Uso combinato dei saggi di metastasi della vena della coda e dell'imaging in vivo in tempo reale per quantificare la colonizzazione metastatica del cancro al seno e il carico nei polmoni

Il cancro rimane la seconda causa di morte in tutto il mondo¹ e la metastasi è responsabile della maggior parte di questi decessi^2,3. Tuttavia, una comprensione limitata dei meccanismi molecolari che governano la colonizzazione metastatica e la successiva crescita ha ostacolato lo sviluppo di trattamenti efficaci per la malattia metastatica. L'identificazione di nuovi obiettivi terapeutici richiede un saggio per testare come l'espressione o la funzione perturbata di un gene candidato influenzi la formazione e la crescita delle metastasi. Sebbene i modelli di mouse autoctonomi abbiano i loro vantaggi, richiedono molto tempo e sono costosi da generare, il che li rende più adatti per la convalida degli obiettivi piuttosto che per l'individuazione della destinazione. I sistemi modello di trapianto in cui il gene candidato è perturbato nelle cellule tumorali in vitro e quindi gli effetti sul potenziale metastatico sono valutati in vivo, sono meno costosi e una maggiore produttività rispetto ai modelli autoctoni. Inoltre, sono ampiamente disponibili vettori virali per la consegna stabile di RNAi, CRISPR/CAS9 e transgene, il che rende relativamente facile perturbare praticamente qualsiasi gene o gene di interesse in linee cellulari tumorali. Questo approccio può essere utilizzato anche per esaminare il ruolo dei geni candidati nella colonizzazione metastatica e nella crescita delle linee cellulari del cancro umano trapiantando le cellule in topi immunocompromessi o umorizzati.

I due tipi di saggi utilizzati per testare la formazione di metastasi da cellule tumorali trapiantate in vivo sono saggi di metastasi spontanei e saggi di metastasi sperimentali. Nei saggi di metastasi spontanea^4,5, le cellule tumorali vengono iniettate nei topi, permesso di formare un tumore primario, e quindi la formazione spontanea di metastasi e la crescita successiva sono formulati. La forza di questo modello è che le cellule devono completare tutte le fasi del processo metastatico al fine di formare tumori metastatici. Tuttavia, molte linee cellulari tumorali non metastatizzano in modo efficiente nei modelli di metastasi spontanee, e qualsiasi manipolazione delle cellule che colpisce la crescita primaria del tumore può confondere i risultati del saggio di metastasi. I saggi sperimentali di metastasi, in cui le cellule tumorali vengono iniettate direttamente nella circolazione, vengono utilizzati per evitare queste insidie. I più saggi di metastasi sperimentale comuni includono l'iniezione della^venadella coda⁶,^7,8 (e qui riportata), l'iniezione intracardiaca⁹e l'iniezione di vena del portale¹⁰.

Lo scopo del protocollo qui presentato è quello di fornire un test di metastasi sperimentale in vivo che consente a un ricercatore di monitorare la formazione e la crescita delle metastasi in tempo reale, nonché di quantificare il numero e le dimensioni della metastasi del punto finale nei polmoni dello stesso topo. Per raggiungere questo obiettivo, i tradizionali saggi sperimentali della vena della coda^6,7,8 sono combinati con l'imaging animale vivo, utilizzando un dispositivo di imaging in vivo^{9,11,12,13,14}. Le cellule tumorali che esprimono stabilmente sia la luciferasi che una proteina fluorescente vengono iniettate nei topi attraverso la vena laterale della coda e quindi il dispositivo di imaging in vivo viene utilizzato per misurare i cambiamenti nel carico metastatico nei polmoni nel tempo (Figura 1). Tuttavia, il dispositivo di imaging animale vivo in vivo non può distinguere o misurare le dimensioni delle singole metastasi. Così, alla fine dell'esperimento, uno stereomicroscopio fluorescente viene utilizzato per contare il numero e misurare la dimensione delle metastasi fluorescenti nei polmoni senza la necessità di sezionamento e istologia o immunohistochimica (Figura 1). Questo protocollo può essere utilizzato per testare come alterare l'espressione o la funzione di un gene candidato influenzi la formazione e la crescita delle metastasi. Possono essere testati anche potenziali composti terapeutici come piccole molecole o anticorpi di blocco delle funzioni.

Per dimostrare questo approccio, abbiamo prima eseguito un esperimento proof of concept in cui il fattore di replicazione essenziale, la proteina di replicazione A3 (RPA3) viene abbattuta nelle cellule metastatiche del cancro al seno del topo. Mostriamo che i topi iniettati con cellule knockdown RPA3 hanno significativamente meno carico metastatico ad ogni punto di tempo rispetto ai topi iniettati con cellule di controllo. L'analisi dei polmoni contenenti metastasi mostra che questo ridotto carico metastatico è il risultato di una colonizzazione metastatica significativamente ridotta e di una crescita compromessa delle metastasi che si formano. Per dimostrare ulteriormente questa tecnica, abbiamo testato se la composizione simultanea di proteine associate AYes (YAP) e co-attivatore trascrizionale con un motivo legante PD (TA) non compromette la colonizzazione metastatica o la crescita successiva. YAP e TAÀ sono due co-attivatori trascrizionali correlati che sono gli effetti a valle critici del Sentiero Ippopotamo. Abbiamo^15,16 e altri hanno implicato YAP e TAz in metastasi (recensito in^17,18,19), suggerendo che queste proteine sono buoni obiettivi terapeutici. Coerentemente, abbiamo scoperto che i topi iniettati con cellule knockdown YAP/TAz avevano significativamente ridotto l'onere metastatico. L'analisi dei polmoni ha mostrato che le cellule knockdown YAP/TAz formavano molte meno metastasi e che le metastasi che si formavano erano più piccole. Questi esperimenti dimostrano come i saggi sperimentali di metastasi consentano a un ricercatore di testare in modo rapido ed economico il ruolo di un gene candidato nella formazione e nella crescita delle metastasi. Essi mostrano inoltre come l'uso combinato di imaging animale vivo e quantificazione fluorescente di metastasi in polmoni interi permette al ricercatore di comprendere meglio i passi durante la colonizzazione metastatica.

