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Articolo metodologico

Modello di dolore da osteoartrite indotto dall'iniezione intra-articolare di mono-iodoacetato nei ratti

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DOI:

10.3791/60649

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20 maggio 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 2College of Pharmaceutical Science, Zhejiang Chinese Medical University

In questo articolo

Sommario

Questo studio descrive il metodo di iniezione intra-articolare di mono-iodoacetato nei ratti e discute i comportamenti correlati al dolore risultanti e i cambiamenti istopatologici, che forniscono riferimenti per applicazioni future.

Abstract

Gli attuali modelli animali di osteoartrite (OA) possono essere suddivisi in modelli spontanei e modelli indotti, entrambi i quali mirano a simulare i cambiamenti fisiopatologici dell'OA umana. Tuttavia, come sintomo principale nella fase avanzata dell'OA, il dolore influisce sulla vita quotidiana dei pazienti e non ci sono molti modelli disponibili. Il modello indotto da mono-iodoacetato (MIA) è il modello di dolore OA più utilizzato, utilizzato principalmente nei roditori. MIA è un inibitore della gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi, che causa morte dei condrociti, degenerazione della cartilagine, osteofiti e cambiamenti misurabili nel comportamento animale. Inoltre, nel modello indotto da MIA possono essere rilevate alterazioni dell'espressione della metalloproteinasi della matrice (MMP) e citochine pro-infiammatorie (IL1 β e TNF α). Questi cambiamenti sono coerenti con le condizioni fisiopatologiche di OA negli esseri umani, indicando che la MIA può indurre un modello di dolore OA misurabile e di successo. Questo studio mira a descrivere la metodologia di iniezione intra-articolare di MIA nei ratti e discutere i conseguenti comportamenti correlati al dolore e i cambiamenti istopatologici.

Introduzione

L'osteoartrite (OA) è la malattia articolare più comune al mondo, che colpisce circa il 10-12% delle popolazioni negli adulti1. L'articolazione più generalmente coinvolta è il ginocchio e l'OA ha una maggiore incidenza negli anziani, in particolare nelle donne2. Come malattia cronica, l'OA si sviluppa progressivamente nel corso dei decenni in insufficienza articolare con sintomi come perdita di cartilagine, infiammazione sinoviale, osteofitosi, diminuzione della funzione e dolore cronico3. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), l'OA è la quarta malattia più diffusa nelle femmine e l'ottava malattia più diffusa nei maschi. Entro il 2020, l'OA potrebbe diventare la quarta malattia più invalidante nell'uomo4. Tuttavia, le terapie attualmente disponibili di OA affrontano solo i sintomi e prolungano il tempo fino all'intervento chirurgico di sostituzione articolare5.

L'OA spontanea nei pazienti umani spesso richiede molto tempo per produrre sintomi clinici come il dolore articolare correlato6. Nelle prime fasi dell'OA, il dolore è solitamente intermittente e diventa più frequente e grave con il progredire della malattia, rendendolo il reclamo predominante dei pazienti7. Pertanto, nell'ultimo mezzo secolo sono stati sviluppati ampi modelli animali per il dolore OA per promuovere la terapia antidolorifica. I modelli OA sono stati classicamente suddivisi in modelli spontanei e indotti. I modelli spontanei includono modelli naturali e modelli geneticamente modificati, che possono simulare più da vicino il decorso dell'OA primaria nell'uomo8. I modelli indotti possono generalmente essere suddivisi in due categorie: 1) OA post-traumatica indotta da chirurgia o altri traumi; o 2) iniezione intra-articolare di sostanze condrotossiche o pro-infiammatorie3. Questi modelli gettano le basi per lo studio fisiopatologico dell'OA e contribuiscono notevolmente allo sviluppo di farmaci per ridurre il dolore e aumentare la funzione.

