In questo protocollo, viene descritto un metodo di isolamento murine ilet e trapianto nel tessuto adiposo bianco sottocutaneo inguinale. Le isole di murine singeniche isolate vengono trapiantate in un recipiente murino utilizzando un idrogel di membrana sotterranea. Viene monitorato il livello di glucosio nel sangue dei destinatari e viene eseguita l'analisi istologia degli innesti di islet.
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Articolo metodologico
Modello di trapianto di Murine (ISWAT) del tessuto adiposo sottocutaneo inguinale (ISWAT)
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il trapianto di islet pancreatico è un trattamento terapeutico consolidato per il diabete di tipo 1. La capsula renale è il sito più comunemente usato per il trapianto di isolotto nei modelli di roditori. Tuttavia, la capsula renale stretta limita il trapianto di isole sufficienti negli animali di grandi dimensioni e negli esseri umani. Il tessuto adiposo bianco sottocutaneo inguinale (ISWAT), un nuovo spazio sottocutaneo, è stato trovato come un sito potenzialmente prezioso per il trapianto di isolotto. Questo sito ha un migliore apporto di sangue rispetto ad altri spazi sottocutanei. Inoltre, l'ISWAT ospita una massa di isolotto più grande della capsula renale, e il trapianto in esso è semplice. Questo manoscritto descrive la procedura di isolamento e trapianto di isolotti di topo nel sito ISWAT dei destinatari di topi diabetici singenici. Utilizzando questo protocollo, le isole pancreatiche murine sono state isolate dalla digestione standard del collagenase e un idrogel a matrice di membrana seminterrato è stato utilizzato per fissare le isole purificate nel sito ISWAT. I livelli di glucosio nel sangue dei topi riceventi sono stati monitorati per più di 100 giorni. Gli innesti di isle sono stati recuperati al giorno 100 dopo il trapianto per l'analisi istologica. Il protocollo per il trapianto di isolotto nel sito ISWAT descritto in questo manoscritto è semplice ed efficace.
Introduzione
L'incidenza e la prevalenza a livello mondiale del diabete mellito di tipo 1 (T1DM) sono in rapido aumento, secondo i dati statistici della Federazione Internazionale del Diabete (IDF)1. Il trapianto di islet è uno degli approcci più promettenti per il trattamento del T1DM4. Dal momento che è stata riportata la grande scoperta nel trapianto di isolotto clinico utilizzando il protocollo di Edmonton2, la sopravvivenza dell'innesto di isolotto funzionante nei destinatari T1DM dopo 5 anni raggiunge circa il 50%3.
In passato, sono stati esplorati diversi siti di trapianto, come il fegato, la capsula renale, la milza, la regione intramuscolare, lo spazio sottocutaneo, il midollo osseo e il sacchetto omentale per il trapianto sperimentale di isolotto5,6,7. Alcuni dei siti di cui sopra sono stati testati in ambienti clinici8. Anche se il trapianto di isolotto nel fegato rimane il metodo più utilizzato nell'applicazione clinica attualmente9, ci sono diversi problemi importanti da affrontare quando si utilizza questo sito. Per esempio, come ridurre la perdita precoce delle isole trapiantate causata dalla reazione infiammatoria mediata istantanea del sangue (IBMIR) e scarsa ossigenazione fornire10,11 e come recuperare gli innesti di isole se necessario, perché si differenziano diffusamente nel fegato. La capsula renale può essere un sito ideale per i destinatari dei roditori. Tuttavia, la capsula renale stretta limita il trapianto di sufficienti isolotti allogenici negli esseri umani, anche se può essere una soluzione migliore per lo xenotrapianto delle isole a causa dei preparati altamente purificati dell'isolotto di porcina utilizzati clinicamente5,12. Pertanto, è in corso la ricerca di un sito più adatto per il trapianto di isolotto.
