L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di istruire come estrarre, mantenere e dissociare le cellule di astrocite e microglia dal sistema nervoso centrale, seguite da infezione da parassiti protozoi.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Isolamento concomitante di astrociti primari e microglia per l'infezione da parassiti di Protozoi
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli astrociti e la microglia sono le cellule gliali più abbondanti. Sono responsabili del supporto fisiologico e del mantenimento dell'omeostasi nel sistema nervoso centrale (SNC). Le crescenti prove del loro coinvolgimento nel controllo delle malattie infettive giustificano l'interesse emergente per il miglioramento delle metodologie per isolare gli astrociti primari e le microglia al fine di valutare le loro risposte alle infezioni che colpiscono il SNC. Considerando l'impatto dell'infezione da Trypanosoma cruzi (T. cruzi) e Toxoplasma gondii (T. gondii) nel SNC, qui forniamo un metodo per estrarre, mantenere, dissociare e infettare gli astrociti murini e le cellule di microglia con parassiti del protozoico. Le cellule estratte dalle cortice neonatali sono mantenute in vitro per 14 giorni con sostituzione periodica dei supporti differenziali. Gli astrociti e le microglie si ottengono dallo stesso protocollo di estrazione per dissociazione meccanica. Dopo la fenotipizzazione per citometria di flusso, le cellule vengono infettate da parassiti di protozoi. Il tasso di infezione è determinato dalla microscopia a fluorescenza in diversi punti temporali, consentendo così la valutazione della capacità differenziale delle cellule gliali di controllare l'invasione e la replicazione dei protozoi. Queste tecniche rappresentano metodi semplici, economici ed efficienti per studiare le risposte di astrociti e microglia alle infezioni, aprendo il campo per ulteriori analisi della neuroimmunologia.
Introduzione
Il CNS è composto principalmente da neuroni e cellule gliali1,2,3. Microglia e astrociti sono le cellule glia più abbondanti nel SNC. La microglia, il macrofago residente, è l'immunocompetente e la cella glia fagocitica nel CNS3,4, mentre gli astrociti sono responsabili del mantenimento dell'omeostasi ed esercitano funzioni di supporto5.
Nonostante le cellule gliali siano classicamente note per essere responsabili del supporto e della protezione dei neuroni
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono i topi sono state eseguite in conformità alla legge nazionale brasiliana (11.794/2008) e approvate dai Comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università Federale di San Paolo (UNIFESP).
1. Estrazione, manutenzione e dissociazione delle cellule gliali
NOTA: Il numero di topi utilizzati per l'estrazione delle cellule gliali dipende dalla quantità di cellule necessarie per eseguire gli esperimenti desiderati. In questo protocollo, un totale di 2,7 x 107 astrociti e 4 x 106 microglia sono stati ottenuti da sei topi neoi....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Il giorno14, la coltura delle cellule gliali (Figura 1A) ha subito una dissociazione meccanica. Le popolazioni di cellule isolate sono state analizzate dalla citometria di flusso secondo i marcatori CD11b, CD45 e GFAP. Potremmo osservare una purezza dell'89,5% per la popolazione di astrociti e del 96,6% per lapopolazionedi microglia ( Figura 1B). Dopo l'isolamento, le cellule sono state placcate in una piastra piatta .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
L'importanza di studiare le funzioni isolate delle cellule gliali in contesti biologici distinti si è espansa negli ultimi due decenni. Comprendere il CNS al di là dei neuroni è ancora un campo in crescita nella biologia cellulare, soprattutto in infezioni o condizioni infiammatorie8,9,24. Le cellule gliali sono cruciali non solo per i neuroni supporto fisico (come era precedentemente noto), ma anche in molte altre situazioni fi.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il professor Renato A. Mortara dell'Università Federale di San Paolo (UNIFESP) per mAb 2C2 anti-Ssp-4. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Fundao de Amparo à Pesquisa do Estado de San Paolo (FAPESP, sovvenzione 2017/25942-0 a K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient'fico e Tecnol'gico (CNPq, 402100/2016-6 a K.R.B.), Instituto Nacional de Ciància e De Vacinas (INCTV/CNPq) e Coordenao de Aperfei-oamento de Pessoal de N'vel Superior (CAPES, Codice Finanza 001). M.P.A. riceve una borsa di studio da CNPq, A.L.O.P. riceve borse di studio da CAPES, e I.S.F e L.M.F.B. riceve borse di studio da FAPESP.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 70% Etanolo | Dinâ mica Quí mica Contemporâ nea | Gatto: 2231 | Sterilizzare |
| 75 cm2 Pallone | Corning | Cat: 430720U | Materiale plastico |
| 96 pozzetti piastra per colture cellulari | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Colture cellulari |
| Cloruro di ammonio (NH4Cl) | Dinâ mica Quí mica Contemporâ nea | Cat: C10337.01.AH | Rimuovere l'anticorpo |