Questo protocollo prevede l'uso di topi e materiali biopericolosi e richiede l'approvazione da parte dei comitati di sicurezza istituzionali appropriati. Tutto il lavoro in vivo qui descritto è approvato dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Albany Medical College (IACUC).

NOTA: per una panoramica del protocollo, vedere schematico nella Figura 1.

1. Imballaggio di tutti i retrovirus richiesti e lentivirus

NOTA: Il protocollo descritto utilizza vettori lentivirali o retrovirali per esprimere stabilmente un enzima luciferasi e proteine fluorescenti e per manipolare l'espressione di un gene candidato. Questi virus sono confezionati nelle cellule HEK-293FT come descritto di seguito.

1. Giorno 1: Piastra HEK-293FT cellule su piastre 6-pozze in 2 mL di supporti di crescita completa (10% FBS in DMEM con 1% penicillina / streptomicina e 2 mM L-Glutamine) in modo che siano 40-60% confluenti il giorno 2. Incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO₂ durante la notte.
2. Giorno 2: Per ogni vettore virale da confezionare, trasfecare un pozzo confluente 40-60% di cellule HEK-293FT con il vettore retrovirale o lentivirale e i vettori appropriati che codificano il cappotto virale e le proteine di imballaggio.
   NOTA: questo protocollo utilizza VSVG come proteina del mantello, psPAX2 per l'imballaggio lentivirale e gag-pol per l'imballaggio retrovirale (vedere Tabella supplementare 1 per l'elenco vettoriale).
3. Fare una miscela di co-trasfezione per ogni bene come segue:
   1. Unire 4 ll di soluzione lipidica per le trafettitte (vedi Tabella dei Materiali)e 96 l di tampone di trasfezione e incubare per 5 minuti.
   2. Aggiungete 1 g di vettore virale, 0,5 g di vettore proteico del mantello (VSVG) e 0,5 g di vettore proteico di imballaggio (psPAX2 o gag-pol) e incubate per 20 minuti.
   3. Aggiungere delicatamente la miscela di co-trasfezione dal passo 1.3.2 alle cellule HEK-293FT placcate al punto 1.1 e incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO₂ durante la notte.
4. Giorno 3: Rimuovere il supporto che contiene la trasfezione da ogni pozzo e aggiungere delicatamente 2 mL di supporti di crescita completa ad ogni pozzo. Incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO₂ per circa 24 ore.
5. Giorno 4: Raccogliere il supernatante virale da ogni pozzo utilizzando una siringa da 3 mL e filtrare attraverso un filtro 0,45 m in un tubo di microcentrismo da 2 mL.
6. Facoltativo: se si desidera la raccolta di un secondo lotto di virus, aggiungere delicatamente 2 mL di supporti di crescita completa a ciascun pozzo e incubare a 37 C, 5% CO₂ per circa 24 ore.
7. Giorno 5 (facoltativo): Raccogliere un secondo ciclo di supernatali virali come nel passaggio 1.5.
   NOTA: Il protocollo può essere sospeso congelando il supernnatale virale.

2. Generazione di cellule tumorali che esprimono stabilmente luciferasi e una proteina fluorescente

NOTA: Il seguente protocollo descrive come etichettare in modo stabile le cellule 4T1 con luciferasi di lucciole e una proteina fluorescente (verde) utilizzando due vettori con geni di selezione unici. Quindi un vettore virale 3^rd viene utilizzato per manipolare l'espressione di un gene candidato. Tuttavia, i vettori virali che forniscono contemporaneamente una proteina fluorescente e una manipolazione genetica possono anche essere utilizzati come alternativa (come negli esperimenti rappresentativi riportati di seguito). Altre cellule tumorali possono essere utilizzate, ma i numeri delle cellule devono essere ottimizzati per i passi 2.1 e 2.7.1.