Lo spazio sottocutaneo può essere utilizzato come sito clinicamente applicabile per il trapianto di isolotto a causa della sua accessibilità. Tuttavia, l'efficienza del trapianto di isolotto nello spazio sottocutaneo è estremamente bassa, richiedendo quindi un numero relativamente elevato di isoloseri per invertire l'iperglicemia13. Recentemente, un team di ricerca giapponese ha trovato l'ISWAT, un nuovo sito sottocutaneo superiore per il trapianto di isolotto in un modello murino rispetto al fegato14. L'ISWAT contiene l'arteria epigastrica e la vena, quindi il ricco apporto di sangue può garantire la rivascolarizzazione dell'innesto delle isolotti. In questo manoscritto, proponiamo un metodo di impianto facile utilizzando un idrogel a matrice di membrana seminterrato per fissare isolotti di murini singenici nell'ISWAT. Questo protocollo si dimostra efficace per il trapianto di islet.
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Protocollo
Tutte le procedure descritte in questo protocollo hanno seguito i principi del benessere degli animali del Comitato di revisione etica dell'Ospedale del Secondo Popolo di Shenzhen. I destinatari e i donatori di innesti di isolotto erano topi maschi C57BL/6 di una settimana acquistati presso il Medical Animal Center della provincia del Guangdong. La procedura di raccolta, isolamento, coltura o somministrazione delle cellule raccolte è stata effettuata in condizioni asettiche.
1. Preparazione dell'isola
- Preparare una soluzione di lavoro di tipo G di collagenana. Pesare collagenase Tipo V e sciogliere con il buffer di D-Hank per una concentrazione finale di 1 mg/mL, filtrare utilizzando un'unità filtro a siringa da 0,22 m e una siringa da 60 mL e precool nel ghiaccio. È richiesto un volume di 5 mL per ogni donatore.
- Eutanasia un topo maschio C57BL/6 di 10 settimane (23 x 2 g) per lussazione cervicale e spruzzare la parte esterna del mouse con il 75% di etanolo per alcuni secondi. Nel frattempo, riempire una siringa da 5 mL con soluzione di collagenae e cambiare l'ago della siringa con un ago di perfusione a punta smussata (32 G).
- Mettere il topo donatore in posizione supina su una sacca di ghiaccio sotto il mirino di dissezione, tagliare un'apertura trasversale utilizzando forbici oftalmiche a punta dritta nella pelle della zona pubica e incise completamente la pelle verso la testa. Quindi aprire completamente l'addome tramite un'incisione a V dalla regione pubica al processo xifoideo.
- Esporre la cistifellea e l'intera lunghezza del dotto biliare comune riposizionando il fegato. Quindi bloccare l'apertura duodenale del dotto biliare comune con un morsetto vascolare e tagliare una piccola apertura nella cistifellea.
NOTA: Il posizionamento ottimale dell'ago è importante per prevenire il riflusso nel fegato e nella cistifellea. - Cannulare il dotto biliare comune dall'apertura della cistifellea utilizzando l'ago perfusione nel passaggio 1.2, quindi iniettare 2 mL di soluzione di collagena nel pancreas. Dopo di che, separare il pancreas perfuso dall'intestino, stomaco, e milza utilizzando due coppie di microtweezer non invasivi, e metterlo in un tubo conico 50 mL sul ghiaccio.
NOTA: ripetere il processo per tutti i topi donatori. Tre pancreas perfusi consecutivamente (non più di 40 min a parte) possono essere combinati in un tubo conico da 50 mL preriempito con soluzione di collagenasi di 3 mL per ogni pancreas. - Aggiungere 100 DNase I (10 mg/mL) per pancreas nei tubi conici da 50 mL e digerire il pancreas in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi agitando i tubi conici per 3-5 min.
NOTA: Agitare vigorosamente i tubi 40x in intervalli di 10 s per dissociare il tessuto prima della digestione nel bagno d'acqua, quindi scuotere moderatamente i tubi durante la digestione. - Aggiungere la soluzione di arresto (soluzione BSA-HBSS da 2,5 mg/mL) fino a un volume finale di 50 mL per bloccare la digestione, e centrifugare i tubi ad una velocità di 750 x g a 4 gradi centigradi e fermarsi rapidamente.