| anti-GFAP | Abcam | Cat.: ab49874 | antidoby in immunofluorescenza |
| 0,22 μ mm CA | Corning | Cat: Filtro per terreno di | coltura |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Preparazione del tampone |
| CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Anticorpo per citometria a flusso |
| CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Anticorpo per citometria a flusso |
| Centrifuga | Eppendorf | Cat: 5810R | Centrifuga per centrifugazione |
| Eppendorf | 5415R | Cabina di biosicurezza per centrifugazione | |
| di classe II | Pachane | Cat: 200 | Cabina di biosicurezza per procedure sterili |
| CO2 Incubatore | ThermoScientific | Modello: 3110 | Manutenzione delle cellule primarie |
| Provette coniche 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Materiale plastico |
| Provette coniche 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Materiale plastico |
| Contatore di cellule automatizzato Countess | Invitrogen | Cat: C10281 | Contatore di cellule |
| DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | antidoby in immunofluorescenza |
| Nikon | Cat: DS-RI1 | Cattura immagini al microscopio | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Terreno di coltura cellulare |
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Preparazione del tampone |
| F12 Miscela di nutrienti | Gibco | Cat: 21700-026 | Terreno di coltura cellulare |
| FACS Canto II | BD Biosciences | Citometro a flusso indisponibile | |
| Siero fetale bovino (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | Integratore di terreno per colture cellulari |
| Flow Jo (software) | Flow Jo | Versione: Flow Jo_9.9.4 | Analisi dei dati |
| Fluorescenza intenselight | Nikon | Cat: C-HGFI | Sorgente di fluorescenza |
| GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Anticorpo per citometria a flusso |
| Capra - anti-topo IgG (FITC) | Kirkeegood& Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Antidoby in immunofluorescenza |
| HBSS - Soluzione salina bilanciata di Hank | Gibco | Cat: 14175079 | Terreno di coltura cellulare |
| HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Integratore di terreno di coltura cellulare |
| IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Fissazione cellulare per citometria a flusso |
| Microscopio invertito | Nikon | Modello: Microscopio ECLIPSE TS100 | |
| Isoflurano | Cristá lia | Cat: 21.2665 | Anestetico inalato |
| Metanolo | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fissazione per immunofluorescenza |
| Micro spatola | ABC inossidabile | Non disponibile | Materiale chirurgico |
| Microprovetta 1,5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Materiale plastico |
| Anticorpo monoclonale (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Non commerciale | Non commerciale | Pipetta multicanale antidoby in immunofluorescenza |
| (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Reagenti per pipette |
| Elementi NIS Software | Nikon | Versione 4.0 | Acquisizione e analisi delle immagini |
| Latte scremato | Nestlé | Cat: 9442405 | Soluzione bloccante per immunofluorescenza |
| Incubatore con agitatore orbitale | Modello termoscientifico | : 481 Cat: 11 | Microglia dissociata dagli astrociti |
| Paraformaldeide (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fissazione per immunofluorescenza |
| PBS | Penicillina neutra tampone non commerciale | commerciale | |
| G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Integratore di terreno per colture cellulari |
| Tampone di permeabilizzazione (10x) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Permeabilizzazione cellulare per citometria a flusso |
| Piastra di Petri 60 mm x 15 mm (monouso, sterile) | Prolab | Cat: 0303-8 | Misuratore di pH per materie plastiche |
| Kasvi | K39-1014B | Calibrare la soluzione di pH | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | Cat: 31800-014 | Terreno di coltura cellulare |
| Forbici | ABC inox | Cat: LO9-W4 | Materiale chirurgico |
| Pipetta sierologica 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Materiale plastico |
| Pipetta sierologica 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Materiale plastico |
| Pipetta a canale singolo (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Reagenti per pipette |
| Singolo Pipetta a canale (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Reagenti per pipette |
| Bicarbonato di sodio | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Integratore di terreno per colture cellulari |
| Sale di streptomicina solfato | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Integratore di terreno per colture cellulari |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilizzazione per immunofluorescenza |
| Tripsina | Gibco | Cat: 27250-018 | Pinzetta enzima digestivo |
| ABC inox | Cat: L28-P4-172 | Materiale chirurgico | |
| Bagno d'acqua | Novatecnica | Modello: 09020095 | Digerire il tessuto a 37 gradi; C con tripsina |
Riferimenti
- Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
- Herculano-Houzel, S.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
