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Articolo metodologico

Screening e identificazione dei soppressori del silenziamento dell'RNA da parte degli effetti segreti dei patogeni vegetali

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DOI:

10.3791/60697

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3 febbraio 2020

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1Shanghai Key Laboratory of Plant Molecular Sciences, College of Life Sciences, Shanghai Normal University, 2College of Agriculture, Yangtze University, 3Laboratory of Molecular Genetics, China National Tobacco Corporation, Guizhou Institute of Tobacco Science

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un metodo di screening modificato che può essere ampiamente utilizzato per vagliare rapidamente i soppressori del silenziamento dell'RNA negli agenti patogeni delle piante.

Abstract

Il silenziamento dell'RNA è un meccanismo di regolazione genica evolutivamente conservato e specifico della sequenza negli eucarioti. Diversi patogeni delle piante hanno sviluppato proteine con la capacità di inibire il percorso di silenziamento dell'RNA vegetale ospite. A differenza delle proteine degli efmarcatori di virus, solo diverse proteine degli effetti secreti hanno mostrato la capacità di sopprimere il silenziamento dell'RNA nei patogeni batterici, oomycete e fungini, e le funzioni molecolari della maggior parte degli effetti rimangono in gran parte sconosciute. Qui, descriviamo in dettaglio una versione leggermente modificata del saggio di co-infiltrazione che potrebbe servire come metodo generale per osservare il silenziamento dell'RNA e per caratterizzare le proteine efsiate secrete dagli agenti patogeni delle piante. I passi chiave dell'approccio sono la scelta delle foglie sane e completamente sviluppate, l'adattamento della coltura batterica alla densità ottica appropriata (OD) a 600 nm e l'osservazione della fluorescenza delle proteine fluorescenti verdi (GFP) al momento ottimale sull'infiltrato per evitare di omettere effettori con debole attività di soppressione. Questo protocollo migliorato contribuirà a uno screening rapido, accurato ed approfondito dei soppressori per il silenziamento dell'RNA e servirà come un ottimo punto di partenza per studiare le funzioni molecolari di queste proteine.

Introduzione

Negli ultimi due decenni, l'accelerazione nel sequenziamento del genoma dei microrganismi che causano le malattie delle piante ha portato ad un divario di conoscenza sempre crescente tra le informazioni di sequenza e le funzioni biologiche delle proteine codificate1. Tra le molecole rivelate dai progetti di sequenziamento ci sono molecole echeggianti che sopprimono l'immunità innata e facilitano la colonizzazione dell'ospite; questi fattori sono secreti da patogeni vegetali distruttivi, tra cui batteri, nematodi e microbi filamentosi. Per rispondere a queste minacce, le piante ospiti hanno sviluppato nuovi recettori che riconoscono questi effetti, consentendo il ripristino della risposta immunitaria. Pertanto, gli esetritori sono soggetti a varie pressioni selettive, che portano alla diversificazione dei repertori degli efreattori tra le linee patogene2. Negli ultimi anni, gli effetti putativi da agenti patogeni vegetali hanno dimostrato di interrompere l'immunità innata delle piante impedendo i processi cellulari dell'ospite a beneficio dei microbi in una varietà di modi, tra cui la disregolazione delle vie di segnalazione, la trascrizione, il trasporto intracellulare, la stabilità del citoscheletro, il traffico di vescicoli e la messa a tacere dell'RNA3,4,5. Tuttavia, la stragrande maggioranza degli effetti patogeni, in particolare quelli provenienti da patogeni filamentosi, sono rimasti enigmatici.

Il silenziamento dell'RNA è un meccanismo di inattivazione genica mediato dall'omologia che viene conservato tra gli eucarioti. Il processo è innescato da un lungo RNA a doppio filamento (dsRNA) e si rivolge all'RNA omologato a filamento singolo (ssRNA) in modo specifico della sequenza e manipola un'ampia gamma di processi biologici, compresa la difesa antivirale6. Per superare le risposte immunitarie innate dell'ospite, alcuni virus si sono evoluti per compensare il silenziamento dell'RNA, inclusa la capacità di replicarsi all'interno di compartimenti intracellulari o fuggire dal segnale riorganizzato del silenziamento. Tuttavia, la strategia più generale con cui i virus proteggono i loro genomi dalla perdita dipendente dal silenziamento dell'RNA della funzione genica è codificare proteine specifiche che sopprimono il silenziamento dell'RNA7,8. Diversi approcci meccanicistici sono stati stabiliti per vagliare e caratterizzare i soppressori virali del silenziamento dell'RNA (VSR), tra cui la co-infiltrazione delle colture di Agrobacterium tumefaciens, piante transgeniche che esprimono soppressori putativi, innesto e coltura cellulare9,10,11,12,13.