- Versare il supernatante e lavare i pellet 2x con una riassovia delicatamente di 15-25 mL di BSA-HBSS. L'impulso centrifuga recarsi al tubo con le stesse condizioni di velocità descritte al punto 1,7 per 1 min.
- Versare il supernatante e mettere in comune i pellet dei tre tubi conici in un tubo conico da 50 mL. Risospendere i pellet in un volume totale di 10 mL di itopaque-1119. Mescolare in modo omogeneo e aggiungere in sequenza 5 mL di itopaque-1077 e 5 mL di HBSS pipetting lentamente lungo il lato del tubo.
- Girare i campioni nella centrifuga a 750 x g a 4 gradi centigradi per 10 min senza freni.
- Aspirati le isole dell'interfaccia HBSS/histopaque-1077 in un tubo conico da 50 mL utilizzando una pipetta Pasteur usa e getta da 5 mL, aggiungere BSA-HBSS a un volume finale di 50 mL e centrifugare a impulsi a 750 x g a 4 gradi centigradi.
- Versare il supernatante e lavare le isole utilizzando 30 mL di BSA-HBSS. Centrifuga per 1 min a 750 x g a 4 gradi centigradi.
- Risospendere le isole utilizzando 30 mL di coltura media (10% FBS-1%P/S-CMRL-1066) per tubo e versare in un piatto di coltura leggero di 10 cm di diametro. Sotto uno stereoscopio, utilizzando 200 punte di pipet a carica gel, selezionare a mano le isole dalla soluzione in base alla loro morfologia (cioè sferoidale, bianco). Mettere in un piatto di coltura cellulare non trattata con 10 mL di mezzo di coltura.
NOTA: Un secondo handpicking può essere effettuato se la purezza delle isole prime purificate non è ottimale dopo il primo prelievo. - Controllare la purezza delle isole raccolte a mano con colorazione dithizone al microscopio luminoso e rilevare la fattibilità delle isolotti con fluoresceina diacetate (FDA)-propidium iodide (PI) colorazione al microscopio fluorescente.
- Cultura le isole isolate nel mezzo di coltura (come nel punto 1.13) in un'incubatrice a 37 gradi centigradi, 95% aria-5% CO2 prima del trapianto.
2. Trapianto di issotiera ISWAT
- Indurre il diabete nei topi Maschi Di 8 settimane C57BL/6 (22 x 2 g) con una singola iniezione di streptotototocina (ST). Il giorno -4, digiunare i topi per 4-6 h, quindi preparare una soluzione st di 0,1 M utilizzando buffer di citrato da 0,1 M (pH 4,4). Pesare, risospendere nel tampone e iniettare i topi intraperitamente ad una dose di 180 mg/kg.
NOTA: La soluzione ST deve essere preparata al momento prima dell'uso e ricoperta di lamina di alluminio a causa della sua sensibilità alla luce. Dovrebbe essere usato immediatamente, perché perderà attività entro 15-20 min. - Puntura le vene caudali dei topi iniettati da STT per raccogliere del sangue intorno alle 10 del giorno -1 e giorno 0 e misurare il livello di glucosio nel sangue non a digiuno utilizzando una striscia di prova e uno strumento di monitoraggio della glicemia di base. I topi saranno utilizzati come destinatari del trapianto di issolota se i livelli di glucosio nel sangue dei 2 giorni di prova consecutivi sono entrambi almeno 20 mmol/L.
- Il giorno 0, pesare e contrassegnare tutti i topi destinatari. Anestesizzaogni destinatario iniettando 60 mg/kg di sodio pentobarbital intraperitamente.
