Qui abbiamo presentato un metodo di sequenziamento dell'mRNA a singola cellula multiplexed per profilare l'espressione genica nei tessuti embrionali del topo. Il metodo di sequenziamento dell'mRNA a singola cellula (scRNA-Seq) basato su droplet in combinazione con strategie di multiplexing può profilare singole cellule da più campioni contemporaneamente, riducendo significativamente i costi del reagente e riducendo al minimo gli effetti batch sperimentali.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Analisi del sequenziamento dell'mRNA a cella singola multiplexed delle cellule embrionali del topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il sequenziamento di mRNA a singola cellula ha compiuto progressi significativi negli ultimi anni ed è diventato uno strumento importante nel campo della biologia dello sviluppo. È stato utilizzato con successo per identificare popolazioni di cellule rare, scoprire nuovi geni marcatori e decodificare informazioni spaziali e temporali sullo sviluppo. Il metodo a singola cellula si è evoluto anche dalla tecnologia Fluidigm C1 basata microfluidica alle soluzioni a base di gocciolamento negli ultimi due o tre anni. Qui abbiamo usato il cuore come esempio per dimostrare come profilare le cellule del tessuto embrionale del topo usando il metodo scRNA-Seq basato su gocciolamento. Inoltre, abbiamo integrato due strategie nel flusso di lavoro per profilare più campioni in un unico esperimento. Utilizzando uno dei metodi integrati, abbiamo contemporaneamente profilato più di 9.000 cellule da otto campioni di cuore. Questi metodi saranno preziosi per il campo della biologia dello sviluppo fornendo un modo conveniente per profilare contemporaneamente singole cellule provenienti da diversi background genetici, stadi di sviluppo o posizioni anatomiche.
Introduzione
Il profilo trascrizionale di ogni singola cellula varia tra le popolazioni cellulari durante lo sviluppo embrionale. Sebbene l'ibridazione molecolare singola in situ possa essere utilizzata per visualizzare l'espressione di un piccolo numero di geni1, il sequenziamento dell'mRNA a singola cellula (scRNA-Seq) fornisce un approccio imparziale per illustrare i modelli di espressione dei geni a livello di genoma nei singoli geni. Dopo che è stato pubblicato per la prima volta nel 20092, scRNA-Seq è stato applicato per studiare più tessuti in più fasi di sviluppo negli ultimi anni3,
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
La procedura animale è in accordo con l'Università di Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Dissezione del cuore embrionale del topo e preparazione della sospensione a cella singola
NOTA: Questo passaggio potrebbe richiedere alcune ore a seconda del numero di embrioni da sezionare.
- Per acquisire cuori embrionali E18.5, eutanasia un topo CD1 incinta dalla somministrazione di CO2. Utilizzare un rasoio per rimuovere i capelli indesiderati nella zona addominale e disinfettare la pelle con il 70% di etanolo.
- Tagliare la pelle dell'addome utilizzando le forbic....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
In questo studio, abbiamo usato il cuore embrionale del topo come esempio per mostrare come è stato eseguito il sequenziamento di mRNA a singola cellula multiplexed per elaborare simultaneamente i diversi campioni da parti separate di un organo. I cuori del topo E18.5 CD1 sono stati isolati e sezionati nell'atrio sinistro (LA), nell'atrio destro (RA), nel ventricolo sinistro (LV) e nel ventricolo destro (RV). Le cellule atriale e ventricolalare sono state poi codificate a barre in modo in.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
In questo studio, abbiamo dimostrato un protocollo per analizzare i profili trascrizionali a singola cellula. Abbiamo anche fornito due metodi opzionali ai campioni multiplex nel flusso di lavoro scRNA-Seq. Entrambi i metodi si sono dimostrati fattibili in vari laboratori e hanno fornito soluzioni per eseguire un esperimento a cella singola conveniente e privo di effetti in batch18,26.
