
   "Running", dove l'analisi del progetto è attualmente in esecuzione, o,
   "Success", dove l'analisi del progetto è completa e sono disponibili report.
5. Se un progetto ha terminato l'analisi (indicata dallo stato "Success"), visualizzare i singoli rapporti di esempio e un rapporto di individuazione dei biomarcatori. Si noti che il Biomarker Discovery Report sarà disponibile solo se il progetto include il minimo richiesto di tre campioni per gruppo.
   1. Per accedere a questi rapporti, tornare alla tabella dei progetti e fare clic sul nome del progetto. In questa pagina del progetto, ci sarà una tabella con una riga per ogni esempio nel progetto. Fare clic sul collegamento in ogni riga, sotto la colonna Report, per accedere al Report individuale di ogni esempio. Immediatamente sotto la tabella, fare clic sul collegamento per il Biomarker Discovery Report. Se in questa pagina non sono presenti collegamenti, l'analisi non è stata completata.

Risultati

Ci sono un certo numero di punti di controllo in tutto il protocollo che consentono all'utente di valutare la qualità e la quantità dei materiali generati. Dopo la fase 12 descritta nel protocollo, viene generato un elettroferogramma come illustrato nella Figura 3, rappresentativo di una tipica libreria di pre-cattura per un campione di RNA intatto (RIN - 7,8).

Figura 3: Tipica traccia di Bioanalyzer della libreria pre-cattura per un campione di RNA intatto. Le librerie di pre-cattura appaiono come un picco ampio di circa 250-400 coppie di base (bp) di dimensioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Occorre prestare attenzione a evitare la sovraamplificazione, come indicato dal secondo picco di circa 1.000 bp illustrato nella Figura 4, un elettroferogramma rappresentativo di una libreria di pre-cattura generata da un campione di RNA FFPE (DV₂₀₀ x 46). Se questo picco è piccolo rispetto al picco principale (circa 250-400 coppie di basi (bp), come mostrato), non interferirà con i passaggi a valle o l'analisi. Se il secondo picco è grande rispetto al picco di 250-400 bp, la libreria di pre-cattura può essere rifatta con meno cicli PCR al fine di ridurre la sovraamplificazione.

Figura 4: Tipica traccia di bioanalisi della libreria pre-cattura per un campione di RNA FFPE. Il secondo picco di circa 1.000 bp è indicativo di sovra-amplificazione. Se questo picco è piccolo rispetto al picco principale di circa 250-400 bp (come mostrato), non interferirà con i passaggi a valle o l'analisi. Se il secondo picco è grande rispetto al picco di 250-400 bp, la libreria di pre-cattura può essere rifatta con meno cicli PCR al fine di ridurre l'amplificazione eccessiva. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Come descritto nel passaggio 12.1.3, la presenza di dimeri adattatori deve essere valutata per determinare se è necessaria una pulizia aggiuntiva. Gli elettroferigrammi illustrati nella Figura 5 sono rappresentativi di livelli inaccettabili(Figura 5A, DV₂₀₀ , 33) e accettabili (Figura 5B, DV₂₀₀ x 46), che appaiono come il picco forte intorno ai 128 bp.

Figura 5: Tracce di Bioanalyzer della libreria pre-cattura. Il dimero dell'adattatore si presenta come un picco forte di circa 128 bp. (A) Sono presenti dimeri di adattatori eccessivi in questo elettroferogramma. (B) In questa traccia sono rappresentati livelli accettabili di dimeri di adattatori. Entrambe le tracce mostrano prove di una lieve eccessivamente amplificazione, ma questo non dovrebbe interferire con il saggio immunoprismo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Al completamento del protocollo, prima del sequenziamento, le librerie finali vengono nuovamente valutate utilizzando l'elettroforesi digitale. Le biblioteche a base di RNA FFPE tendono ad avere una distribuzione di dimensioni medie più piccole rispetto alle librerie fatte di RNA intatto. Per i campioni di RNA intatti, la traccia risultante dovrebbe essere simile alla Figura 6 (RIN - 9,5). Per l'RNA degradato o FFPE, la traccia risultante dovrebbe essere simile alla Figura 7 (DV₂₀₀ x 36).