1. Piastra 4T1 cellule a 1,5 x 10⁵ cellule / bene in una piastra di 12 pozzetti in mezzi di crescita completa (10% FBS in DMEM con 1% penicillina / streptomicina e 2 mM L-Glutamine) e incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO₂ durante la notte.
2. Infettare le cellule 4T1 con il supernante virale generato nel passaggio 1 come segue.
   1. Aspirare i mezzi di crescita dalle cellule e aggiungere 500 -L di lucidferase supernnatante virale e 500 .L di proteina fluorescente supernatant virale per infettare contemporaneamente le cellule sia con i supernatanti virali luciferasi che proteici fluorescenti.
   2. Aggiungere 1 -L di bromuro di esadimetingia 8 mg/mL (vedere Tabella dei materiali).
   3. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi, 5% fino al 75-90% di confluenti (tipicamente 24-48 ore).
3. Provare le cellule 4T1 con 500 litri di trypsin per 2-5 minuti (le cellule dovrebbero risciacquare liberamente dal fondo del pozzo). Trasferire tutte le cellule in un piatto di 6 cm in 4 mL di mezzi di selezione (mezzi di crescita completi contenenti gli antibiotici appropriati) discando così la trypsin. Piatto di 6 cm di cellule di controllo non infette nello stesso supporto di selezione.
   NOTA: L'adeguata concentrazione antibiotica deve essere determinata in anticipo testando diverse dosi. Inoltre, lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza può essere utilizzato anche per selezionare le cellule con etichetta fluorescente al posto della selezione del farmaco.
4. Incubare le cellule a 37 , 5% DI CO₂ nei mezzi di selezione e dividere le cellule quando necessario fino a quando tutte le cellule di controllo non infette sono morte (a seconda del gene di selezione e della linea cellulare).
5. Verificare che le cellule 4T1 infette eseprimano la proteina fluorescente verde utilizzando un filtro di eccitazione verde (450-490 nm)/emissione (500-550 nm) impostato su un microscopio fluorescente invertito a ingrandimento 50-100x.
6. Confermare che le cellule 4T1 infette stanno esprimendo luciferasi utilizzando un kit di attività luciferasi disponibile in commercio come segue.
   1. Utilizzare un volume minimo di 1x buffer di lisi passiva per lussuriare le cellule 4T1 che esprimono luciferasi e controllare le cellule 4T1 che non esprimono luciferasi, agitando delicatamente per 30 minuti.
   2. Aggiungete 20 lunatici a una piastra bianca-inferiore 96-well e poi 50 l del dicono luciferate reagente dal kit di attività luciferasi.
   3. Utilizzare un lettore di lastre per misurare la luminescenza delle cellule a tutte le lunghezze d'onda dello spettro utilizzando l'impostazione della luminescenza.
      NOTA: il protocollo può essere sospeso bloccando le cellule trasdotte in modo stabile.
7. Manipolare l'espressione del gene candidato come segue:
   1. Piastra 6 x 10⁵ etichettata 4T1 cellule dal passo 2.6 su un piatto 60 mm in 4 mL di mezzi di crescita completa e incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO₂ durante la notte.
   2. Aspirare i media di crescita da ogni pozzo e aggiungere 2 mL di supporti di crescita completa contenenti 4 -L di bromuro di esadimetina 8 mg/mL.
   3. Aggiungere 2 mL di supernatante virale dal punto 1 alle cellule placcate dal passo 2.7.2 e incubare a 37 c, 5% CO₂ durante la notte.
   4. Provare le cellule 4T1 con 500 litri di trypsin per 2-5 minuti (le cellule dovrebbero risciacquare liberamente dal fondo del pozzo). Trasferire tutte le cellule in un piatto di 10 cm in 10 mL di supporti di selezione (mezzi di crescita completi contenenti gli antibiotici appropriati) placando così la trypsin. Piastrare alcuni controlli non infetti etichettato 4T1 cellule nello stesso supporto di selezione.
   5. Incubare le cellule a 37 , 5% DI CO₂ nei mezzi di selezione e dividere le cellule quando necessario fino a quando tutte le cellule non infette sono morte.
   6. Confermare che l'espressione del gene candidato viene alterata utilizzando un approccio standard come la macchia occidentale²⁰ o qPCR²¹.
   7. La luminescenza e la fluorescenza del saggio come nei passaggi 2.5-2.6 per determinare quanto siano simili nelle cellule di controllo e knockdown, in quanto questo può cambiare (vedi Discussione).
      NOTA: il protocollo può essere sospeso bloccando le cellule trasdotte in modo stabile.

3. Ottimizzazione del progetto sperimentale in vivo

1. Ottimizzare il numero di cella appropriato e la durata dell'esperimento per l'onere metastatico desiderato come segue.
   1. Espandere le cellule 4T1 fluorescenti e bioluminescenti dal punto 2.6 in un supporto a crescita completa in modo che le cellule in eccesso siano disponibili nel giorno di iniezione desiderato.
   2. Preparare le cellule per le iniezioni di vena della coda come descritto al punto 4.2. Per determinare il numero di cellulare ottimale per le iniezioni, risospendere le cellule a diverse concentrazioni in 100 - L di 1x PBS.
      NOTA: Si consiglia di testare un intervallo di numeri di cella / mouse da 25.000 fino a 500.000.
   3. Mantenere le sospensioni cellulari sul ghiaccio fino all'iniezione.
   4. Iniettare ogni diluizione di cellule 4T1 dal passaggio 3.1.2 in 3-4 topi attraverso la vena posteriore della coda descritta nel passaggio 4.3 (vedi sotto).
   5. Riportare il mouse alla gabbia e monitorare per 15 minuti per garantire un recupero completo. I topi devono essere controllati per i segni di dolore o angoscia 3volte.
   6. Monitorare i mouse per la formazione e la crescita di metastasi per 3-6 settimane (linea cellulare e pressione del topo dipendente) utilizzando un dispositivo di imaging animale vivo in vivo (vedere i passaggi 5 e 6).
      1. I topi eutanasi 3-6 settimane dopo l'iniezione della vena della coda secondo le linee guida istituzionali standard.
      2. Preparare i polmoni e valutare la dimensione e il numero della metastasi descritti al punto 7.
      3. Scegliere il periodo di tempo appropriato per la crescita delle metastasi per l'onere metastatico desiderato (vedere discussione).

4. Iniezione della vena della coda di cellule tumorali etichettate

NOTA: Il passaggio 4.2.4 è stato ottimizzato per le cellule 4T1 che crescono nei topi sinogenici BALB/c. Se vengono utilizzate altre linee cellulari tumorali e ceppi di topo, il numero di cellule iniettate e la lunghezza del saggio devono prima essere ottimizzate.

