Articolo metodologico

Analisi della popolazione laterale nelle linee cellulari tumorali solide

DOI:

10.3791/60658

⸱

23 febbraio 2021

 ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Nankai University, 2Tianjin Key Laboratory of Tumour Microenvironment and Neurovascular Regulation, 3Collaborative Innovation Center for Biotherapy, Nankai University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Viene presentato un metodo conveniente, veloce ed economico per misurare la proporzione di cellule della popolazione laterale nelle linee cellulari tumorali solide.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule staminali tumorali (CSC) sono una causa importante di crescita tumorale, metastasi e recidiva. L'isolamento e l'identificazione dei CSC sono di grande importanza per la ricerca sul tumore. Attualmente, diverse tecniche sono utilizzate per l'identificazione e la purificazione dei CSC dai tessuti tumorali e dalle linee cellulari tumorali. La separazione e l'analisi delle cellule della popolazione laterale (SP) sono due dei metodi comunemente usati. I metodi si basano sulla capacità dei CSC di espellere rapidamente coloranti fluorescenti, come hoechst 33342. L'efflux del colorante è associato ai trasportatori di cassette di legame ATP (ABC) e può essere inibito dagli inibitori del trasportatore ABC. Vengono descritti i metodi per la colorazione delle cellule tumorali coltivate con Hoechst 33342 e l'analisi della proporzione delle loro cellule SP mediante citometria a flusso. Questo test è conveniente, veloce ed economico. I dati generati in questo saggio possono contribuire a una migliore comprensione dell'effetto dei geni o di altri segnali extracellulari e intracellulari sulle proprietà di staminali delle cellule tumorali.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule staminali tumorali (CSC) sono sottoinsiemi di cellule con capacità di autorinnoto e potenziale di differenziazione multipla, che svolgono un ruolo vitale nella crescita tumorale, metastasi erecidiva 1,2. Attualmente, i CSC sono stati identificati per esistere in una varietà di tumori maligni, tra cui tumori polmonari, cerebrali, pancreas, prostata, seno e fegato3,4,5,6,7,8,9. L'identificazione dei CSC in questi tumori si basa principalmente sulla presenza di proteine marcatori superficiali, come l'alta e/o bassa espressione di CD44, CD24, CD133 e Sca-19,10, ma un marcatore unico in grado di distinguere le CSC dai non CSC non è stato segnalato finora. Attualmente, diverse tecniche sono utilizzate per identificare e purificare i CSC nei tessuti tumorali o nelle linee cellulari tumorali. Queste tecniche sono progettate in base alle proprietà specifiche dei CSC. Tra questi, i saggi e lo smistamento delle cellule della popolazione laterale (SP) sono due dei metodi comunemente usati.

Le cellule SP sono state originariamente scoperte da Goodell etal. Quando le cellule del midollo osseo del topo furono etichettate con il colorante fluorescente Hoechst 33342, un piccolo gruppo di cellule macchiate di hoechst 33342 appariva nel grafico a punti bidimensionale di un saggio di citometria a flusso. Hoechst 33342 è un colorante legante il DNA e ha almeno due modalità di legame che portano a diverse caratteristiche spettrali. Quando si visualizza l'emissione di fluorescenza a due lunghezze d'onda contemporaneamente, è possibile rivelare più popolazioni12. Nel loro saggio, l'Hoechst 33342 era eccitato a 350 nm e la fluorescenza è stata misurata utilizzando il filtro passa-banda (BP) da 450/20 nm e il filtro perimetrale long-pass (EFLP)11da 675 nm. Rispetto all'intera popolazione di cellule del midollo osseo, questo gruppo di cellule è stato arricchito con cellule staminali ematopoietiche chiamate cellule SP11. Le cellule SP sono in grado di espellere rapidamente hoechst 33342. L'efflux di questo colorante è correlato ai trasportatori di cassette di legame ATP (ABC)13, che possono essere inibiti da alcuni agenti come Fumitremorgin C14,Verapamil e Reserpine15,16. Successivamente, diverse proporzioni di cellule SP sono state rilevate in una varietà di tessuti, organi, tessuti tumorali e linee cellulari tumorali17,18,19. Queste cellule SP hanno molte caratteristiche delle cellule staminali17,19.