Ognuno di questi saggi ha vantaggi e svantaggi, e identifica VSR in modo proprio. Uno degli approcci più comuni si basa sulla co-infiltrazione delle singole colture A. tmuefaciens che ospitano la potenziale proteina virale e un gene reporter (tipicamente proteina fluorescente verde [GFP]) sulle piante di Nicotiana benthamiana 16c che esprimono costituitamente GFP sotto il controllo del virus del mosaico del caulfiore 35Sr. In assenza di un soppressore attivo del silenziamento virale, la GFP viene identificata come esogena dalle cellule ospiti e viene silenziata entro 3 giorni dopo l'infiltrazione (dpi). Al contrario, se la proteina virale possiede un'attività di soppressione, il livello di espressione della GFP rimane costante oltre i 3,9 dpi9. Questo saggio di co-infiltrazione è semplice e veloce; tuttavia, non è né altamente stabile né sensibile. Ciò nonostante, il saggio ha identificato numerosi VSR con diverse sequenze proteiche e strutture in molti virus dell'RNA7,8.

Recentemente, diverse proteine eftraenti che possono inibire l'attività di silenziamento dell'RNA cellulare sono state caratterizzate da patogeni batterici, oomycete e piante fungine14,15,16. Questi risultati implicano che la soppressione del silenziamento dell'RNA è una strategia comune per facilitare l'infezione che viene utilizzata dagli agenti patogeni nella maggior parte dei regni. In teoria, molti, se non tutti, degli effetti potrebbero codificare soppressori del silenziamento dell'RNA (RSS); ad oggi, tuttavia, solo alcuni sono stati individuati, principalmente a causa della carenza della strategia di screening affidabile e generale. Inoltre, i soppressori del silenziamento dell'RNA non sono stati studiati nella stragrande maggioranza degli agenti patogeni delle piante17.

In questa relazione, presentiamo un protocollo ottimizzato e generale per identificare gli effetti patogeni delle piante che possono sopprimere il silenziamento dell'RNA locale e sistemico utilizzando il saggio di agroinfiltrazione. L'obiettivo principale di questo studio era quello di enfatizzare gli aspetti chiave del protocollo e descrivere i passaggi in dettaglio, fornendo così un saggio di screening che è adatto a quasi tutti gli effetti degli agenti patogeni vegetali.

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Protocollo

NOTA: Tutte le fasi della procedura devono essere condotte a temperatura ambiente (RT).

AVVISO: Depositare tutti i supporti contenenti microbi patogeni, nonché le piante e i tessuti vegetali utilizzati nel saggio, nei contenitori di rifiuti appropriati e nell'autoclave prima di scartare.

1. Preparazione di costrutti di plasmide contenenti effetti putativi

  1. Selezionare gli effettori setomessi secreti che sono altamente espressi durante l'infezione, come determinato dal sequenziamento dell'RNA (RNA-Seq), e ulteriormente dalla tecnica PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR).
  2. Determinare il sito di scissione peptide del segnale di ogni effettore utilizzando uno strumento software come SignalP18.
  3. Progettare primer ed eseguire la PCR per amplificare il gene codificando l'effetto di interesse utilizzando la polimerasi del DNA ad alta fedeltà. Eseguire l'elettroforesi gel agarose per controllare il prodotto PCR, quindi clonare l'amplificatore in gateway entry vector pQBV3 utilizzando il kit di clonazione senza legatura (Table of Materials), e successivamente nella destinazione espressione vettore pEG100 utilizzando la reazione di ricombinazione LR19.
  4. Trasformare 3x5 l di miscela di reazione LR in 100 gradi di cellule competenti di E. coli (ad es., TOP10, DH5), diffondere le cellule batteriche trasformate sul mezzo agar Luria-Bertani (LB) integrato con 50 g/mL di kanamycin, e incubare a 37 gradi centigradi per 16-20 h.
    NOTA: I trasformazioni positivi possono essere identificati dalla colonia PCR20 e ulteriormente analizzati da miniprep e sequenziamento plasmide.
  5. Introduci 50-100 ng di plasmidi ricombinanti che trasportano la proteina esecuente in 100 gradi l di cellule A. tumefaciens chimicamente competenti (ad esempio, GV3101 o C58C1), mescola delicatamente, e poi congela l'azoto liquido per 1 min. Scongelare le cellule in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 5 min.
  6. Aggiungete 500 ldi di brodo LB e incubate a 30 gradi centigradi per 4/6 h con agitazione delicata, quindi trasferite e sparse tutte le cellule agrobatteriche sul mezzo LB agar integrate con 50 g/mL di kanamycin e 50 g/mL rifampicina a 30 s per 2 giorni.
    NOTA: i cloni positivi possono essere verificati dalla colonia PCR.
  7. Usa una singola colonia trasformata per esperimenti di infiltrazione agro-agrose, se non diversamente indicato.
    NOTA: Nella presente ricerca, nessuno dei geni efmortivi testati conteneva introni previsti; ciascuno dei geni è stato direttamente amplificato dal DNA genomico di un isolodio fitofathora. Un vettore di espressione della pianta Gateway senza tag è consigliato, ma non necessario.