1. Espandere le linee cellulari 4T1 generate nel punto 2 su due piatti da 15 cm in supporti di crescita completa in modo che le cellule in eccesso siano disponibili il giorno dell'iniezione.
2. Preparare le cellule per l'iniezione della vena della coda come segue:
   1. Aspirati il supporto e risciacquare le piastre delle cellule con 1x PBS.
   2. Provare le cellule con 5 mL di trypsin per 15 cm piastra per 2-5 minuti (le cellule dovrebbero risciacquare liberamente il fondo del pozzo). Trasferire tutte le cellule in un tubo conico. Lavare le cellule rimanenti dal piatto di coltura dei tessuti con un supporto di crescita sufficientemente completo per placare la prova e aggiungere il lavaggio allo stesso tubo conico.
   3. Contare le celle utilizzando un contatore cellulare automatizzato per determinare il numero totale di celle.
   4. Centrifugare le cellule a 122 x g per 3 minuti, aspirare il super-natante, e riutilizzare le cellule in 1x PBS alla concentrazione desiderata. Qui, 2,5 x 10⁴ celle vengono iniettate in ogni topo in 100 : L di PBS, quindi le celle di resospendio a 2,5 x 10⁵ celle / mL. Mantenere le sospensioni cellulari sul ghiaccio fino all'iniezione.
      NOTA: è importante limitare il tempo tra la ripsinizzazione delle cellule e l'iniezione della vena della coda a circa 1 ora.
3. Iniettare 4T1 cellule dal passo 4.2.5 nei topi attraverso la vena posteriore della coda come segue:
   1. Lavorando in un cappuccio presso l'impianto animale, mescolare delicatamente ma accuratamente le cellule invertendo il tubo o utilizzando una siringa da 1 mL per garantire che vengano risospese uniformemente. Assicurarsi sempre che le celle siano risospese prima di caricare la siringa.
   2. Caricare una siringa Luer-lock da 1 mL con sospensioni cellulari ed espellere le bolle d'aria in eccesso. Posizionare un ago da 1/2 pollice e 30 calibro sulla siringa con la smussatura in su ed espellere le bolle d'aria.
   3. Posizionare delicatamente il mouse in un ristrainer per roditori.
   4. Le vene laterali della coda devono essere visibili e dilatate. In caso contrario, pizzicare delicatamente la base della coda e immergere la coda in acqua calda del rubinetto per dilatare le vene.
      NOTA: La dilatazione delle vene può essere ottenuta anche posizionando la gabbia del mouse sotto una lampada di riscaldamento e/o sopra una piastra di riscaldamento.
   5. Utilizzare una salvietta alcolica per pulire la coda. Inserire l'ago nella vena posteriore, smussare il lato verso l'alto e iniettare 100 l of una sospensione cellulare.
      NOTA: Se l'ago è inserito correttamente nella vena, dovrebbe facilmente scivolare leggermente avanti e indietro, e non ci dovrebbe essere resistenza quando lo stantuffo viene spinto. Iniezioni riuscite dovrebbero anche provocare un "flush" in cui il colore blu della vena diventa bianco per alcuni secondi dopo l'iniezione.
4. Rimuovere lentamente l'ago e utilizzando una garza sterile, applicare la pressione al sito di iniezione per fermare qualsiasi sanguinamento.
5. Riportare il mouse alla gabbia e monitorare per 15 minuti per garantire il pieno recupero. I topi devono essere controllati per i segni di dolore o angoscia 3volte.
6. Monitorare i mouse per la formazione e la crescita di metastasi per 3-6 settimane (linea cellulare e pressione del topo dipendente) utilizzando un dispositivo di imaging animale vivo in vivo (vedere i passaggi 5 e 6).

5. Monitoraggio del carico metastatico mediante fluorescenza con un dispositivo di imaging animale vivo in vivo

NOTA: Non immagine animale per la fluorescenza con segnale luminescente attivo.

1. Se si fa solo l'imaging della bioluminescenza, andare al passaggio 6.
2. Accendere il dispositivo di imaging animale vivo in vivo.
3. Impostare il sistema di anestesia per l'imaging animale vivo in vivo secondo le linee guida del produttore per fornire tra l'1,5% e il 2% dell'isoflurane alla camera di anestesia e alla camera di imaging.
4. Anestesizza i topi con metastasi fluorescenti del passaggio 4 posizionandoli in una camera di anestesia e consegnando l'isoflurane 1,5-2,5%.
5. Aprire il software di immagine (vedere Tabella dei materiali)e accedere.
6. Fare clic sul pulsante Inizializza e attendere l'inizializzazione del computer.
7. Modificare il campo di visualizzazione in D.
   NOTA: Il campo di vista C può essere utilizzato anche se è necessaria una visione più ravvicinata di un mouse, ma questo limita il numero di mouse che possono essere visualizzati contemporaneamente.
8. Una volta che il software ha indicato che la fotocamera ha raggiunto la temperatura appropriata, fare clic sul pulsante Imaging Wizard, scegliere Fluorescenza e quindi scegliere la coppia di filtri appropriata dal menu a discesa.
   NOTA: Se il fluoroforo utilizzato non è un'opzione, scegliere Input EX/EM e digitare l'eccitazione e l'emissione necessarie.
9. Posizionare il mouse nella camera come descritto al punto 3.2.4.
10. Fare clic su Acquisisci sequenza.
11. Dopo l'imaging, riportare il mouse alla sua gabbia e monitorare per 15 minuti per garantire il pieno recupero.
12. Ripetere il passaggio 5.2 e i passaggi 5.7-5.9 con almeno un mouse che non contiene metastasi. NOTA: Questo mouse verrà utilizzato per quantificare e sottrarre il segnale di fondo durante l'analisi (passaggio 8).
13. Immagine 2-3 volte settimanale per la durata dell'esperimento.