NOTA: Somministrare un pizzico di punta per verificare la profondità dell'anestesia. Se il topo ricevente non ha un riflesso di ritiro, il livello di anestesia è sufficiente per l'intervento chirurgico. In caso contrario, somministrare un ulteriore sodio pentobarbitale aggiuntivo di 10 mg/kg. Il sodio pentobarbitale utilizzato è stato diluito in salina fisiologica sterile alla concentrazione del 2% (m/v). - Togliere l'idrogel da un congelatore a -20 gradi e tenerlo sul ghiaccio per consentire lo scongelamento. L'idrogel è liquido a 4-10 gradi centigradi e si solidificherà ad una temperatura più elevata.
- Scegliete 450-500 equivalenti di ilettun (IEQ) per ogni ricevente in un tubo di centrifuga sterile da 1,5 mL sotto lo stereoscopio (come nel punto 1.13) con 200 - L di mezzo di coltura e tenetevi sul ghiaccio fino a quando non saranno pronti per il trapianto.
- Sampione dell'area inguinale sinistra del destinatario utilizzando il 75% di etanolo. Posizionarlo in posizione supina e fissare i quattro arti utilizzando nastro chirurgico. Rasare i capelli intorno al sito chirurgico con clipper elettrici e tamponare l'area con Iodophor.
- Fare un'incisione verticale della pelle in questa zona utilizzando le forbici oftalmiche e microtweezer non invasivi, identificare l'arteria epigastrica inferiore e la vena nell'ISWAT e creare una piccola tasca sopra i vasi.
- Girare il tubo delle isolotti per 30 s a 200 x g e rimuovere il supernatante il più possibile. Aspirate 20 -L di idrogel completamente scongelato e caricarlo nel tubo con le isole. Risospendere delicatamente le isole, evitando le bolle.
- Consegnare l'intera miscela di isolet-idrogel nel tubo nella tasca (passaggio 2,7) del recipiente con una punta di pipetta da 200 luna.
NOTA: Questo processo richiede due tecnici, uno per raccogliere i bordi della tasca utilizzando microtweezer non invasivi e l'altro per fornire la miscela di istata in tasca. - Aggiungere 20 l di cefalosporina (5-10 mg) nel sito di trapianto dopo che la miscela issottile-idrogel è completamente solidificata, quindi utilizzare una sutura chirurgica 5-0 per chiudere il muscolo e la pelle con il metodo di sutura continua.
NOTA: L'idrogel ha bisogno di circa 3 min per solidificare a causa della temperatura corporea. - Mettere il destinatario in una gabbia pulita e riscaldarsi utilizzando un cuscinetto termico. Mantenere il monitoraggio fino a quando il destinatario si riprende completamente e inizia a muoversi in modo autonomo. Quindi somministrare 0,03 mg/ml di Buprenorphina con sterile fisiologica salina intraperitonealmente, secondo 0,1 mg/kg dose.
- Ripetere i passaggi da 2,3 a 2,11 per ogni mouse destinatario.
- Misurare i livelli di glucosio nel sangue non a digiuno dei topi riceventi (come nel passaggio 2.2) 3–4x a settimana per il primo mese, e 1x a settimana dopo.
- Al termine del follow-up (100 giorni dopo il trapianto), in anestesia (effettuata come al punto 2.3) accisa l'ISWAT recante l'innesto dei destinatari seguendo le fasi sterili descritte al punto 2.6. Fissare il tessuto in formalina e paraformaldeide secondo i protocolli istologici per la colorazione ematosilia ed eosina (H&E) e immunofluorescenza di insulina e glucagone.
- Aggiungere la cefalosporina e chiudere l'incisione dei destinatari come nel punto 2.10, quindi prepararsi per il recupero come nel passaggio 2.11.
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Risultati
In questo protocollo sono introdotte due procedure: preparazione dell'isolotto murine e trapianto di isolotto nel sito ISWAT. Nella prima procedura, dopo aver perfuso e digerito con la soluzione di collagenasi di tipo V, purificando con Histopaque-1119 e Histopaque-1077 e un ulteriore passo di raccolta a mano, le isole murine isolate saranno sufficientemente pure per il trapianto (come mostrato nella Figura 1) e le isole isolate che hanno un'elevata vitalità saranno utilizzate per il trapian...
