Articolo metodologico

Rilevamento di specie di ossigeno reattive totali nelle cellule aderenti entro il 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate

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DOI:

10.3791/60682

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23 giugno 2020

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of New Mexico

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare le specie di ossigeno reattivo totale (ROS) utilizzando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Questo metodo può visualizzare la localizzazione cellulare ROS in cellule aderenti con un microscopio a fluorescenza e quantificare l'intensità ROS con un lettore di lastre di fluorescenza. Questo protocollo è semplice, efficiente e conveniente.

Abstract

Lo stress ossidativo è un evento importante sia in condizioni fisiologiche che patologiche. In questo studio, dimostriamo come quantificare lo stress ossidativo misurando le specie di ossigeno reattivo totale (ROS) utilizzando come esempio la colorazione di 2',7'-diclorohydrofluorescein (DCFH-DA). Questo protocollo descrive i passaggi dettagliati, tra cui la preparazione della soluzione DCFH-DA, l'incubazione di cellule con la soluzione DCFH-DA e la misurazione dell'intensità normalizzata. La colorazione DCFH-DA è un modo semplice ed economico per rilevare ROS nelle cellule. Può essere utilizzato per misurare la generazione di ROS dopo il trattamento chimico o le modifiche genetiche. Pertanto, è utile per determinare lo stress ossidativo cellulare sullo stress ambientale, fornendo indizi agli studi meccanicistici.

Introduzione

Tre principali specie reattive dell'ossigeno (ROS) prodotte dal metabolismo cellulare che hanno un significato fisiologico sono l'anione di superossido, il radicale idrossile e il perossido di idrogeno1. A basse concentrazioni, partecipano a processi cellulari fisiologici, ma ad alte concentrazioni hanno effetti negativi sulle vie di segnalazione cellulare1. Il nostro corpo ha sviluppato sistemi antiossidanti, che sono efficaci contro il ROS eccessivo. Tuttavia, lo stress ossidativo può verificarsi quando ROS sopraffare la capacità disintossicante del nostro corpo, che contribuisce a molte condizioni patologiche, tra cui infiammazione, cancro, e malattia neurodegenerativa2,3,4.4 Lo scopo di questo metodo è quello di determinare il ROS cellulare totale nelle cellule aderenti utilizzando la colorazione di diattato (DCFH-DA) di 2',7'-diclorodiidrofluorescein (DCFH-DA). La logica è che l'ossidazione del DCFH-DA al 2'-7'dichlorofluorescein (DCF) è stata ampiamente utilizzata per il rilevamento totale2del ROS, compresi i radicali idrossili (OH) e il biossido di azoto ( . Meccanicamente, DCFH-DA è occupato da cellule dove cellulare all'espegnimento dei fendi fuori i gruppi di acetil, con conseguente DCFH. L'ossidazione di DCFH da parte di ROS converte la molecola in DCF, che emette fluorescenza verde ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nm. Rispetto al rilevamento della fluorescenza con citometria di flusso e altri metodi alternativi5, i vantaggi di questo metodo utilizzando un microscopio a fluorescenza e un lettore di lamiere sono che produce immagini fluorescenti chiaramente visibili, ed è facile da eseguire, efficiente e conveniente. Questo metodo è stato ampiamente utilizzato per rilevare ROS cellulare per studiare varie condizioni6,7,8. Questo protocollo viene utilizzato per rilevare ros totale nelle cellule aderenti. L'utilizzo di questo metodo per rilevare ROS nelle celle delle sospensioni potrebbe richiedere alcune modifiche.

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Protocollo

1. Semina delle cellule

  1. Seme 2 x 105 cellule tumorali dell'HCT116 per bene in una piastra di 24 pozzetti e mantengono le cellule nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) durante la notte a 37 gradi centigradi.
  2. Sostituire il mezzo di coltura con o senza 100 soflfato ferroso (FS) o 10 M doxorubicin (DOX) contenente mezzo e incubare per 24 h.

2. Preparazione della soluzione DCFH-DA

  1. Sciogliere 4,85 mg di DCFH-DA in 1 mL di solforo dimetilo (DMSO) per creare una soluzione di riserva di 10 mM.
  2. Diluire la soluzione di riserva con DMEM preriscaldato in una soluzione di lavoro da 10 M proprio prima di aggiungerla ai pozzi.
  3. Vorticare la soluzione di lavoro per 10 s.