6. Monitoraggio del carico metastatico dalla bioluminescenza con un dispositivo di imaging animale vivo in vivo

1. Accendere il dispositivo di imaging animale vivo in vivo e impostare il programma come segue.
   1. Aprire il software di immagine (vedere Tabella dei materiali)e accedere. Fare clic sul pulsante Inizializza e attendere l'inizializzazione del computer. Modificare il campo di visualizzazione in D.
      NOTA: Il campo di vista C può essere utilizzato per una visione più ravvicinata per l'immagine del corpo completo del mouse; tuttavia, questo limita il numero di topi che possono essere immagine contemporaneamente.
   2. Per il primo utilizzo, modificare le impostazioni di esposizione come segue: fare clic su Modifica Proprietà Preferences (Preferenze) Acquisizione . Esposizione automatica e modificare il tempo massimo di esposizione dal valore predefinito 60 secondi a 300 secondi e fare clic su OK.
      NOTA: non modificare altri parametri nella scheda Esposizione automatica.
2. Impostare il sistema di anestesia secondo le linee guida del produttore per fornire tra l'1,5% e il 2% di isoflurane alla camera di anestesia e alla camera di imaging.
3. Assicurarsi che la telecamera abbia raggiunto la temperatura appropriata prima di procedere al passaggio 6.4.
4. Anestesizzai topi contenenti metastasi dal punto 4 posizionandoli in una camera di anestesia e erogare 1,5-2,5% di isoflurane.
5. Preparare i topi per l'imaging della bioluminescenza come segue.
   1. Caricare una siringa da 1 mL con D-lucidferin (30 mg/mL in D-PBS) e quindi aggiungere un ago da 1/2 pollice da 30 gauge alla siringa ed espellere le bolle d'aria.
   2. Misurare e registrare la massa del topo anestesizzato.
   3. Restringere il mouse pizzicando la foratura del collo usando il pollice e le dita del puntatore e afferrando la coda tra il mignolo e la base della mano. Invertire il mouse con un angolo di 45 gradi, con la testa rivolta verso il basso.
   4. Inserire l'ago, smussare il lato verso l'alto, nello spazio intraperitoneale (IP) del lato sinistro del mouse. Confermare l'ingresso nello spazio IP ritirando un piccolo volume. Non ci dovrebbe essere colore alla base dell'ago quando si disegna indietro nello spazio IP.
   5. Iniettare il volume appropriato di D-luciferin per una dose di 150 mg/kg.
   6. Subito dopo la somministrazione D-luciferin, avviare un timer e posizionare il mouse piatto sulla schiena nel dispositivo di imaging con il naso nel cono del naso e assicurarsi che 1.5-2.5% isoflurane viene somministrato. Posizionare i divisori tra ogni mouse se si rilevano più topi. Assicurarsi che i topi siano posizionati il più piatti possibile (cioè non appoggiati su un lato).
   7. Fare clic sulle caselle Luminescent e Photograph , quindi scegliere Acquisisci nel Pannello di controllo Acquisizione.
6. Acquisire continuamente immagini bioluminescenti fino a raggiungere il segnale di picco e utilizzare l'immagine con il segnale bioluminescente di picco per l'analisi.
7. Dopo l'imaging, riportare il mouse alla sua gabbia e monitorare per 15 minuti per garantire il pieno recupero.
8. Immagine 2-3 volte settimanale per la durata dell'esperimento.

7. Quantificazione del numero e delle dimensioni delle metastasi

NOTA: Il periodo di tempo in cui le metastasi possono crescere deve essere determinato per ogni linea cellulare e sforzo del topo e sarà influenzato dal numero di cellule iniettate.

1. Eutanasia i topi secondo le linee guida istituzionali standard.
2. Isolare e rimuovere i polmoni da ogni topo e risciacquare in 1x PBS per rimuovere il sangue in eccesso.
3. Separare delicatamente i polmoni in lobi.
4. Acquisire immagini di metastasi verdi nei lobi a 10volte in campo luminoso e fluorescenza utilizzando uno stereoscopio fluorescente con un filtro a banda larga GFP (eccitazione 470/40x).
   NOTA: mantenere lo stesso ingrandimento e la stessa luminosità per tutti i campioni. L'ingrandimento utilizzato può variare a seconda delle dimensioni, del numero e della luminosità delle metastasi, nonché del campo visivo per il microscopio utilizzato.
5. Utilizzare il software di analisi delle immagini per quantificare le dimensioni e il numero di metastasi dalle immagini.
   NOTA: Il protocollo per l'analisi delle immagini dipende dal software e può essere ottimizzato con i tumori del passaggio 3. In alternativa, contare manualmente il numero di metastasi in ogni polmone utilizzando lo stereoscopio fluorescente. Protocollo può essere messo in pausa qui e il passaggio 8 può essere fatto in qualsiasi momento dopo che tutte le immagini in vivo sono state raccolte.