Recentemente, l'induttore più utilizzato per la modellazione OA è il mono-iodoacetato (MIA). MIA, un inibitore della gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi, può causare cambiamenti nella matrice della cartilagine, degradazione, perdita di cartilagine, sinovite e altri cambiamenti, che sono simili ai cambiamenti patologici dell'osteoartrite umana9. È stato notato che l'iniezione intra-articolare di MIA ha indotto dolore continuo a 28 giorni dopo la somministrazione di MIA, indicando che il modello MIA può essere utile per studiare il dolore nocicettivo cronico10,11,12. In questo studio, i ratti maschi di Sprague-Dawley hanno ricevuto iniezioni intra-articolari con 0,5, 1,5 o 3 mg di MIA nelle articolazioni del ginocchio. La gravità del dolore articolare indotto da MIA è stata misurata mediante valutazione della sensibilità meccanica e termica a 1, 7, 14, 21, 28 e 35 giorni dopo le iniezioni. Su questa base, 1,5 mg di MIA è stata selezionata come concentrazione finale per valutare i modelli di andatura e i cambiamenti istologici a 28 giorni dopo le iniezioni.

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Protocollo

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal Comitato per le norme mediche e l'etica dell'Università medica cinese di Zhejiang e sono conformi alla legislazione cinese sull'uso e la cura degli animali da laboratorio.

1. Iniezione intra-articolare di mono-iodoacetato nel ginocchio

  1. Dopo una settimana di acclimatazione, dividere casualmente e equamente 40 ratti maschi di Sprague-Dawley del peso di 180-200 g (4-5 settimane) in quattro gruppi (n = 10 ratti / gruppo).
    NOTA: I ratti nel gruppo di controllo saranno iniettati intra-articolarmente con 50 μL di soluzione salina, mentre i ratti nei gruppi sperimentali saranno trattati con 0,5, 1,5 o 3 mg di MIA disciolto in 50 μL di soluzione salina, rispettivamente.
  2. Il giorno dell'iniezione, preparare appena la soluzione di MIA in soluzione salina sterile (0,9% NaCl) a 15, 30 e 60 mg/ml di concentrazione e pentobarbital al 10% in soluzione salina sterile (0,9% NaCl).
    ATTENZIONE: MIA ha un effetto estremamente distruttivo sulla mucosa, il tratto respiratorio superiore, l'occhio e la pelle e altri tessuti. Pertanto, si raccomandano maschera e guanti quando si prepara una soluzione.
  3. Anestetizzare i ratti mediante iniezione intraperitoneale di ketamina a 60 mg/kg e xilazina a 5 mg/kg (entrambi preparati in soluzione salina). Bloccare delicatamente le dita dei piedi del topo con una pinzetta per confermare l'anestesia.
  4. Posiziona il topo con la schiena rivolta verso il basso. Rasare il ginocchio e pulire l'area circostante l'articolazione del ginocchio con alcool.
  5. Tieni il ginocchio con un angolo di 90° e rivela il tendine rotuleo bianco sotto la rotula. Premere il tendine rotuleo con la punta del dito per trovare lo spazio sotto la rotula.
  6. Scegli la giunzione dello spazio e il tendine rotuleo laterale come sito di iniezione. Quindi, inserire l'ago da 26 G verticalmente nel sito di circa 5 mm. Nessuna resistenza dovrebbe essere avvertita quando l'ago si trova nello spazio articolare.
    NOTA: È importante mantenere l'ago perpendicolare al sito di iniezione.
  7. Iniettare 50 μL di soluzione salina o MIA nella cavità articolare. Estrarre lentamente l'ago e avvolgere un pezzo di garza attorno al sito di iniezione per ridurre al minimo il reflusso e le perdite. Dopo il recupero dell'anestesia, rimuovere la garza.
  8. Test del comportamento correlato al dolore a 1, 7, 14, 21, 28 e 35 giorni dopo le iniezioni come descritto nel paragrafo 2.