3. Colorazione DCFH-DA

  1. Rimuovere il farmaco contenente il mezzo e lavare una volta con DMEM.
  2. Aggiungere 500 gradi della soluzione di lavoro DCFH-DA in ogni pozzo e incubare a 37 gradi centigradi per 30 min.
  3. Rimuovere la soluzione di lavoro DCFH-DA. Lavare una volta con DMEM e 2x con 1x salina con buffer fosfato (PBS).
  4. Aggiungere 500 l 1x PBS ad ogni pozzo.

4. Acquisizione dell'imaging e misurazione dell'intensità

  1. Prendere immagini fluorescenti rappresentative per ogni pozzo utilizzando il canale di proteina fluorescente verde (GFP) su un microscopio a fluorescenza.
  2. Dopo aver scattato le immagini, rimuovere PBS e aggiungere a ciascun pozzo il buffer RIPA (radioimmunoprecipitazionation assay) da 200 l.
  3. Incubare sul ghiaccio per 5 min, quindi raccogliere illisato cellulare in tubi da 1,5 mL.
  4. Centrifuga a 21.130 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
  5. Trasferire 100 l del supernatante su una piastra nera di 96 pozze e misurare l'intensità della fluorescenza utilizzando una fluorescenza un lettore di microplacia ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nm.
  6. Trasferire 1 ll del supernatante su una piastra chiara 96 pozzo contenente 100 .L of 1x soluzione di prova proteica per misurare la concentrazione di proteine utilizzando il saggio Bradford9.
  7. Normalizzare le intensità di fluorescenza con concentrazioni proteiche.

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Risultati

Le cellule tumorali del colon-retto HCT116 sono state trattate con 100 FS o 10 -M DOX per indurre lo stress ossidativo7. Come mostrato nella Figura 1, la fluorescenza verde è stata drammaticamente aumentata sia da FS che da DOX come previsto. Per quantificare il cambiamento di intensità relativo, le cellule sono state lismilate dopo l'assunzione di immagini e normalizzate con concentrazioni di proteine. L'intensità quantificata della fluorescenza è stata significativa...

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Discussione

Il protocollo sperimentale qui descritto è facilmente riproducibile per misurare il ROS totale cellulare. I passaggi critici includono la creazione di soluzioni DCFH-DA fresche ed evitando l'esposizione alla luce, la riduzione al minimo dei disturbi dello stato delle cellule e l'ampio lavaggio PBS prima di scattare le immagini. Per la preparazione della soluzione di lavoro DCFH-DA, la soluzione di stock deve essere aggiunta nel DMEM preriscaldato subito prima di aggiungerla alla piastra 24. Il motivo è che le vecchie sol...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto in parte dai National Institutes of Health (K01DK114390), un sussidio di ricerca dell'American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), una sovvenzione per il progetto di progetto pilota di ricerca University of New Mexico Environmental Health Signature Program and Superfund (P42 ES025589), un Shared Resources Pilot Project Award e un Research Program Support Pilot Project Award del centro oncologico globale UNM (P30CA118100) , e un nuovo premio ricercatore dal Dedicated Health Research Funds presso la Scuola di Medicina dell'Università del Nuovo Messico.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2',7'-diclorofluoresceina diacetatoCayman Chemical, Ann Arbor, MI20656
Doxorubicina cloridratoTCI America, Portland, ORD4193-25MG
Dulbecco's Modified Eagle Medium Corning, Corning, NY45000-304
Solfato ferroso eptaidratoVWR, Radnor, PA97061-542
Invitrogen EVOS FL Auto Imaging SystemThermo Fisher Scientific Waltham, MAAMAFD1000o qualsiasi altro microscopio a fluorescenza
Saggio delle proteine Soluzione BradfordBio-Rad, Hercules, CA5000001
SpectraMax M2 Lettore di micropiastreMolecular Devices, Radnor, PA89429-532o qualsiasi altro lettore di micropiastre a fluorescenza

Riferimenti

  1. Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).
  2. Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).
  3. Sullivan, L. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer & Metabolism. 2, 17(2014).
  4. Formentini, L., et al. Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization. Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).
  5. Rakotoarisoa, M., et al. Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells. ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).
  6. Mateen, S., et al. Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis. PLoS One. 11 (4), (2016).
  7. Kim, H., et al. The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth. Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).
  8. Wang, S. H., et al. Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235(2018).
  9. Kruger, N. J. The Bradford Method For Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-24 (2009).
  10. Tetz, L. M., et al. Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).
  11. Rong, L., et al. Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues. Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).
  12. Liu, L. Z., et al. Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).

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Colorazione con DCFH DAmicroscopia a fluorescenzalettore di piastre a fluorescenzacellule HCT116stress ossidativonormalizzazione proteicatrattamento con solfato ferrosotrattamento con doxorubicinalavaggio con PBS

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