8. Elaborazione e analisi dei dati delle immagini acquisite con il dispositivo di imaging animale in vivo in vivo

1. Aprire tutti i file di immagine per ogni mouse nel software di immagine.
   NOTA: Utilizzare l'immagine con il segnale bioluminescente di picco per l'analisi
2. Assicurarsi che le unità siano in Radianza per i dati bioluminescenti e l'efficienza per i dati fluorescenti facendo clic sulla freccia in alto a sinistra della finestra dell'immagine e modificandola nell'unità appropriata.
3. Utilizzare l'immagine dall'ultimo timepoint per creare un'area di interesse (ROI) come segue.
   1. Fare clic su Strumenti ROI nella finestra Tavolozza strumenti. Inserire un ROI facendo clic sulla freccia e selezionando 1.
   2. Fare clic sul bordo del ROI e spostarlo sul petto del mouse. Regolare la dimensione del ROI in modo che copra il torace del mouse e non escluda il segnale.
4. Fare clic su ROI di misura e copiare o digitare il numero non elaborato in un foglio di Excel.
   NOTA: Per i dati bioluminescenti selezionare il flusso totale (fotoni/secondo), che è la somma di tutta la luminosità nel ROI. Poiché le metastasi non crescono necessariamente in modo uniforme, il flusso totale è preferito rispetto alla radioance media perché misura la somma dell'onere metastatico. Analogamente, per i dati fluorescenti, la percentuale di efficienza totale (luce di emissione (fotoni/secondo)/luce di eccitazione (fotoni/secondo)) deve essere utilizzata al posto dell'efficienza media.
5. Fare clic con il pulsante destro del mouse nel file di immagine per copiare il ROI utilizzato nel passaggio 8.3 e incollarlo in ogni file di immagine.
   NOTA: quando si quantificano le immagini fluorescenti, quantificare la stessa regione su un mouse che è stato immagine senza metastasi. Utilizzare questo segnale come segnale di sfondo e sottrarlo da ogni immagine del mouse contenente metastasi fluorescenti acquisita.
6. Spostare i ROI incollati sulla stessa area selezionata nel passaggio 8.3.4 per ogni immagine e ripetere il passaggio 8.4.
7. Tracciare e analizzare i dati grezzi come segue (vedere la tabella supplementare 2).
   1. Eseguire una trasformazione del log₁₀ dei dati non elaborati per ogni mouse utilizzando la formula indicata (Tabella supplementare 2) e tracciare come illustrato nella Figura 2D e Figura 4F. La trasformazione del log₁₀ linearizza la curva di crescita che tende ad essere geometrica e riduce al minimo l'eteroscedasticità.
   2. Utilizzando la regressione lineare, calcolare la pendenza della linea adattata al log₁₀ dati trasformati per ogni mouse tracciato nel passaggio 8.7.1 (Tabella supplementare 2). Fare riferimento alla formula nella Tabella supplementare 2 per adattarla alla linea e calcolare la pendenza in un unico passaggio.
   3. Tracciare i valori numerici delle pendenze come in Figura 2E e Figura 4G. Utilizzare un test t di Student o ANOVA unidirezionale (per più di 2 gruppi) sulle piste per determinare la significatività statistica.

Per dimostrare l'approccio di cui sopra, abbiamo eseguito un esperimento proof of concept in cui un fattore di replica critico, RPA3 è stato abbattuto in una linea di cellule carcinoma di mammario topoto metastatico (4T122). Mentre il protocollo descrive l'etichettatura delle cellule con proteine luciferasi e fluorescenti prima della manipolazione genetica, abbiamo usato un approccio modificato perché i vettori RNAi forniscono anche il verde(Figura 2A). In primo luogo, 4T1 cellule sono state trascinate stabilmente con un costrutto lentivirale codifica ndol'alfafo luciferasi e resistenza agli igromicina (pHAGE-Luciferase-IRES-Hygro). Dopo la selezione dell'igromicina, è stato eseguito un assaggio di luciferasi per confermare l'espressione stabile della luciferasi lucciola (Figura 2A). Successivamente, le cellule 4T1-Luciferate sono state trascinate stabilmente con vettori retrovirali che esprimono uno shRNA basato su miR30 di controllo o uno shRNA basato su miR30 precedentemente mostrato per indirizzare efficacemente RPA316,23,24. Le cellule sono state poi iniettate nei topi attraverso la vena della coda laterale e il segnale bioluminescente in vivo è stato misurato due volte alla settimana per monitorare il carico metastatico (Figura 2B,C). Il segnale di log10 trasformato per ogni mouse è stato tracciato come carico metastatico nel tempo (Figura 2D) e le pendenze di ogni grafico sono state determinate (Figura 2E). Questi dati mostrano che il tasso di variazione nell'onere metastatico è significativamente ridotto con il knockdown RPA3 rispetto alle cellule di controllo. Anche se le differenze sono notevoli, questi dati da soli non ci permettono di determinare se l'onere metastatico ridotto è il risultato di meno metastasi o a causa di una crescita più lenta delle metastasi. Pertanto, alla fine dell'esperimento sono state analizzate anche le metastasi etichettate con il green nei polmoni. I topi iniettati con cellule knockdown RPA3 non avevano quasi metastasi nei polmoni, mentre i topi di controllo avevano numerose metastasi di grandi dimensioni (Figura 3). Inoltre, le metastasi che si sono formate dalle celle knockdown RPA3 erano chiaramente più piccole delle metastasi di controllo 4T1 (Figura 3A). Coerentemente con i nostri conteggi manuali (Figura 3B), il software di analisi delle immagini ha contato significativamente meno metastasi nei topi knockdown RPA3 (Figura 3C). Inoltre, l'onere metastatico totale nei polmoni (somma delle aree di ogni metastasi in millimetri) è stato drasticamente ridotto dal knockdown RPA3 (Figura 3D). Infine, le dimensioni delle singole metastasi che si formavano nei topi knockdown RPA3 erano generalmente molto più piccole di quelle dei topi di controllo (Figura 3E). Oltre alle grandi metastasi nei topi di controllo, abbiamo osservato anche numerose piccole metastasi, ma non siamo riusciti a determinare se si tratta di cellule tumorali che semino il polmone e non sono cresciute o se sono cellule tumorali versate da una delle metastasi più grandi che risemino il polmone in una nuova posizione (Figura 3E). Collettivamente questi dati mostrano che RPA3 è necessario per la formazione di metastasi da parte di cellule 4T1. Questi risultati erano attesi perché il nostro lavoro precedente ha mostrato che le cellule di abbattimenti RPA3 avevano significativamente ridotto la capacità di formare metastasi nei polmoni dopo l'iniezione della vena della coda16. Tuttavia, questo esperimento dimostra come l'uso dell'imaging animale vivo e della quantificazione fluorescente del numero e della dimensione della metastasi possa essere utilizzato per determinare se i cambiamenti nell'onere metastatico sono dovuti a differenze nella colonizzazione o nella crescita metastatica.