2. Preparazione delle piante N. benthamiana 16c

  1. Preparare miscele di terreno in vaso costituite da (per volume) muschio di torba, 30% perlite, e 20% vermiculite, e autoclave a 120 gradi centigradi per 20 min.
  2. Immergere le miscele di terreno autoclaved con soluzione di fertilizzante vegetale (1 g/L) e sotto-imballarle in vasi più piccoli (80 mm x 80 mm x 75 mm) conservati in un vassoio più grande (540 mm x 285 mm x 60 mm).
  3. Semina uno o due semi di N. benthamiana 16c sulla superficie del suolo di ogni vaso. Coprire il vassoio con una cupola di plastica e lasciare germinare i semi.
  4. Mettete il vassoio sotto camere di crescita illuminate e a temperatura controllata con una temperatura di 23,25 gradi centigradi, un'umidità relativa del 50-60% e un fotoperiodo di lunga giornata (14 h luce/10 h di buio, con illuminazione a 130,150s-e-2s-1).
  5. Togliere la cupola di plastica dopo che i semi germinano (3-4 giorni) e lasciare che le piantine crescano nelle stesse condizioni utilizzate per la fase di germinazione.
  6. Aggiungere una quantità appropriata di acqua, mantenendo il terreno umido ma non ammollo, ogni 2/3 giorni; aggiungere fertilizzante ogni 10 giorni per promuovere un'ulteriore crescita. Mantenere le piante N. benthamiana 16c in condizioni normali fino a quando non sono pronti per l'uso; in questa fase la pianta dovrebbe avere almeno cinque foglie vere completamente sviluppate e nessun ascellare visibile o boccioli di fiori, e le foglie dovrebbero avere un aspetto verde sano).
  7. Usa foglie di N. benthamiana 16c di 3-4 settimane per i saggi locali sul silenziamento dell'RNA e le giovani piante N. benthamiana 16c (10-14 giorni) per i saggi sistemici di silenziamento dell'RNA.
    NOTA: le condizioni di crescita delle piante e le strutture variano da laboratorio a seconda dei laboratori; scegliere foglie sane, ben sviluppate e completamente espanse per l'infiltrazione.

3. Preparazione della coltura dell'agrobacterium per l'infiltrazione

  1. Raccogliere una colonia positiva dalla piastra LB e inoculare le cellule in tubo di vetro contenente 5 mL di lB medio integrato con 50 g/mL di kanamycin e 50 rifampicina g/mL. Far crescere le cellule a 30 gradi centigradi agitando a 200 giri/min per 24-48 h.
  2. Trasferire 100 l di coltura in 5 mL di LB medio integrato con gli stessi antibiotici, 10 mM 2-(N-morpholino) acido etanofonico (MES; pH 5,6) e 20-M acetosyringone (AS). Coltiva i batteri a 30 gradi centigradi con lo scuotimento a 200 giri/min per 16-20 h.
  3. Centrifuga cellule a 4.000 x g per 10 min. Versare il supernatante e rispendere il pellet in 2 mL di 10 mM MgCl2 tampone.
  4. Ripetere il passaggio 3.3 per garantire la rimozione completa degli antibiotici.
  5. Determinare la densità della coltura dell'Agrobacterium misurando la densità ottica a 600 nm (OD600). Regolare su un buffer OD600 di 1,5,2,0 con 10 mM MgCl2.
  6. Aggiungere 10 mM MES (pH 5.6) e 150 M AS alle colture di sospensione finali e incubare le cellule a RT per almeno 3 h senza agitare.
    NOTA: Non lasciare le impostazioni di sospensione finali durante la notte.