Figura 6: Tipica traccia di Bioanalyzer della libreria finale per un campione di RNA intatto. Le librerie finali appaiono come un picco ampio di circa 250-400 coppie di base (bp) di dimensioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Tipica traccia di bioanalyzer della libreria finale per un campione di RNA FFPE. Le biblioteche a base di RNA FFPE tendono ad avere una distribuzione di dimensioni medie più piccole rispetto alle librerie fatte di RNA intatto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Come descritto, i risultati generati con questo protocollo possono essere applicati in due modi chiave, come illustrato nella Figura 8.

Figura 8: Due casi d'uso del protocollo. I risultati generati da questo test di profilazione immunitaria vengono applicati in due applicazioni traslazionali chiave. (A) Il primo caso d'uso parte dal tessuto tumorale solido umano (compresi gli archivi FFPE) e genera un profilo immunitario individuale per il campione. (B) Una volta generati per una coorte di campioni umani, i dati vengono combinati utilizzando il portale Prism per generare un biomarcatore multidimensionale e il corrispondente rapporto sui biomarcatori. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per dimostrare ciascuno di questi casi d'uso, i dati rappresentativi di un piccolo studio traslazionale sono inclusi²¹. I campioni utilizzati in questo studio sono una serie di campioni da 7 pazienti diagnosticati e trattati per il cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC). I campioni sono tessuti tumorali solidi abbinati al paziente da biopsie pre e post-trattamento. In primo luogo, sono stati analizzati singoli campioni per generare un profilo immunitario, ad esempio il report di esempio illustrato nella figura 9.

Figura 9: Esempio di rapporto immunitario individuale per un campione NSCLC. La pipeline del portale Prism genera un report grafico per ogni campione elaborato, con un report rappresentativo generato per un campione di tumore solido NSCLC illustrato di seguito. (A) Il lato anteriore della relazione illustra graficamente la ripartizione delle cellule immunitarie presenti nel campione di RNA estratto dal tessuto FFPE. (B) Il rovescio della relazione comprende una tabella delle cellule immunitarie (in percentuale assoluta) e l'espressione genica di fuga (in trascrizioni per milione, o TPM), nonché una dichiarazione di prestazioni per il saggio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I profili immunitari pre e post-trattamento possono essere utilizzati per capire come una terapia (chemioterapia o radiazione, in questo studio) ha modificato il microambiente tumorale. Un esempio è illustrato nella figura 10, in cui i cambiamenti di percentuale per ogni cellula immunitaria e il contenuto immunitario totale sono mostrati prima e post chemioterapia, per un singolo paziente.

Figura 10: Risultati di esempio pre e post-trattamento. Vengono mostrati i dati delle singole cellule immunitarie e del contenuto immunitario totale generati da campioni pre e post-trattamento provenienti da un singolo paziente NSCLC. In questo esempio, il paziente ha ricevuto un regime di chemioterapia come trattamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I pazienti possono essere raggruppati in base a criteri quali esiti clinici o fenotipi per il confronto. Ad esempio, nella figura 11, i campioni nello studio NSCLC sono stati confrontati in base al tempo alla progressione della malattia dopo il trattamento. Un sottoinsieme dei pazienti ha mostrato la recidiva della malattia in >18 mesi, e un altro sottoinsieme è progredito più velocemente, in 18 mesi. Il valore delta mediano (differenza tra i valori pre e post-trattamento) viene confrontato per ogni campione per identificare i biomarcatori putativi della progressione della malattia.

Figura 11: Esempio di confronto dei risultati clinici. Le variazioni quantitative tra le percentuali di cellule immunitarie nei campioni NSCLC pre e post-trattamento corrispondenti sono state calcolate e segnalate come valore "delta". Quelli evidenziati in giallo mostrano chiari cambiamenti di segnale tra lo stato di sopravvivenza. Le barre blu rappresentano valori delta mediani per >18 mesi fino alla progressione della malattia, le barre arancioni rappresentano valori delta mediani per 18 mesi fino alla progressione della malattia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Infine, raggruppamenti di campioni simili possono essere utilizzati per esaminare in modo specifico i campioni pre-trattamento per identificare i biomarcatori predittivi utilizzando il portale Prism per generare un rapporto sui biomarcatori. Mostrato nella figura 12, lo stesso fenotipo clinico (progressione della malattia) come descritto sopra definisce i raggruppamenti di campioni. In questo esempio, due geni di fuga immunitaria sono stati identificati come differenziatori statisticamente significativi dei raggruppamenti di campioni (CD47 e OX40, mostrati nel pannello inferiore della figura 12A). In questo esempio, poiché i singoli biomarcatori genici sono robusti con una chiara significatività statistica, il biomarcatore multidimensionale non aggiunge un valore predittivo significativo (ImmunoPrism, come etichettato nel grafico a barre in alto a destra della figura 12B). La tabella completa dei dati, compresi i risultati di tutti i 18 analiti per il saggio, è riassunta sul retro della relazione, compresa l'analisi statistica e una breve sintesi dei metodi.

