Rilevamento di specie di ossigeno reattive totali nelle cellule aderenti entro il 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare le specie di ossigeno reattivo totale (ROS) utilizzando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Questo metodo può visualizzare la localizzazione cellulare ROS in cellule aderenti con un microscopio a fluorescenza e quantificare l'intensità ROS con un lettore di lastre di fluorescenza. Questo protocollo è semplice, efficiente e conveniente.

Abstract

Lo stress ossidativo è un evento importante sia in condizioni fisiologiche che patologiche. In questo studio, dimostriamo come quantificare lo stress ossidativo misurando le specie di ossigeno reattivo totale (ROS) utilizzando come esempio la colorazione di 2',7'-diclorohydrofluorescein (DCFH-DA). Questo protocollo descrive i passaggi dettagliati, tra cui la preparazione della soluzione DCFH-DA, l'incubazione di cellule con la soluzione DCFH-DA e la misurazione dell'intensità normalizzata. La colorazione DCFH-DA è un modo semplice ed economico per rilevare ROS nelle cellule. Può essere utilizzato per misurare la generazione di ROS dopo il trattamento chimico o le modifiche genetiche. Pertanto, è utile per determinare lo stress ossidativo cellulare sullo stress ambientale, fornendo indizi agli studi meccanicistici.

Introduzione

Tre principali specie reattive dell'ossigeno (ROS) prodotte dal metabolismo cellulare che hanno un significato fisiologico sono l'anione di superossido, il radicale idrossile e il perossido di idrogeno¹. A basse concentrazioni, partecipano a processi cellulari fisiologici, ma ad alte concentrazioni hanno effetti negativi sulle vie di segnalazione cellulare¹. Il nostro corpo ha sviluppato sistemi antiossidanti, che sono efficaci contro il ROS eccessivo. Tuttavia, lo stress ossidativo può verificarsi quando ROS sopraffare la capacità disintossicante del nostro corpo, che contribuisce a molte condizioni patologiche, tra cui....

Protocollo

1. Semina delle cellule

1. Seme 2 x 10^{5 cellule} tumorali dell'HCT116 per bene in una piastra di 24 pozzetti e mantengono le cellule nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) durante la notte a 37 gradi centigradi.
2. Sostituire il mezzo di coltura con o senza 100 soflfato ferroso (FS) o 10 M doxorubicin (DOX) contenente mezzo e incubare per 24 h.

2. Preparazione della soluzione DCFH-DA

1. Sciogliere 4,85 mg di DCFH-DA in 1 mL di solforo dimetilo (DMSO) per creare una soluzione di riserva di 10 mM.
2. Diluire la soluzione di riserva con DMEM preriscaldato in una soluzione di lavoro da 10 M pro....

Risultati

Le cellule tumorali del colon-retto HCT116 sono state trattate con 100 FS o 10 -M DOX per indurre lo stress ossidativo⁷. Come mostrato nella Figura 1, la fluorescenza verde è stata drammaticamente aumentata sia da FS che da DOX come previsto. Per quantificare il cambiamento di intensità relativo, le cellule sono state lismilate dopo l'assunzione di immagini e normalizzate con concentrazioni di proteine. L'intensità quantificata della fluorescenza è stata significativa.......

Discussione

Il protocollo sperimentale qui descritto è facilmente riproducibile per misurare il ROS totale cellulare. I passaggi critici includono la creazione di soluzioni DCFH-DA fresche ed evitando l'esposizione alla luce, la riduzione al minimo dei disturbi dello stato delle cellule e l'ampio lavaggio PBS prima di scattare le immagini. Per la preparazione della soluzione di lavoro DCFH-DA, la soluzione di stock deve essere aggiunta nel DMEM preriscaldato subito prima di aggiungerla alla piastra 24. Il motivo è che le vecchie sol.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2',7'-diclorofluoresceina diacetato	Cayman Chemical, Ann Arbor, MI	20656
Doxorubicina cloridrato	TCI America, Portland, OR	D4193-25MG
Dulbecco's Modified Eagle Medium Corning	, Corning, NY	45000-304
Solfato ferroso eptaidrato	VWR, Radnor, PA	97061-542
Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System	Thermo Fisher Scientific Waltham, MA	AMAFD1000	o qualsiasi altro microscopio a fluorescenza
Saggio delle proteine Soluzione Bradford	Bio-Rad, Hercules, CA	5000001
SpectraMax M2 Lettore di micropiastre	Molecular Devices, Radnor, PA	89429-532	o qualsiasi altro lettore di micropiastre a fluorescenza