Questo manoscritto descrive l'etichettatura e la colorazione hoechst 33342 delle cellule tumorali coltivate e l'analisi delle cellule SP per citometria del flusso. Inoltre, vengono mostrate l'ottimizzazione della concentrazione di Hoechst 33342 e la corretta selezione del bloccante per una specifica linea cellulare tumorale utilizzando questo approccio. Infine, vengono dimostrati gli effetti della promozione della staminalità o dei segnali di inibizione sulla proporzione di SP nelle cellule tumorali. Gli esempi sperimentali dimostrano che l'analisi della SP può essere utilizzata per esplorare gli effetti di vari segnali, come l'espressione genica, piccoli inibitori, attivatori, citochine e chemiochine, sulla staminali tumorale. Rispetto ad altri metodi per l'isolamento e la purificazione dei CSC, come lo smistamento di CD44+/CD24– popolazione, analisi dell'aldeide deidrogenasi (ALDH) e test di formazione della sfera tumorale, questo metodo è più facile da manipolazione ed è conveniente.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparazione cellulare

  1. Digestione cellulare e neutralizzazione
    1. Seminare cellule tumorali (come le cellule MDA-MB-231) in una piastra di 6 pozzi e culturerle in un incubatore a 37 °C fornito con 5% di CO2.
    2. Raccogli le cellule quando la loro densità raggiunge circa il 90%. Aspirare accuratamente il mezzo di coltura e lavare accuratamente le cellule 2x con 3 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
      NOTA: Per esaminare gli effetti degli inibitori della via di segnalazione (ad esempio, inibitore di FRA1) o attivatori (ad esempio, attivatore STAT3) sulle caratteristiche di staminali delle cellule tumorali, le cellule tumorali vengono sementi in una piastra di 6 po po 'e pretrattate con inibitori o attivatori per un certo periodo di tempo prima del raccolto.
    3. Aggiungere 500 μL dello 0,25% di tripsiderina-EDTA ad ogni pozzo della piastra a 6 pozzetti, posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 °C per 1-3 minuti (min) e toccare delicatamente la piastra per staccare le cellule.
      NOTA: La digestione prolungata influenzerà il profilo SP a causa di cambiamenti nella vitalità cellulare.
    4. Aggiungere 3 mL di PBS integrato con il 2% di siero bovino fetale (FBS) ad ogni pozzo della piastra a 6 pozzi per terminare la digestione e pipettare delicatamente le cellule su e giù 3-5x per disperdere i grumi cellulari.
    5. Aggiungere 0,5 mL di sospensione cellulare a un pozzo di una nuova piastra da 6 porri ed esaminarla al microscopio. Se si osservano grumi cellulari, passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μM.
      NOTA: questo è un passaggio facoltativo.
    6. Trasferire le celle in un tubo di centrifuga da 15 ml. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min per le celle a pellet. Rimuovere il supernatante e riprenotarli in 3 mL di PBS integrati con FBS al 2%. Pipettare le celle su e giù 3-5x per mescolare accuratamente.
  2. Conteggio celle
    1. Aggiungere 50 μL della sospensione cellulare in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml e mescolarlo con una soluzione blu trypan da 50 μL. Pipetta 10 μL della miscela per contare il numero di cellule viventi usando un metodo standard, come un emocitometro.
    2. Diluire le cellule in PBS integrato con FBS al 2% ad una concentrazione finale di 1 x 106 celle/mL. Aggiungere 1 ml della sospensione cellulare a una provetta rotonda in polistirolo di 5 ml e preparare due provette campione.