Ci sono alcuni passaggi che dovrebbero essere segu.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Ringraziamo David M. Patterson e Christopher S. McGinnis del laboratorio Dr. .ev J. Gartner per la loro fornitura gentile di reagenti di codifica a barre a base di lipidi e suggerimenti sui passaggi sperimentali e l'analisi dei dati. Questo lavoro è stato fondato dai National Institutes of Health (HL13347202).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10% Tween-20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Portachip | 10x Genomics | 120252 330019 | |
| 10x Controller di cromo | 10x Genomics 120223 | ||
| 10x Separatore magnetico | 10x Genomics 120250 | 230003 | |
| 10x Adattatore a vortice | 10x 330002 genomica | , 120251 | |
| 10x Clip a vortice | 10x Genomics | 120253 230002 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991AA | |
| Kit DNA ad alta sensibilità | Agilent | 5067-4626 | Sequenziamento del nucleo di scienze della salute dell'Università di Pittsburgh |
| Tecnologie del DNA integrate Oligo Integrated DNA | filamento singolo | 25 nmol | |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Topi CD1 | Chales River | Ceppo Codice 022 | ordinato topi in gravidanza |
| Centrifuga 5424R | Appendorf | 2231000214 | |
| Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns | 10x Genomics | 1000073 | Conservare a temperatura ambiente |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10x Genomics | 120262 | Store a -20 ° C |
| Cromo Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns | 10x Genomica | 1000094 | Conservare a -20 ° Kit |
| libreria C Chromium Single Cell 3' v3 | 10x Genomics | 1000095 | Store a -20 gradi C |
| Cromo singola cellula 3' v3 perle di gel | 10x genomica | 2000059 | conservare a -80 ° C |
| Collagenasi A | Sigma/Millipore | 10103578001 | Conservare la polvere a 4 gradi; C, conservare a -20 gradi C dopo che si è sciolto |
| Collagenasi B | Sigma/Millipore | 11088807001 | Conservare la polvere a 4 gradi C, conservare a -20 gradi C dopo la dissoluzione |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Università di Pittsburgh Scienze della salute Sequenziamento del nucleo |
| del DNA Tubo LoBind Provetta per microcentrifuga, 1,5 mL | Eppendorf | 022431021 | |
| DNA LoBind Tube Provetta per microcentrifuga, 2,0 mL | Eppendorf | 022431048 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10x Genomics | 2000048 | Conservare a 4 gradi C, utilizzato in Beads Cleanup Mix (Tabella 1) |
| DynaMag-2 Magnet | Theromo Scientific | 12321D | |
| Etanolo, puro (200 Proof, anidro) | Sigma | E7023-500mL | |
| Falcon 15mL Tubo da centrifuga in PP ad alta chiarezza | Corning Cellgro | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL Tubo da centrifuga in PP ad alta chiarezza | Corning Cellgro | 14-959-49A | |
| Fetale Siero Bovino, qualificato, Stati Uniti | Fisher Scientific | 26140079 | Store a -20 C |
| Finnpipette F1 Pipette multicanale, 10-100μ l | Theromo Scientific | 4661020N | |
| Finnpipette F1 Pipette multicanale, 1-10μ l | Theromo Scientific | 4661000N | |
| Filtro Flowmi Cell | Sigma | BAH136800040 | Porosità 40 μ m, per puntali per pipette da 1000 uL, confezione da 50 ciascuno |
| Glicerina (Glicerolo), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| HBSS, senza calcio, senza magnesio | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | |
| Human TruStain FcX (Soluzione bloccante il recettore Fc) | BioLegend | 422301 | Add 5 µ l di TruStain FcX umano per milione di cellule in 100 µ l. volume di colorazione |
| Isopropanolo (IPA) | Fisher Scientific | A464-4 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Fisher Scientific | NC0295239 | Store a -20 gradi; C, utilizzato in una miscela di librerie di codici a barre con tag lipidici (Tabella 1) |
| Primer per codici a barre lipidici (Primer multi-seq) | Tecnologie DNA integrate | DNA a filamento singolo | 100 nmol |
| Tampone a basso TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090-015 | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950W | |
| Acqua priva di nucleasi (Ambion) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| Provette per PCR 0,2 ml Strisce da 8 provette | Eppendorf | 951010022 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1X senza calcio e magnesio | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con il 10% di albumina bovina (alternativa al prodotto Thermo Fisher) | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| Pipet confezione da 4 (0.1– 2,5μ L, 0,5-10μ L, 10– 100μ L, 100– 1.000μ L pipette a volume variabile | Fisher Scientific | 05-403-151 | |
| Reagente di selezione (SPRIselect Reagent Kit) | Beckman Coulter | B23318 (60ml) | |
| Template Switch Oligo | 10x Genomics | 3000228 | Conservare a -20 ° C, utilizzato in Master Mix (Tabella 1) |
| La strategia di codifica a barre basata su anticorpi è nota anche come Cell Hashing | |||
| Il browser cellulare è Loup Cell Browser | 10x Genomics | https://support.10xgenomics. com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser | |
| La pipline di analisi disponibile in commercio nel passaggio 8.1 è Cell Ranger | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/ latest/cos'è il ranger cellulare | |
| La strategia di codifica a barre basata sui lipidi è anche nota come MULTI-seq | |||
| La piattaforma R ben tenuta è Seurat V3 | satijalab | https://satijalab.org/seurat/ | |
| TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL puntale per pipetta con filtro a bassissima ritenzione | USA Scientific | 1180-3710 | |
| TipOne RPT 1000 ul XL puntale per pipetta con filtro a bassissima ritenzione | USA Scientific | 1182-1730 | |
| TipOne RPT 200 ul puntale per pipetta con filtro a bassissima ritenzione | USA Scientific | 1180-8710 | |
| TotalSeq-A0301 anti-topo Hashtag 1 Anticorpo | BioLegend | 155801 | 0,1 - 1,0 &; g di anticorpi in 100 µ l di tampone di colorazione per ogni 1 milione di cellule |
| TotalSeq-A0302 anti-topo Hashtag 2 Anticorpo | BioLegend | 155803 | 0,1 - 1,0 &; g di anticorpi in 100 µ l di tampone di colorazione per ogni 1 milione di cellule |
| TotalSeq-A0302 anti-topo Hashtag 3 Anticorpo | BioLegend | 155805 | 0,1 - 1,0 &; g di anticorpi in 100 µ l di tampone di colorazione per ogni 1 milione di cellule |
| Primer TrueSeq RPI Tecnologie | del DNA integrate | DNA a filamento singolo | 100 nmol, utilizzato in una miscela di librerie di codici a barre con tag lipidici (Tabella 1) |
| Soluzione di blu di tripano, 0,4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo | Fisher Scientific | 25200-056 | |
| Universal I5 | Integrated DNA Technologies | DNA a filamento singolo | 100 nmol |
Riferimenti
- Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877(2008).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