2. Valutazioni comportamentali

  1. Soglia di prelievo meccanico (MWT)
    NOTA: Il MWT è stato misurato dal test di von Frey13 e l'osservatore è stato accecato alle iniezioni che gli animali avevano ricevuto.
    1. Metti un topo in una gabbia di plastica sopraelevata (17 cm x 11 cm x 13 cm) con una base di rete metallica sospesa a 50 cm sopra un tavolo. Assicurarsi che l'ambiente di prova sia silenzioso e dare al ratto 30 minuti per adattarsi all'ambiente.
    2. Premere l'ago di von Frey perpendicolarmente sulla superficie plantare della zampa posteriore di ciascun ratto. Aumentare la pressione gradualmente (circa 20 g/s) e linearmente fino a quando non si verifica il sollevamento della zampa o la leccatura della zampa.
    3. Utilizzare una forza inferiore alla soglia precedente per assicurarsi che la soglia sia la forza di prelievo minima. Testare ogni ratto più di tre volte, ad almeno 3-5 minuti di distanza.
    4. Registra la forza minima che provoca un riflesso di ritiro della zampa. Media dei dati come MWT dei ratti.
  2. Latenza di prelievo termico (TWL)
    NOTA: Il TWL è stato misurato utilizzando l'apparecchiatura di prova plantare (Table of Materials) e l'osservatore è stato accecato alle iniezioni che gli animali avevano ricevuto.
    1. Posizionare una scatola di plexiglass (60 cm x 20 cm x 14 cm, divisa in 6 scomparti) su una lastra di vetro spessa 3 mm e inserire i ratti nella scatola (uno in ogni scomparto). Assicurati che l'ambiente sia silenzioso e che la temperatura ambiente sia costante.
    2. Dare ai ratti 30 minuti per adattarsi all'ambiente di test.
    3. Calibrare lo stimolo termico tramite il radiometro a infrarossi. Impostare l'intensità infrarossa desiderata su 70 unità.
    4. Posizionare l'emettitore/rilevatore a infrarossi sul contenitore direttamente sotto il centro della zampa da testare.
    5. Premendo il pulsante START . Il timer si avvierà automaticamente. Il controller spegnerà automaticamente la luce a infrarossi e interromperà del tutto il timer non appena si verifica il movimento della zampa.
    6. Registra il tempo di reazione quando la comparsa del ritiro della zampa e la leccatura della zampa.
      NOTA: Una risposta positiva per il test è considerata come ritiro della zampa e leccata della zampa. Se si verifica solo il ritiro della zampa, dovrebbe essere considerato come un movimento volontario del ratto piuttosto che una risposta positiva.
    7. Ripeti il test più di tre volte. Media dei dati come il TWL dei ratti.
      NOTA: Ogni esposizione di calore radiante non deve superare i 20 s. Le stimolazioni a infrarossi sulla stessa zampa posteriore dovrebbero essere distanti almeno 3-5 minuti.
  3. Analisi del modello di andatura
    NOTA: Le analisi del modello di andatura sono state misurate utilizzando un sistema di imaging (Table of Materials) e l'osservatore è stato accecato alle iniezioni che gli animali avevano ricevuto.
    1. Regolare la lunghezza del compartimento pedonale utilizzando le manopole su entrambe le estremità del compartimento pedonale alla lunghezza adatta per i ratti (ad esempio, 61 cm).
    2. Metti un topo nello scompartimento pedonale e addestra i ratti a fare corse ininterrotte per almeno 5 cicli di passi ad una velocità di 18 cm / s prima dell'esperimento formale.
      NOTA: Quando un ratto viene posizionato per la prima volta nello scompartimento pedonale, la velocità può essere impostata su circa 20 cm / s e disattivata quando si corre intorno a 2 s. Quindi impostare la velocità su 18 cm/s. Picchiettare delicatamente la parte posteriore del topo con la partizione, se il topo si ferma o si ritira durante la camminata. Cerca di ridurre gradualmente la velocità da 18 cm/s a 10 cm/s. Se il ratto alla fine non riesce a eseguire il test, è accettabile scegliere un altro ratto per il test.
    3. Aumentare lentamente la velocità del tapis roulant fino a raggiungere la velocità target (18 cm/s). Cattura almeno 5 s video di movimento continuo del ratto con la videocamera digitale ad alta velocità montata sotto la cintura trasparente del tapis roulant.
    4. Testare ogni ratto ad almeno 5 minuti di distanza per ottenere almeno tre corse ininterrotte.
    5. Disegna un "riquadro di delimitazione" per definire il confine dell'immagine dell'animale che cammina nel software di imaging e inserisci la velocità di esecuzione per ogni video. Seleziona i video come gruppo ed elabora i video automaticamente dal software. Dopo aver elaborato i video, il software produrrà diversi fogli di calcolo per segnalare gli indici di andatura, tra cui posizione, oscillazione, frenata, propulsione, cadenza, sequenza di passi, ecc.
    6. Calcola l'area totale della zampa (cm2), la lunghezza media del passo (cm) e unisci la lunghezza del passo.
      NOTA: L'area totale della zampa è la media dell'area totale di quattro zampe di ciascun gruppo di ratti e l'area della zampa è definita come l'area massima della zampa a contatto con il tapis roulant durante la fase di posizione del ciclo di passi. La lunghezza del passo è la distanza tra i contatti iniziali della stessa zampa in un passo completo. Lunghezza unitaria del passo = lunghezza media del passo (cm)/lunghezza del corpo (cm).