2. Colorazione cellulare con Hoechst 33342

  1. Aggiungere hoechst 33342 a un tubo per raggiungere un'adeguata concentrazione finale.
    NOTA: Ad esempio, la concentrazione appropriata di Hoechst 33342 è di 3 μg/mL per le celle MDA-MB-231.
  2. Aggiungere un bloccante (ad esempio Fumitremorgin C, Verapamil o Reserpine) ad un altro tubo ad un'adeguata concentrazione finale e incubare il tubo a 37 °C per 30 minuti prima di aggiungere la stessa concentrazione di Hoechst 33342 descritta al passaggio 2.1.
    NOTA: Per le celle MDA-MB-231, il blocco appropriato è il reserpina (40 μM). La reserpina viene utilizzata come controllo di blocco per verificare l'assenza di celle nell'area SP gated.
  3. Preparare diversi tubi contenenti celle e aggiungere Hoechst 33342 a diversi gradienti di concentrazione. Dopo un saggio di citometria del flusso, scegliere la giusta concentrazione in base al profilo e alla proporzione di SP.
    NOTA: Questo è un passaggio opzionale utilizzato per definire la corretta concentrazione di Hoechst 33342.
  4. Preparare diversi tubi contenenti celle, aggiungere il bloccante a diversi gradienti di concentrazione, incubare i tubi a 37 °C per 30 minuti, quindi aggiungere Hoechst 33342 a una concentrazione appropriata. Dopo il saggio di citometria del flusso, scegliere la giusta concentrazione in base all'assenza di cellule nell'area SP gated.
    NOTA: Questo è un passaggio facoltativo utilizzato per definire la corretta concentrazione di bloccante.
  5. Posizionare i tubi in un incubatore a 37 °C e incubarli per 60 minuti, scuotendo i tubi ogni 10 minuti.
    NOTA: Scuotere accuratamente i tubi è importante per la colorazione, perché garantisce un contatto completo tra le cellule e il colorante per risultati di colorazione migliori.
  6. Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule a 200 x g, 4 °C per 5 minuti e aspirare attentamente il supernatante, perché le cellule formano pellet molto sciolti e instabili.
  7. Celle resuspend di ogni tubo in 1 ml di PBS ghiacciato integrato con FBS al 2% e pipettare le celle su e giù 3-5x per mescolare accuratamente. Aggiungere 1 μL di 1 mg/mL di propididio ioduro (PI) alla sospensione di ciascun tubo per identificare le cellule morte.
    NOTA: Tutte le procedure in questo passaggio devono essere eseguite a 4 °C per inibire l'efflusso di Hoechst 33342 dalle cellule tumorali. I tubi devono essere protetti dall'esposizione diretta alla luce.

3. Analisi per citometria del flusso

NOTA: Le istruzioni per l'uso del software del citometro di flusso (vedi Tabella dei materiali) sono descritte in questa sezione e nelle figure supplementari 1-10.