Per dimostrare come questo approccio può essere utilizzato per rispondere a una domanda più biologicamente rilevante, ci siamo chiesti se YAP e TAz sono necessari per la colonizzazione metastatica e la successiva crescita in questo modello sinogenico di cancro al seno. L'espressione e l'attività di YAP o TAz sono aumentate in molti tipi di cancro rispetto al tessuto normale e questo è predittivo di esito povero paziente25,26,27,28,29. Inoltre, diversi studi hanno implicato YAP, TA, o TEAD, i partner critici yAP / TAz-associazione, in metastasi15,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42, 43,44,45,46,47,48,49,50,51,52. Dati questi dati abbiamo usato il nostro approccio per verificare se YAP e TAz sono necessari per la formazione e la crescita della metastasi. Per questo, usiamo un vettore retrovirale che esprime shRNA basati su tandem miR30 che prendono di mira sia YAP che TA. Come mostrato, questo shRNA tandem riduce efficacemente l'espressione e l'attività trascrizionale di YAP e TAz in cellule 4T1 (Figura 4A,B). Le cellule di 4T1-Luciferase sono state trascinate stabilmente con una versione che esprime il verde di questo vettore di shRNA tandem YAP/TA- o uno shRNA a base di miR30 di controllo (Figura 4C) e poi modellato dalle iniezioni di vena della coda nei topi cassibili BALB/c. Come illustrato nella Figura 4, la velocità con cui l'onere metastatico è aumentato è stato significativamente più rapido nei topi iniettati con cellule di controllo rispetto ai topi iniettati con cellule di knockdown YAP/TAz (Figura 4D-F). Significativamente meno metastasi formate nei topi iniettati con cellule di knockdown YAP/TAz rispetto ai topi con cellule di controllo se contate manualmente (Figura 5A,B) o utilizzando il software di analisi delle immagini (Figura 5C). Non solo si formarono molte più metastasi nei topi di controllo, ma erano generalmente più grandi (Figura 5E). Coerentemente, anche il carico metastatico nei polmoni (area metastasi totale in mm) è stato drasticamente ridotto dal knockdown YAP/TAz (Figura 5D). È importante notare che quando le metastasi sono grandi e vicine, il software potrebbe non essere in grado di differenziare le metastasi distinte. Questo è stato il caso di alcune metastasi nei topi di controllo (mouse 3 e topo 7). Pertanto, è importante controllare l'output del software di analisi delle immagini per assicurarsi che stia misurando con precisione l'area dei singoli tumori. Questo è anche il motivo per cui è importante ottimizzare il numero di cellule iniettate e la lunghezza dell'esperimento. Collettivamente, questi dati mostrano che YAP e TAA sono tenuti a sostenere il tasso a cui l'onere metastatico aumenta in un modello di murino singenico di cancro al seno metastatico e che ciò è dovuto all'incapacità delle metastasi di formarsi e alla ridotta crescita delle poche metastasi che si sono formate.