3. Analisi istopatologiche e immunoistochimiche

  1. Eutanasia ratti mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico a 150 mg/kg (preparato in soluzione salina). Resecare immediatamente le articolazioni del ginocchio per le analisi istologiche.
  2. Fissare le articolazioni in formalina al 10% per 24 ore, decalcificare con EDTA al 10% in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) per 8 settimane, quindi incorporare le articolazioni in paraffina.
    ATTENZIONE: La formalina può causare irritazione agli occhi, alla pelle e alle vie respiratorie. Dovrebbe essere maneggiato in un cappuccio.
  3. Sezionare i giunti incorporati in paraffina a 3 mm di spessore con un microtomo e galleggiare in un bagnomaria a 40 °C contenente acqua distillata.
  4. Trasferire le sezioni su vetrini. Asciugare i vetrini per una notte e conservare i vetrini a temperatura ambiente (RT) per continuare la colorazione successiva.
  5. Mettere i vetrini in forno a 60 °C per 4 ore per deparaffinizzare.
  6. Immergere le diapositive successivamente in xilene, xilene, etanolo al 100%, etanolo al 100%, etanolo al 95%, etanolo all'80% e etanolo al 75% per 5 minuti, rispettivamente, a RT.
  7. Sezioni di colorazione con ematossilina ed eosina (H & E), safranina-O (SO) ed ematossilina blu di Alcian (ABH), nonché anticorpi contro il collagene di tipo II di ratto (Col2), il collagene di tipo X (Col10) e la metalloproteinasi della matrice 13 (MMP13), come descritto nei passaggi 3.8-3.12.
  8. Colorazione H&E
    1. Risciacquare i vetrini con H2O deionizzato per 3 min. Colorare i vetrini con ematossilina per 3-5 minuti.
    2. Risciacquare i vetrini con H2O 3x deionizzato, 1 minuto ciascuno, fino a quando non rimane ematossilina sulla superficie.
    3. Diapositive colorate con eosina per 30 s. Quindi, sciacquare i vetrini con H2O 3x deionizzato, 1 minuto ciascuno, fino a quando non rimane eosina sulla superficie.
    4. Immergere i vetrini in ammoniaca allo 0,1% per 10-20 s. Quindi, sciacquare i vetrini con H2O 3x deionizzato, 1 min ciascuno.
    5. Immergere i vetrini successivamente in etanolo al 95%, etanolo al 100%, xilene, xilene e xilene per 1 minuto, rispettivamente.
    6. Copri le guide con resina neutra.
  9. Colorazione SO
    1. Risciacquare i vetrini con H2O deionizzato per 3 min. Colorare i vetrini con ematossilina per 3-5 minuti.
    2. Differenziare rapidamente in alcool acido all'1% (circa 3 s). Quindi, sciacquare i vetrini con H2O 3x deionizzato, 1 minuto ciascuno, fino a quando non rimane ematossilina sulla superficie.
    3. Vetrini con soluzione Fast Green (FCF) per 5 min. Quindi, sciacquare i vetrini con H2O 3x deionizzato, 1 min ciascuno.
    4. Colorare i vetrini con SO per 1−2 min. Quindi, sciacquare i vetrini con H2O 3x deionizzato, 1 min ciascuno.
    5. Risciacquare i vetrini con acido acetico all'1% per 1-2 minuti per rimuovere il FCF residuo. Risciacquare i vetrini con H2O deionizzato per 1 min.
    6. Immergere i vetrini successivamente in etanolo al 95%, etanolo al 100%, xilene, xilene e xilene per 1 minuto, rispettivamente.
    7. Copri le guide con resina neutra.
  10. Colorazione ABH