Figura 12: Esempio di rapporto Biomarker per i campioni NSCLC. La pipeline Biomarker Discovery fornisce un rapporto visivo dei singoli biomarcatori e un biomarcatore multidimensionale di apprendimento automatico, con statistiche dettagliate. (A) Per questo studio, la conduttura ha identificato due singoli biomarcatori (CD47 e OX40) statisticamente significativi per definire la progressione della malattia con una soglia di 18 mesi. (B) I dettagli sul metodo e i risultati completi sono inclusi sul retro del report. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare 1: Materiali del kit di reagenti. Viene elencato un elenco dei materiali forniti nel kit ImmunoPrism, insieme ai numeri di parte a cui si fa riferimento nel protocollo del produttore. Tutte le altre attrezzature e materiali necessari sono elencati nella Tabella dei Materiali. Visitare https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/ per schede tecniche di sicurezza (SDS). Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

Tabella supplementare 2: Programmi del ciclore termico. I programmi cycler consigliati a cui si fa riferimento durante il protocollo sono riepilogati per semplificare la programmazione. Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

Tabella supplementare 3: Guida all'indice di sequenziamento. Sono elencati i primer dell'indice forniti nel kit di reagenti; a ogni reazione viene aggiunto un primer univoco per la demultiplexing post-sequenziamento. Sono inoltre disponibili combinazioni di multiplexing di basso livello consigliate. Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

Discussione

Il protocollo richiede 20 ng intatto o 40 ng RNA altamente degradato (FFPE). Il campione di RNA deve essere privo di DNA, sali (ad es. sali mg²o sali di guanidinium), agenti di chelatazione di cation divalent (ad esempio, EDTA, EGTA, Citrate) o organici (ad esempio, fenolo ed etanolo). Non è consigliabile procedere con campioni di RNA con un DV₂₀₀ <20%. L'uso dell'RNA di controllo in-kit è fortemente raccomandato in quanto questi controlli forniscono un mezzo per valutare le prestazioni durante l'intero protocollo, dalla preparazione della libreria all'analisi.

Il protocollo è progettato per essere eseguito utilizzando tubi a strisce PCR da 0,2 mL. Se si preferisce, il protocollo può essere eseguito anche utilizzando i pozze in una piastra PCR 96-well. Basta usare i pozze di una piastra PCR 96-well al posto di tutti i riferimenti atubi PCR o tubi a strisce. Utilizzare piastre PCR solo con pozzi chiari, in quanto è fondamentale confermare visivamente la sospensione completa delle perline durante le purificazioni del tallone e le fasi di lavaggio.

Per tutto il protocollo, mantenere i reagenti congelati o sul ghiaccio se non diversamente specificato. Non utilizzare reagenti fino a quando non sono completamente scongelati. Assicurarsi di mescolare accuratamente tutti i reagenti prima dell'uso.

Mantenere gli enzimi a -20 gradi centigradi fino a quando non è pronto per l'uso e si ritorna a -20 gradi centigradi prontamente dopo l'uso. Utilizzare solo acqua priva di nuclea sinuosità molecolare; non è consigliabile utilizzare acqua trattata con DEPC. Durante la miscelaggio da miscelare, aspirare delicatamente e erogare almeno il 50% del volume totale fino a quando le soluzioni sono ben miscelate. Pipette mescolare tutte le miscele master contenenti enzimi. L'uso del vortice per mescolare gli enzimi potrebbe portare alla denaturazione e compromettere le loro prestazioni. Durante le purificazioni del tallone, utilizzare soluzioni di etanolo appena fatte all'80% da etanolo di grado molecolare. L'utilizzo di soluzioni di etanolo che non sono fresche può comportare rese inferiori. Evitare di asciugare eccessivamente le perline, in quanto ciò può ridurre l'efficienza di eluizione (le perle sembrano incrinate se asciugate troppo).