  1. Nel software del citometro di flusso fare clic sul pulsante CARTELLA. Fare clic sul pulsante Esperimento, quindi su Nuovo esperimento ( Figura supplementare1A,B).
  2. Fare clic sul pulsante OK. "Experiment_001" verrà mostrato nella cartella (Figura complementare 2A,B).
  3. Fare clic Experiment_001 pulsante di modifica per modificare il nome della cartella in un nome specifico (ad esempio, "20191118-SP"). Fare clic su Invio. Il nuovo nome ("20191118-SP") verrà visualizzato in FOLDER (Supplementary Figure 3A,B).
  4. Fare clic sul pulsante Nuovo campione per aggiungere un campione alla nuova cartella dell'esperimento ("20191118-SP"). Fate clic sul pulsante Nuovo tubo (New Tube) per aggiungere un tubo al campione. Fare clic sul pulsante Freccia ( Figuracomplementare 4A-C).
  5. Fare clic sul pulsante Parametri e impostare i parametri del citometro di flusso (Figura complementare 5).
    1. Utilizzare un dmsp (Dichroic Mirror Short-Pass) a 610 nm per separare le lunghezze d'onda di emissione. Utilizzare un filtro BP da 450/20 nm per raccogliere la fluorescenza blu e un EFLP da 675 nm per raccogliere la fluorescenza rossa.
      NOTA: Hoechst 33342 è eccitato con un laser UV a 355 nm e PI è eccitato a 488 nm.
  6. Eseguire i campioni di cella sul citometro di flusso.
    NOTA: le cellule SP possono essere ordinate per cernita cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) in condizioni sterili. Un totale di 100.000-500.000 cellule dovrebbero essere raccolte per gli esperimenti di follow-up.
    1. Eseguire celle macchiate con Hoechst 33342 sul citometro di flusso.
      1. Posizionare tubi contenenti celle macchiate con Hoechst 33342 sul citometro.
      2. Fate clic sul pulsante Traccia punti (Dot Plot) per visualizzare il tracciato punti, quindi fate clic sull'asse X e impostatelo su "FSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "PI-A". Visualizzare il tracciato di punti dell'area dell'impulso di dispersione in avanti (FSC-A, asse X impostato sulla modalità lineare) rispetto alla fluorescenza PI (asse Y impostato sulla scala logaritmica). Regolare le tensioni per mostrare le celle viventi nel lato destro e le celle non viventi, che sono brillantemente macchiate di PI, nell'angolo in alto a sinistra. Stabilire quindi un gate poligonale per escludere le celle morte e i detriti cellulari (Figura 1A) facendo clic sul pulsante Porta poligono per gateare il sottoinsieme P1, noto anche come sottoinsieme FSC-A, PI-A (Figura supplementare 6A,B).
      3. Fate clic sul pulsante Traccia punti (Dot Plot) per visualizzare il tracciato punti, fate clic sull'asse X e impostatelo su "FSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "FSC-W". Visualizzare il grafico a punti dell'asse FSC-A (asse X) rispetto alla larghezza dell'impulso di dispersione in avanti (FSC-W, asse Y). Fare clic con il pulsante destro del mouse sul tracciato punti, scegliere il pulsante P1 sotto il pulsante Mostra popolazioni. Fate clic sul pulsante Porta rettangolare (Rectangular Gate) per creare un gate rettangolare per gateare il sottoinsieme P2 (noto anche come sottoinsieme FSC-A, FSC-W). Ciò escluderà le celle con grandi volumi(figura complementare 7A-C e figura 1A).
      4. Fate clic sul pulsante Traccia punti (Dot Plot) per visualizzare il tracciato punti, fate clic sull'asse X e impostatelo su "SSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "SSC-W". Visualizzare il grafico a punti dell'area dell'impulso di dispersione laterale (SSC-A, asse X) rispetto alla larghezza dell'impulso di dispersione laterale (SSC-W, asse Y). Fare clic con il pulsante destro del mouse sul tracciato dei punti e scegliere il pulsante P2 in Mostra popolazioni. Quindi fate clic sul pulsante Porta rettangolare (Rectangular Gate) per creare un gate rettangolare per gateare il sottoinsieme P3 (noto anche come sottoinsieme SSC-A, SSC-W). Ciò otterrà una popolazione cellulare con granularità uniforme (Figura complementare 8A-C e Figura 1A).
      5. Fate clic sul pulsante Traccia punti (Dot Plot) per visualizzare il tracciato punto, fate clic sull'asse X e impostatelo su "Hoechst Red-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "Hoechst Blue-A". Visualizzate il grafico a punti di Hoechst Red-A (asse X) rispetto all'asse Hoechst Blue-A (asse Y). Fare clic con il pulsante destro del mouse sul tracciato punti, scegliere il pulsante P3 sotto il pulsante Mostra popolazioni. Fate clic sul pulsante Porta poligono (Polygon Gate) per creare un gate poligonale per gateare il sottoinsieme P4 (noto anche come sottoinsieme Rosso-A di Hoechst, Blu-A di Hoechst). Fare clic con il pulsante destro del mouse sul tracciato punti, scegliere il pulsante Mostra gerarchia di popolazione per visualizzare la gerarchia della popolazione.
        NOTA: La trama dei punti mostrerà tre diverse popolazioni: 1) una popolazione di fase G0-G1 vicino al centro del grafico; 2) una popolazione di fase S-G2/M vicino all'angolo in alto a destra; 3) l'SP. L'SP viene quindi gated per ulteriori analisi(figura complementare 9A-D e figura 1A). Se il grafico a punti di Hoechst Red-A contro Hoechst Blue-A non mostra un profilo SP simile a quello mostrato nella Figura 1A, le tensioni devono essere regolate fino a quando non viene visualizzato un profilo simile. Nel frattempo, regola tutti i cancelli sopra di conseguenza.
      6. Dopo aver determinato l'area di gate delle celle SP, fare clic su Acquisisci dati per raccogliere 20.000-100.000 eventi da ogni campione per analizzare la percentuale di celle SP (Figura complementare 10).
    2. Eseguire le celle macchiate di Hoechst 33342 trattate con bloccante sul citometro a flusso.
      1. Posizionare tubi contenenti bloccante sul citometro e far funzionare le celle utilizzando le stesse tensioni e cancelli per verificare ulteriormente se le tensioni e i cancelli sono selezionati in modo appropriato.
        NOTA: Rispetto alla sola colorazione Hoechst 33342, solo una piccolissimo percentuale di cellule, se presente, dovrebbe apparire nell'area recintata dell'SP (Figura 1B).
      2. Raccogli 20.000-100.000 eventi da ogni campione per analizzare la percentuale di celle SP.

4. Analisi dei dati

NOTA: Le istruzioni per l'uso del software di analisi della citometria del flusso (vedi Tabella dei materiali)sono descritte in questa sezione e nelle figure supplementari 11-16.