    1. Risciacquare i vetrini con H2O deionizzato per 3 min. Immergere i vetrini in alcool acido all'1% per 30 secondi e scolare brevemente su un tovagliolo di carta (non risciacquare).
    2. Immergere le diapositive in ABH per 1 ora. Quindi, sciacquare i vetrini con H2O 3x deionizzato, 1 minuto ciascuno, fino a quando non rimane ABH sulla superficie.
    3. Differenziare rapidamente in alcool acido all'1% (circa 3 s). Risciacquare i vetrini con H2O 3x deionizzati, 1 min ciascuno.
    4. Immergere i vetrini in acqua di ammonio allo 0,5% per 15 s. Quindi, sciacquare i vetrini con H2O 3x deionizzato, 1 min ciascuno.
    5. Immergere i vetrini in etanolo al 95% per 1 minuto. Immergere i vetrini in una soluzione G di eosina/arancia per 1,5 minuti.
    6. Immergere i vetrini successivamente in etanolo al 95%, etanolo al 100%, xilene, xilene e xilene per 1 minuto, rispettivamente.
    7. Copri le guide con resina neutra.
  11. Esaminare tutti i vetrini al microscopio e valutare statisticamente su una scala da 0 a 13 mediante osservazione in doppio cieco, secondo il sistema di punteggio14 di Mankin.
  12. Immunoistochimica
    1. Risciacquare i vetrini con H2O deionizzato per 3 min.
    2. Immergere i vetrini in citrato di sodio 0,1 M e posizionare i vetrini in un forno a 60 °C per 4 ore per recuperare l'antigene.
    3. Immergi le diapositive in Triton X-100 allo 0,3% in PBS per 10 minuti. Quindi, sciacquare i vetrini con PBS 2x, 3 minuti ciascuno.
    4. Incubare sezioni in soluzione di H2 O2 al 3% in metanolo a RT per 10 minuti per bloccare l'attività della perossidasi endogena. Risciacquare i vetrini con PBS 2x, 3 min ciascuno.
    5. Incubare le sezioni con siero di capra al 5% in PBS per 30 minuti a RT per bloccare qualsiasi legame non specifico. Risciacquare i vetrini con PBS 2x, 3 min ciascuno.
    6. Incubare le sezioni per una notte a 4 °C con 100 μL di anticorpi primari PBS-diluiti (1:1.000) contro il collagene di tipo II (Col2), il collagene di tipo X (Col10) e la metalloproteinasi della matrice 13 (MMP13). Risciacquare i vetrini con PBS 2x, 3 min ciascuno.
    7. Incubare le sezioni con 100 μL di anticorpo secondario diluito PBS (1:1.000) (secondario anti-topo di capra o secondario anti-topo di capra) per 20 minuti a RT. Risciacquare i vetrini con PBS 2x, 3 min ciascuno.
    8. Incubare sezioni con 100 μL di soluzione di lavoro 3,3′-diaminobenzidina (DAB). Monitorare la reazione mentre la reazione cromogenica trasforma i siti dell'epitopo in marrone.
      ATTENZIONE: DAB è cancerogeno. Indossare sempre guanti e lavorare in un cappuccio quando si lavora con DAB.
      NOTA: Il tempo di sviluppo del colore può variare da pochi secondi a 10 minuti.
    9. Non appena si sviluppa un colore marrone sulle sezioni, sciacquare i vetrini con H2O 2x deionizzati, 3 minuti ciascuno.
    10. Immergere i vetrini nell'ematossilina per 1-2 minuti per contrastare i vetrini. Quindi, sciacquare i vetrini con H2O 3x deionizzato, 1 min ciascuno.
    11. Immergere i vetrini successivamente in etanolo al 95%, etanolo al 100%, xilene, xilene e xilene per 1 minuto, rispettivamente.
    12. Copri le guide con resina neutra.
    13. Osservare il colore della colorazione anticorpale nelle sezioni al microscopio.