Come descritto nel passaggio 10, i primer dell'indice univoco vengono aggiunti a ogni reazione. In base alle sequenze di questi indici, per il multiplexing di basso livello, alcune combinazioni di indici sono ottimali. Le sequenze di questi indici sono necessarie per la demultiplexing dei dati dopo la sequenza. Le sequenze e le combinazioni di multiplexing consigliate sono disponibili nella Tabella supplementare 3. In questo stesso passaggio, è importante notare che il numero di cicli PCR raccomandati varia a seconda della qualità dell'RNA utilizzato e, potrebbe essere necessaria qualche ottimizzazione per prevenire l'amplificazione PCR. Per l'RNA di controllo intact OimmunoPrism e altri RNA di alta qualità, inizia l'ottimizzazione con 10 cicli PCR. Per l'RNA di controllo ImmunoPrism FFPE e altri RNA di controllo altamente degradati/FFPE, avviare l'ottimizzazione con 15 cicli PCR. Si consiglia di produrre una libreria di prova utilizzando il rappresentante RNA del materiale da analizzare al fine di ottimizzare i cicli di PCR. Deve essere utilizzato il numero minimo di cicli PCR che producono in modo coerente rendimenti di librerie pre-cattura sufficienti (>200 ng). Un picco secondario di circa 1000 bp sulla traccia Bioanalyzer è indicativo di sovraamplificazione (Figura 4). L'amplificazione eccessiva deve essere ridotta al minimo, ma la presenza di un piccolo picco secondario non interferisce con i risultati del test.

Per ridurre al minimo la perdita del campione ed evitare tubi di commutazione, il passaggio 13 può essere eseguito in tubi PCR, tubi a strisce o in una piastra PCR da 96 pozzeprima invece di microtubi da 1,5 mL, se il concentratore a vuoto lo consente. Il rotore può essere rimosso su molti concentratori. Ciò consente ai tubi a strisce o alle piastre di adattarsi nel vuoto. La concentrazione del vuoto può quindi essere eseguita utilizzando l'impostazione di disidratazione acquosa senza centrifugazione. Consultare il manuale per il concentratore di vuoto per istruzioni. Se i campioni vengono essiccati in tubi a strisce o in una piastra da 96 pozze, la fase di ibridazione può essere eseguita nello stesso recipiente.

Durante la fase 17, assicurarsi di vortice ogni 10-12 min per aumentare l'efficienza di cattura del tallone. Tenere con attenzione i tappi dei tubi a strisce calde durante la miscelazione per evitare l'apertura dei tubi.

I lavamenti descritti al punto 18 sono fondamentali per evitare un'elevata contaminazione non specifica e devono essere seguiti da vicino. Assicurarsi di risospendere completamente le perline ad ogni lavaggio, rimuovere completamente i tamponi di lavaggio e, durante il lavaggio del buffer di lavaggio 2, trasferire i campioni in un tubo a striscia fresca (Passaggio 18.6.5). Assicurarsi che le perle streptavidin siano completamente sospese e rimangano in sospensione durante l'intera incubazione. Spruzzare sui tappi del tubo non avrà un impatto negativo sulla cattura. Durante i fusti a temperatura ambiente, un miscelatore di vortice a micropiastra può essere utilizzato per vorticare i campioni per l'intero periodo di incubazione di due minuti per una sospensione più facile. Non lasciare asciugare le perline streptavidin. Se necessario, estendere le incubazioni nei cuscinetti per evitare di asciugare le perline. Se si utilizza più di un tubo a strisce, lavorare con un tubo a strisce alla volta per ogni lavaggio mentre gli altri tubi striscia sedersi nel termociclore. Questo può aiutare a evitare di asciugare eccessivamente le perline o correre, con conseguente scarsa sospensione o altre tecniche sub-ottimali. Per gli utenti per la prima volta, non è consigliabile elaborare più di 8 reazioni della libreria alla volta.