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Discussione
Il trapianto di issolota del pancreas è una terapia promettente per il trattamento del T1DM. L'effetto di questa terapia è influenzato da molti fattori e la scelta di un sito ottimale per l'impianto delle isolotto è estremamente importante. Il sito anatomico ideale per il trapianto di isolotto dovrebbe avere le seguenti caratteristiche: accessibilità per semplici procedure di trapianto, biopsia e recupero dell'innesto; complicanze ridotte; alto tasso di successo del controllo della glicemia; e la sopravvivenza a lungo te...
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Dichiarazioni
Gli autori non segnalano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Key R&D Program of China (2017YFC1103704)Fondi speciali per la costruzione di ospedali di alto livello nella provincia di Guangdong (2019), Sanming Project of Medicine a Shenzhen (S201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20229204849975, GJ-20170314171357555), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (S Scientific Research Foundation della Provincia cinese del Guangdong (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,22 μ m Unità di filtraggio azionata da siringa | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| provetta da centrifuga da 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C | |
| Pipetta Pasteur da 5 mL | JingAn Biological, Cina | J00085 | |
| Siringa da 5 mL | Szboon, Cina | 20170829 | |
| Provetta conica da 50 mL | Sutura chirurgica Corning | 430829 | |
| 5-0 | sh-Jinhuan, Cina | CR537 | |
| 60 mL siringa | Szboon, Cina | 20170623 | |
| 75% Etanolo | LIRCON, Cina | 9180527 Alexa | |
| Fluor 488 asino anti-topo IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Diluizione (1:200) |
| anti-topo Glucagone anticorpo | Abcam | ab10988 | Diluizione (1:100) |
| anti-topo insulina anticorpo | Cell Tecnologia di segnalazione | 3014s | Diluizione (1:100) |
| ago di perfusione a punta smussata | Oloey, Cina | 005 | 32G, giallo |
| BSA | Meilune, Cina | MB4219 | |
| C57BL/6 Topi | Medical Animal Center della provincia | 8~10 settimane | |
| piatto per coltura cellulare | BIOFIL, Cina | TCD000100 | generale, non trattato, diametro 87,8 mm |
| centrifuga | Thermo Scientific | ST16R | |
| cefalosporina | Lukang medical, Cina | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, Cina | CP-8000 | |
| collagenasi Tipo V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Tampone di D-hank | Coolaber, Cina | PM5140-10 | |
| ditizone | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Mezzi di colorazione eosina | Beyotime Biotech, Cina | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| diacetato di fluoresceina (FDA) | Thermo Fisher | Microscopio fluorescente F1303 | |
| Puntali per pipette caricanti | Leica | ||
| HBSS | Coolaber, Cina | ematossilina PM5150-10 | |
| Tecnologia di segnalazione cellulare | 14166S | ||
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich RNBG0536 | ||
| Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Matrice di membrana basale |
| Iodophor | LIRCON, Cina | 5190313 | |
| piatto di coltura a tenuta di luce | DVS, Cina | AN-5058548 | autocostruito, piatto di vetro spruzzato con vernice nera |
| Nastro adesivo medico | Cofoe, Cina | K12001 | |
| micropinzette non invasive | RWD Life Science | F11033-11 e F12016-15 | |
| Sistema di monitoraggio della glicemia di base One Touch ultraeasy | Johnson & Forbici | ||
| RWD Life Science | S12012-12 e S11001-08 | ||
| P/S (penicillina / streptomicina) | Gibco | 15140-122 | |
| pentobarbital sodico | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Ioduro di propidio | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (streptozotocina) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Striscia reattiva | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-coniugato Capra anti-coniglio IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Diluizione (1:200) |
| morsetto vascolare | RWD Life Science | R31006-04 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