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Risultati

Con questa metodologia, abbiamo stabilito un modello di dolore OA nel ratto e rilevato i cambiamenti risultanti. MWT e TWL riflettevano rispettivamente l'allodinia meccanica e l'iperalgesia termica. Come mostrato in Figura 1, MIA ha indotto allodinia meccanica e iperalgesia termica presente in modo dose-dipendente. Sorprendentemente, la diminuzione della MWT ha raggiunto un picco da 21 giorni a 28 giorni, e poi è rimbalzata, suggerendo che la riparazione articolare può verificarsi in questa ...

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Discussione

Il modello di ratto di OA indotto da MIA è un modello consolidato e ampiamente utilizzato. L'iniezione intra-articolare di MIA provoca inizialmente un'infiammazione grave e acuta, che dà origine alla fase più lunga e degenerativa di OA17,18. In questa ricerca, abbiamo misurato la sensibilità nocicettiva mediante MWT e TWL e valutato le alterazioni dell'andatura con un sistema di imaging. Rapporti precedenti hanno rilevato che l'iniezione di MIA potrebbe aumentare...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato finanziato dalla Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (Grant No: LY17H270016), dalla National Natural Science Foundation of China (Grant No: 81774331, 81873049 e 81673997) e dallo Zhejiang Provincial Science and Technology Project of Traditional Chinese Medicine of China (Grant No: 2013ZQ007 e 2016ZZ011).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anticorpo anti-collagene IIAbcam(UK)34712Anticorpo primario per immunoistochimica (IHC)
Anticorpo anti-collagene X (Col10)Abcam(UK)49945Anticorpo primario per IHC
DigiGait Imaging SystemMouse Specifics (Boston, MA, USA)Attrezzatura per l'analisi dei modelli di andatura
EosinSigma-Aldrich861006Il colorante per l'HE colorazione
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252Il colorante per la colorazione SO
Anticorpo anti-topo di capraZSGQ-BIO (Pechino, Cina)PV-9002Anticorpo secondario per IHC
Anticorpo anti-coniglio di capraZSGQ-BIO (Pechino, Cina)PV-9001Anticorpo secondario per IHC
EmatossilinaSigma-AldrichH3163Il colorante per la
MIASigma-AldrichI4386-10Gpolvere
MMP13Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)69926Anticorpo primario per IHC
Centro modulare di inclusione tissutaleThermo Fisher Scientific (USA)EC 350Produce blocchi di paraffina.
Apparecchio per test plantareUgoBasile (Italia)37370Apparecchiatura per il test TWL
Kit di reagenti PrimeScript RT (Perfect Real Time)TaKaRa Biotechnology Co. Ltd. (Dalian, Cina)RR037AEstrazione di RNA totale da cellule in coltura
Microtomi rotanti e scorrevoliThermo Fisher Scientific (USA)HM325Sezioni precise di paraffina.
Safranin-OSigma-AldrichS2255Il colorante per la colorazione SO
Tissue-Tek VIP 5 JrSakura (Giappone)Processore di infiltrazione sottovuoto
colorazione HE

Riferimenti

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