Le attuali tecniche di profilazione immunitaria forniscono un continuum di informazioni - da migliaia di punti dati che richiedono un'interpretazione significativa (sequenziamento dell'RNA) a un singolo punto dati discreto (IHC monoplesso). Il protocollo qui descritto rappresenta un approccio che si trova da qualche parte nel mezzo, con un ambito mirato che consente un'elevata sensibilità, ma cattura solo un sottoinsieme di dati trascrittomici clinicamente rilevanti. A causa della natura dell'estrazione di massa di RNA, questo protocollo non fornisce informazioni sulle relazioni spaziali tra le cellule immunitarie e il microambiente tumorale, tuttavia, i risultati possono essere integrati con tecnologie di imaging per aggiungere queste informazioni. Ci sono una miriade di applicazioni per i dati generati da questo protocollo, in quanto c'è molto da imparare sulla biologia del cancro come una malattia, e le terapie in fase di sviluppo per trattarlo. Come mostrato nei risultati rappresentativi, il rapporto immunitario individuale è utile per comprendere come il profilo immunitario di un paziente può cambiare in risposta a eventi come la progressione della malattia o il trattamento. Mentre i risultati qui presentati forniscono alcuni esempi di casi d'uso, altre applicazioni, tra cui lo studio del meccanismo di azione di una terapia e l'identificazione di biomarcatori putativi degli esiti clinici come progressione libera e sopravvivenza globale sono anche Pratico. Quando si utilizza questo protocollo per le applicazioni di scoperta di biomarcatori, è importante praticare una buona progettazione di studio per garantire che le popolazioni omogenee vengano analizzate, che siano inclusi campioni sufficienti per l'energia statistica e che vengano considerate le fonti di bias. A causa della natura mirata e snella del saggio, è possibile immaginare un percorso verso la convalida clinica e l'applicazione a valle di questi biomarcatori una volta scoperti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,2 mL PCR 8 strisce di provette	USA Scientific	1402-2700	USA Scientific 0,2 mL PCR 8 provette
200 Proof Ethanol	MilliporeSigma	EX0276-1	Preparare l'80% miscelando con acqua priva di nucleasi il giorno dell'esperimento
Termociclatori a 96 pozzetti	BioRad	1861096
Perle di immobilizzazione reversibile in fase solida (SPRI)	Beckman-Coulter	A63882	Agencourt AMPure XP – Perle di purificazione PCR Chip
e kit per elettroforesi digitale	Agilent Technologies	5067-4626	Chip e kit DNA ad alta sensibilità Agilent
Sistema di elettroforesi digitale	Agilent Technologies	G2939AA	Bioanalizzatore per elettroforesi Agilent 2100
Perle di streptavidina	ThermoFisher Scientific	65306	Dynabeads M-270 Kit per
immunoprismi di streptavidina ndash; 24 reazioni	Cofactor Genomics	CFGK-302	Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit - 24 reazioni
Human Cot-1 DNA	ThermoFisher Scientific	15279011	Marchio Invitrogen
Rack di separazione magnetica	Alpaqua/Invitrogen	A001322/12331D	96-well Magnetic Ring Stand
Microcentrifuga	Eppendorf	22620701
Provette per microcentrifuga	USA Scientific	1415-2600	USA Scientific Provetta per microcentrifuga a bassa aderenza da 1,5 mL
NextSeq550	Illumina	SY-415-1002	Qualsiasi sequenziatore Illumina può essere utilizzato per questo protocollo
Acqua priva di nucleasi	ThermoFisher Scientific	AM9937
Kit di estrazione del prisma	Cofactor Genomics	CFGK-401	Kit di estrazione FFPE del prisma del cofattore e ndash; 24 campioni
di RNA purificato	-		Purificato da campioni di tessuto umano
Fluorimetro	ThermoFisher Scientific	Q33226	Qubit 4 System
Provette per test fluorometrici	Axygen	PCR-05-C	Provette per PCR a parete sottile da 0,5 ml con tappi piatti
Kit di reagenti fluorimetrici ad alta sensibilità	Life Technologies	Q32854	Kit di test
Qubit dsDNA HSConcentratore sottovuoto	Eppendorf	22820001	VacufugePlus
Miscelatore a vortice	VWR	10153-838
Bagno d'acqua o blocco riscaldante	VWR/USA Scientific	NA/2510-1102	VWR Bagno d'acqua/USA Blocco riscaldante scientifico