Figura 1: Schema del protocollo. Tutti i virus necessari vengono prima confezionati nelle cellule HEK-293FT. Le cellule desiderate per lo studio vengono poi contemporaneamente infettate da luciferasi e virus fluorescenti che esprimono ciascuno un gene unico per la selezione dei farmaci per mammiferi. Le cellule infette vengono quindi espanse nel supporto appropriato contenente entrambi i farmaci per selezionare le cellule redusi stabilmente che esprimono sia luciferasi che proteine florescenti. L'espressione di entrambe le etichette viene confermata come descritto nel protocollo. Le cellule etichettate vengono poi trasdotte con un terzo virus a una manipolazione genetica contenente (miR30 shRNA) e un terzo gene unico di selezione dei farmaci. Dopo la selezione con il terzo farmaco, le cellule vengono iniettate nei topi attraverso la vena della coda laterale. Il carico metastatico viene monitorato nei topi durante l'esperimento con un sistema di imaging animale vivo in vivo. Alla fine dell'esperimento, i topi sono eutanasia, e le immagini di tutti i polmoni vengono prese utilizzando un microscopio dissetante fluorescente, e quindi utilizzate per misurare il numero e le dimensioni delle metastasi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: L'imaging animale vivo in vivo basato su Luciferatasi mostra che il knockdown RPA3 riduce il carico metastatico del cancro al seno. (A) Schematico che mostra come le cellule sono state generate per questo studio in vivo. Le cellule 4T1 sono state tradusse stabilmente con una lucidasi di codifica di lentivirus e resistenza all'igromicina. Le cellule infette sono state selezionate con 600 g/mL di igromycina B per una settimana e poi l'attività di luciferasi è stata misurata in cellule parentali o 4T1-luciferate utilizzando un kit di reporter luciferasi e lettore di piastre (n esperimento con replica pozzi medi). Le cellule 4T1-Luciferase sono state poi infettate da retrovirus che forniscono shRNA sGreen e miR30 mirati a mCherry (controllo) o mRPA3. La selezione di puromycin (2,5 g/mL) per 3 giorni è stata utilizzata per selezionare per l'integrazione stabile del virus. (B-E) le cellule 4T1-luciferate che esprimono stabilmente il verde e il controllo (sh-mCherry) o mRPA3 (sh-mRPA3-431) sono stati iniettati nei topi e immagini per bioluminesce nei giorni indicati come descritto nel protocollo. (B&C) Immagini bioluminescenti per un mouse rappresentativo di ciascun gruppo sul giorno indicato dopo l'iniezione (D) Plot del segnale luciferasi trasformato del log10 misurato per ogni mouse sul corso dell'esperimento. (E) Grafico a dispersione con media (linea continua) per le pendenze di ciascun mouse in D (n - 6 per sh-control e 8 per sh-mRPA3-431). La significatività statistica è stata testata utilizzando un test di t di Student; 0,05 USD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: La quantificazione delle metastasi fluorescenti rivela che il knockdown rpA3 previene la colonizzazione metastatica e la successiva crescita delle cellule del cancro al seno. (A) Immagini fluorescenti (a sinistra) e del campo luminoso (a destra) dei lobi rappresentativi di ciascun topo iniettate nella figura 2 21 giorni dopo l'iniezione. Gli asterischi (-) indicavano bronchi autofluorescenti verdi. (C-E) Il software di analisi delle immagini (vedere Tabella dei materiali) è stato utilizzato per identificare e misurare gli oggetti utilizzando una soglia di intensità compresa tra 25 e 100 e una soglia di dimensione compresa tra 0,01 mm2 e infinito. (B&C) Grafico a dispersione con la media (barra solida) del numero totale di metastasi nei polmoni di ogni mouse quando viene conteggiato (B) dal software di analisi delle immagini (C). (D) L'area totale (mm) del polmone misurata con il software di analisi delle immagini viene tracciata come carico metastatico con la media indicata da una barra solida. (E) La dimensione di ogni metastasi viene tracciata per ogni topo. I topi di controllo sono indicati dai punti blu e dai topi knockdown mRPA3 dai punti rossi. Si noti che la barra della scala è separata a 1 mm per semplificare la visualizzazione delle dimensioni e del numero di metastasi di piccole dimensioni (n - 6 sh-control, 8 sh-mRPA3-431). La significatività statistica è stata testata utilizzando un test di t di Student; p - 0,06; 0,01 USD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: il knockdown YAP/TAz riduce l'onere metastatico del cancro al seno. (A&B) Le cellule 4T1 che esprimono stabilmente il controllo basato su miR30 (mCherry) o gli shRNA tandem YAP/TAA (sh-mYAP1/mTA6) sono state analizzate mediante l'analisi delle macchie occidentali (A) o le con un costrutto di lucidferasi YAP/TA-TEAD e ha eseguito un'attività trascrizionale YAP/TAz-TEAD come descritto in precedenza15,16 (B) (n - 5 per il controllo e 4 per YAP1/TA6). (C) Schematico che mostra come le cellule sono state generate per lo studio in vivo. Le cellule di 4T1-Luciferase sono state infettate da retrovirus che forniscono a sGreen e a uno shRNA miR30 targeting mCherry (controllo) o tandem miR30 shRNA che prendono di mira sia mYAP che mTAA. Le cellule infette sono state selezionate in Puromycin (2,5 g/mL) per 3 giorni. Le cellule 4T1-luciferasi che esprimono stabilmente il verde e il controllo (sh-mCherry) o YAP/TAz (sh-mYAP1/mTA1) sono state poi iniettate nei topi e immagini per la bioluminescenza nei giorni iniettati. (D&E) Immagini bioluminescenti per un topo rappresentativo di ciascun gruppo durante la post iniezione del giorno indicato. (F) Stampa del segnale luciferasi trasformato del log10 misurato per ogni mouse sul corso dell'esperimento. (G) Grafico a dispersione con media (barra solida) per le pendenze di ciascun mouse in F (n - 7 per sh-control e 8 per sh-mRPA3-431). La media è indicata da una linea continua. La significatività statistica è stata testata utilizzando un test di t di Student; p - 0,06; , p è 0,01; ***. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: YAP e TAz sono necessari per le cellule metastatiche del cancro al seno per colonizzare i polmoni. (A) Immagini fluorescenti (a sinistra) e del campo luminoso (a destra) dei lobi rappresentativi di ciascun topo iniettate nella figura 4 21 giorni dopo l'iniezione. (C-E) Le immagini sono state elaborate con il software di analisi delle immagini come descritto nella Figura 3. (B&C) Grafico a dispersione con la media (barra solida) del numero totale di metastasi nei polmoni di ciascun mouse quando viene conteggiato manualmente (B) o dal software di analisi delle immagini (C). (D) L'area totale di tutte le metastasi (mm) è stata misurata con un software di analisi delle immagini e tracciata come carico metastatico con la media (barra solida). (E) La dimensione di ogni metastasi viene tracciata per ogni topo. I topi di controllo sono indicati dai punti blu e dai topi knockdown sh-mYAP1/mT-A6 dai punti rossi. Si noti che la barra della scala è separata a 1 mm per visualizzare meglio le dimensioni e il numero di metastasi di piccole dimensioni (n - 7 sh-control, 8 sh-mYA1/mT-A6). La media è indicata da una linea continua. La significatività statistica è stata testata utilizzando un test di t di Student; 0,05, p, 0,01; **. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare 1: Tabella dei vettori. Vengono elencati tutti i vettori utilizzati e vengono descritti i nuovi vettori. Sono state utilizzate tecniche di biologia molecolare standard per clonare nuovi vettori e sequenze per lo shRNA di nuova descrizione di 97 mer. Citazioni si riferiscono a: [1]53, [2]16, [3]54Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 2: Esempio di elaborazione e analisi dei dati di imaging animale vivo in vivo. Foglio di calcolo che mostra come i dati grezzi delle immagini animali in vivo vengono convertiti per l'analisi come descritto nei passaggi 6.7 e 6.8. I dati grezzi acquisiti dall'imaging animale vivo in vivo sono stati trasformati utilizzando una trasformazione del log10. La velocità di variazione dell'onere metastatico viene calcolata per ogni mouse calcolando la pendenza generata dai dati trasformati nel log10. Gli esempi includono l'analisi luciferasi da Figura 2. Le colonne sono contraddistinte da un colore per indicare quali dati sono stati utilizzati per generare ogni valore di pendenza e le formule vengono incorporati nel foglio di calcolo. Fare doppio clic sul pozzo rivelerà la formula utilizzata per elaborare i dati. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.