Il presente manoscritto descrive come isolare le arteriole e i capillari ippocampali dal cervello del topo e come pressurizzarli per la miografia a pressione, l'immunofluorescenza, la biochimica e gli studi molecolari.
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Articolo metodologico
Ex Vivo Pressurizzato Ippocampo Capillary-Parenchymal Arteriole Preparazione per lo Studio Funzionale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Dalle sottili alterazioni comportamentali alla demenza in fase avanzata, il danno vascolare si sviluppa in genere a seguito di ischemia cerebrale. L'ictus e l'arresto cardiaco sono malattie sessualmente dimorfiche, ed entrambi inducono l'ischemia cerebrale. Tuttavia, i progressi nella comprensione del danno vascolare vascolare, e quindi nello sviluppo di trattamenti specifici per il sesso, sono stati in parte limitati dalle sfide nello studio della microcircolazione cerebrale dai modelli murini negli studi funzionali. Qui, presentiamo un approccio per esaminare la segnalazione capillary-to-arteriola in una preparazione capillary-ppillaryle capillary-parenchymic (HiCaPA) ex vivo ippocampale -parenchymal (HiCaPA) dal cervello di topo. Descriviamo come isolare, cannulare e pressurizzare la microcircolazione per misurare il diametro arteriolare in risposta alla stimolazione capillare. Mostriamo quali controlli funzionali appropriati possono essere utilizzati per convalidare l'integrità di preparazione HiCaPA e visualizzare risultati tipici, tra cui il test del potassio come agente di accoppiamento neurovascolare e l'effetto dell'inibitore recentemente caratterizzato della famiglia di canali di potassio rettificante interno Kir2, ML133. Inoltre, confrontiamo le risposte nei preparati vinti da topi maschi e femmine. Mentre questi dati riflettono le indagini funzionali, il nostro approccio può essere utilizzato anche negli studi di biologia molecolare, immunochimica ed elettrofisiologia.
Introduzione
La circolazione pial sulla superficie del cervello è stata oggetto di molti studi, in parte a causa della sua accessibilità sperimentale. Tuttavia, la topologia della vascolatura cerebrale crea regioni distinte. In contrasto con la solida rete di pial ricca di anastomosi con notevole capacità di reindirizzare il flusso sanguigno, le arteriole parenchimale intracerebrali (PA) presentano un approvvigionamento collaterale limitato, ognuno dei quali perfonde un volume discreto di tessuto nervoso1,2. Questo crea un effetto di collo di bottiglia sul flusso sanguigno che, combinato con caratteristiche fisiologiche un....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Colorado, Anschutz Medical Campus e sono stati eseguiti secondo le linee guida del National Institutes of Health.
1. Soluzioni
- Utilizzare la salina tampone MOPS per la dissezione e conservare i campioni a 4 gradi centigradi prima del loro utilizzo. Non gas la soluzione. Preparare la salina tamponata tamponata MOPS con la seguente composizione: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO2, 1 mM MgMgMG CaCl2, 5 mM di glucosio, 3 mM MOPS, 0,02 mM EDTA, 2 mM di pirama, 10 album di si....
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Risultati
Icanali diconducono conduzione endoteliale di piccole endoterie (SK) e di conduzione intermedia (IK) Ca2,sensibili a K, esercitano un'influenza dilatoria sul diametro delle PA. L'applicazione del bagno di 1 -M NS309, un agonista sintetico IK e SK canale, causato dilatazione quasi massima (Figura 2A,B). Tuttavia, le cellule endoteliali capillari mancano di canali IK e SK e non hanno iperpolarizzato in risposta a NS309
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Discussione
La preparazione pressurizzata HiCaPA (ippocampo capillary-parenchymal arteriole) descritta nel presente manoscritto è un'estensione della nostra procedura consolidata per isolare, pressurizzare e studiare arteriole parenchymal29. Recentemente abbiamo riferito che Kir2.1 canali in cervello capillare cellule endoteliali senso aumenta in [K]o associato con l'attivazione neurale, e generare un segnale iperpolarizzante ascendente che dilata arterioles a monte20
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Jules Morin per commenti approfonditi sul manoscritto. Questa ricerca è stata finanziata dai premi dell'organizzazione non-profit CADASIL Together We Have Hope, del Center for Women's Health and Research e della NHLBI R01HL136636 (FD).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,22µ m Filtri per siringhe | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Nero | Strumenti per microchirurgia, Inc | S12-0 NYLON | |
| Regolatore di temperatura automatico | Warner Instruments | TC-324B | |
| Vetro borosilicato D.E.: 1,2 mm, D.I.D.: 0,68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 diidrato | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-glucosio | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Cannocchiale di dissezione | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 - pompa completa con azionamento e testa della pompa MS/CA 4-12 | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Forbici fini - Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Scaldabagno in linea | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Milite&commercio; Pinze per tessuti | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Solfato di magnesio eptaidrato | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anidro | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipolatore | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 cloridrato | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III - Sistemi di erogazione per microiniezione intracellulare, | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| con pompa peristaltica | Systems Strumentazione | PS-200 | |
| Piruvato di sodio | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Pinze | super finiForbici chirurgiche Fine Science Tools | 11252-20 | |
| - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Estrattore verticale per micropipette | Narishige | PP-83 |
Riferimenti
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
- Shih, A. Y., et al.
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Ristampe e permessi