  1. Copiare i file in formato fcs in un computer, aprire il software di analisi della citometria a flusso e trascinare un file di esempio nel software (Figura complementare 11A,B).
  2. Gate e ottenere la percentuale di celle SP.
    1. Fare doppio clic su questo filedi esempio , fare clic sull'asse X e impostarlo su "FSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "PI-A". Creare quindi un gate poligonale e fare clic sul pulsante OK per ottenere il sottoinsieme FSC-A, PI-A ( SupplementaryFigure 12A-E).
    2. Fare doppio clic sul file del sottoinsieme FSC-A, PI-A, sull'asse X e impostarlo su "FSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "FSC-W". Creare quindi un gate rettangolare e fare clic sul pulsante OK per ottenere il sottoinsieme FSC-A, FSC-W (Figura complementare 13A-E).
    3. Fare doppio clic sul file del sottoinsieme FSC-A, FSC-W, sull'asse X e impostarlo su "SSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "SSC-W". Creare quindi un gate rettangolare e fare clic sul pulsante OK per ottenere il sottoinsieme SSC-A, SSC-W (Figura complementare 14A-E).
    4. Fare doppio clic sul file del sottoinsieme SSC-A, SSC-W, sull'asse X e impostarlo su "Hoechst Red-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "Hoechst Blue-A". Creare quindi un gate poligonale e fare clic sul pulsante OK per ottenere il sottoinsieme Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A ( Figurasupplementare 15A-E).
    5. Aprire l'editor di layout facendo clic sul pulsante Apri editor layout. Trascinare il file del sottoinsieme SSC-A, SSC-W nell'Editor layout, quindi fare clic sul pulsante Fare clic sul pulsante Fare clic per salvare la finestra del layout in file per salvare i risultati dell'immagine ( Figura supplementare16A-C).
  3. Salvare l'area di lavoro per conservare le informazioni di gating durante la chiusura del software.
  4. Eseguire analisi t-test con software di analisi statistica per confrontare la differenza tra due gruppi. Un valore di P < 0,05 è stato definito statisticamente significativo.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Secondo questo metodo sono state eseguite quattro analisi sperimentali dell'SP. Nel primo, abbiamo rilevato la proporzione di cellule SP in MDA-MB-231, che è una linea cellulare per il cancro al seno umano tripla negativa, in condizioni normali. Dopo il conteggio delle cellule, hoechst 33342 è stato aggiunto in un tubo contenente 1 x10 6 celle ad una concentrazione finale di 3 μg/mL. Reserpina e Hoechst 33342 sono stati aggiunti ad un altro tubo a concentrazioni finali rispettivamente di 40 μM e 3 μg/mL. PI è ...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ci sono diversi punti chiave da tenere a mente per il test SP. Il primo è la selezione di un blocco adeguato, come Verapamil o Reserpine, per ogni linea cellulare, perché la posizione "gate" delle celle SP è determinata in base alla posizione in cui un gran numero di cellule SP scompaiono dopo l'aggiunta del blocco. Per la linea di celle MDA-MB-231, Reserpine funziona bene. Tuttavia, per altre linee di celle, i blocchi diversi potrebbero funzionare meglio.

Il secondo è la concentrazione di Hoe...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato finanziato dalla Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 e 81972787; Fondazione di Scienze Naturali della Città di Tianjin (Cina) 19JCYBJC27300; Tianjin People's Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Fondi di ricerca fondamentali per le università centrali, l'Università di Nankai 63191153.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
piastra per coltura cellulare a 6 pozzettiCORNING35169,5 cm2 (circa)
ColivelinMCEHY-P1061ASer-Ala-Leu-Arg-Ser-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro
Siero fetale bovino (FBS)Biological Industries (BIOIND)04-001-1ACS
Citometro a flussoBD BiosciencesBD LSRFortessa
Software per citometro a flussoBD BiosciencesFACSDiva
Software per analisi per citometria a flussoBD BiosciencesFlowJo
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261bisBenzimide H 33342 tricloridrato
Polistirene provetta a fondo tondoCORNING35205412 x 75 mm, 5 mL
Propidio ioduro (PI)Sigma-AldrichP41703,8-Diamino-5-[3-(dietilmetilammonio)propil]-6-fenilfenantridinio diioduro
ReserpinaSigma-Aldrich83580(3β, 16β, 17&alfa;, 18β, 20&alfa;)-11,17-Dimetossi-18-[(3,4,5-trimetossibenzoil)ossi]yohimban-16-carbossilico estere
metilico SKLB816Fornito dal Dr. Shengyong Yang, Università
Tripsina-EDTA (0,25%), fenolo rossoGibco25200072
Verapamil cloridratoSigma-AldrichV46295-[N-(3,4-Dimetossifeniletil)metilammino] cloridrato di -2-(3,4-dimetossifenil)-2-isopropilvaleronitrile
del Sichuan

Riferimenti

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