Quantificazione della lisciviazione dei metalli nella cromatografia di affinità metallica immobilizzata

Sommario

Vi presentiamo un saggio per una facile quantificazione dei metalli introdotti nei campioni preparati utilizzando la cromatografia dell'affinità dei metalli immobilizzati. Il metodo utilizza il blu idxynaphthol come indicatore di metallo colorimetrico e uno spettrofotometro UV-Vis come rivelatore.

Abstract

La contaminazione di enzimi con metalli lisciviati da colonne di affinità dei metalli immobilizzati (IMAC) rappresenta una grande preoccupazione per gli enziologi, poiché molte delle cazioni di-e trivalenti comuni utilizzate nelle resine IMAC hanno un effetto inibitorio sugli enzimi. Tuttavia, l'entità della lisciviazione dei metalli e l'impatto di vari reagenti di eluizione e riduzione sono scarsamente compresi in gran parte a causa dell'assenza di protocolli di quantificazione dei metalli di transizione semplici e pratici che utilizzano apparecchiature tipicamente disponibili in laboratori di biochimica. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un protocollo per quantificare rapidamente la quantità di contaminazione da metalli nei campioni preparati utilizzando iMAC come fase di purificazione. Il metodo utilizza il blu idxynaphthol (HNB) come indicatore colorimetrico per il contenuto di metalli in una soluzione campione e la spettroscopia UV-Vis come mezzo per quantificare la quantità di metallo presente, nella gamma nanomolar, in base alla modifica dello spettro HNB a 647 nm. Mentre il contenuto di metalli in una soluzione è stato storicamente determinato utilizzando la spettroscopia atomica di assorbimento o tecniche plasmatiche accoppiate induttivamente, questi metodi richiedono attrezzature specializzate e formazione al di fuori dell'ambito di un tipico laboratorio di biochimica. Il metodo qui proposto fornisce un modo semplice e veloce per i biochimici di determinare il contenuto di metalli dei campioni utilizzando attrezzature e conoscenze esistenti senza sacrificare la precisione.

Introduzione

Fin dalla sua nascita da Porath e collaboratori¹, la cromatografia di affinità del metallo immobilizzato (IMAC) è diventata un metodo di scelta per separare rapidamente le proteine in base alla loro capacità di legarsi con gli ioni metallici di transizione come n², Ni², Cu²e Co^{2 .} Questo è più comunemente fatto tramite tag poli-istidina ingegnerizzati ed è ora una delle tecniche di purificazione cromatografica più comuni per l'isolamento delle proteine ricombinanti². L'IMAC ha anche trovato applicazioni che vanno oltre la purificazione ricombinante delle proteine come un modo p....

Protocollo

1. Preparazione dei componenti di analisi

1. Determinare le frazioni cromatografiche da esaminare utilizzando l'assorbimento ottico a 280 nm o metodi alternativi di quantificazione delle proteine per identificare le frazioni arricchite di proteine.
   NOTA: Per questo lavoro, abbiamo usato uno spettrofotometro UV-Vis array a diodi. Per aumentare la produttività, è possibile utilizzare un lettore di lastre in grado di misurare l'assorbimento UV-Vis.
2. Preparazione dei componenti di ssay necessari
   1. Preparare o ottenere un buffer da 10-100 mM ("Buffer campione") con un pH compreso tra 7 e 12.
      NOTA: buffer biochimici comuni come Tris, HEPES, MOPS ....

Risultati

Lo spettro di HNB libero al pH neutro (linea nera) e spettri rappresentativi delle frazioni analizzate per Ni^2, dall'isolamento di MSP1E3D1²⁹ sono mostrati nella Figura 2. Una serie di analisi di successo dovrebbe dimostrare una minore assorbimento a 647 nm rispetto al controllo HNB, che corrisponde alla formazione di complessi HNB in presenza di un metallo di transizione. Un test fallito sarebbe indicato da un aumento dell'assorbimento a 647 nm. In alterna.......

Discussione

Il rilevamento colorimetrico dei metalli che utilizzano HNB fornisce un modo semplice per quantificare il grado di contaminazione delle proteine mediante ioni metallici di transizione da resine IMAC. Come abbiamo stabilito in Ref. 20, Ni^{2 si} lega ad HNB con stoichiometria 1:1 e la costante di dissociazione per i cambiamenti complessi Ni-HNB con pH. Tuttavia, il complesso K_d è nell'intervallo sub-nM per tutti i valori di pH raccomandati (7-12). In termini pratici, significa che tutti i Ni^{2 in}

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2xYT brodo	Fisher Scientific	BP9743-500	terreno per la crescita di E.coli
HEPES, acido libero	BioBasic	HB0264	tampone alternativo
HisPur Resina Ni-NTA	Thermo Scientific	88222
Idrossinaptolo blu disoidum sale	Sigma-Aldrich	219916-5g
Imidazole	Fisher Scientific	O3196-500
Imidazole	BioBasic	IB0277
MOPS, acido libero	BioBasic	MB0360	tampone alternativo
Cloruro di sodio	Fisher Scientific	S271-500
Fosfato di sodio	Fisher Scientific	S369-500	tampone alternativo
Tricine	Gold Bio	T870-100
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500