4. Co-infiltrazione N. foglie di benthamiana

  1. Mescolare volumi uguali di una coltura agrobatterica contenente 35S-GFP con una coltura agrobatterica contenente 35S- cetriolo mosaico soppressore 2b (CMV2b), effetto reputatore, o vettore vuoto (EV).
  2. Attentamente e lentamente infiltrarsi le sospensioni miste di agrobacterium sui lati anassiali delle foglie di N. benthamiana 16c utilizzando una siringa senza aghi da 1 mL.
  3. Rimuovere la sospensione batterica rimanente dalle foglie con tergicristalli e cerchiare i margini delle patch infiltrate con una penna maker.
  4. Lasciare le piante infiltrate nella camera di crescita nelle stesse condizioni di crescita.
    NOTA: Per motivi di sicurezza e salute, occhiali protettivi e una maschera devono essere indossati durante l'infiltrazione. Per evitare la contaminazione incrociata, i guanti devono essere cambiati o sterilizzati con etanolo tra infiltrazioni. Normalmente è necessario almeno 1 mL di sospensioni di agrobacterium per foglia per l'infiltrazione. Per il silenziamento sistemico, saranno necessarie almeno due foglie per l'infiltrazione.

5. Analisi delle immagini GFP

  1. Rileva visivamente la fluorescenza GFP nelle foglie appena coltivate di piante intere 2 settimane dopo l'infiltrazione (per il silenziamento sistemico dell'RNA) o patch infiltrate di foglie 3-4 dpi utilizzando una lampada ultravioletta a onde lunghe (UV) senza raccolta foglie.
  2. Fotografa piante raccolte e/o foglie staccate con una fotocamera digitale dotata di filtri UV e gialli.
    NOTA: Per i saggi della soppressione del silenziamento locale, indaga sulle macchie infiltrate di foglie di N. benthamiana 16c, mentre per l'attività di soppressione del silenziamento sistemico, studia le foglie appena coltivate. L'attività di soppressione del silenziamento dell'RNA può variare tra i singoli effetti. Pertanto, osservare le patch o le foglie per alcuni giorni a partire da 3 dpi. Utilizzare CMV2b ed EV rispettivamente come controlli positivi e negativi.

6. Analisi del bocche del nord dei livelli di mRNA GFP nelle foglie infiltrate

  1. Isolamento dell'RNA totale dal tessuto fogliare utilizzando il reagente di isolamento dell'RNA (Tabella dei materiali)
    1. Raccogliere i tessuti fogliada da patch N. benthamiana 16c infiltrati a 4,7 dpi, polverizzare in azoto liquido in una polvere fine e trasferire la polvere in uno sterile tubo da 2 mL.
    2. Aggiungere il reagente di isolamento dell'RNA (1 mL/100 mg di tessuto) immediatamente al tubo campionato in un cappuccio, agitare vigorosamente per omogeneare e incubare RT per 5 min.
    3. Aggiungere il cloroformio (reagente di isolamento RNA di 200 mL/1 mL) ad ogni tubo in un cappuccio, agitare vigorosamente per 15 s, e incubare a RT per 5 min. Centrifugare l'omogeneità a 12.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi.
    4. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo privo di RNase e scartare il pellet. Aggiungere 0,7 volume di isopropanolo al supernatante, invertire delicatamente più volte e incubare la miscela a RT per 10 min.
    5. Far precipitare il pellet di RNA per centrifugazione a 12.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi.
    6. Scartare il supernatante, lavare il pellet con il 70% di etanolo e asciugare all'aria il pellet in un cappuccio. Sciogliere l'RNA nell'acqua trattata in pircarbonato dietil (DEPC) incubando in un bagno d'acqua di 65 gradi centigradi per 10-20 min.
  2. Analisi del nord del livello di mRNA GFP nelle foglie infiltrate
    1. Preparare un 1,2% di formaldeide denaturazione gel agarose in 1x tampone da corsa MOPS.
    2. Mescolare l'RNA 1:1 con la tintura per il carico di RNA e la denaturazione per incubazione a 65 gradi centigradi per 10 min, raffreddare immediatamente i campioni denaturati sul ghiaccio per 1 min.
    3. Caricare i campioni sul gel ed elettroforese a 100 V per 50 min fino a quando l'RNA è ben separato.
    4. Risciacquare il gel nel tampone di citrato saline-sodio (SSC) per rimuovere la formaldeide e trasferire il gel nella membrana di nylon mediante trasferimento capillare nel buffer 20x SSC durante la notte. Immergere la membrana in 2x SSC e fissare l'RNA alla membrana esponendo la membrana umida al collegamento uv cross.
    5. Aggiungere la quantità appropriata di buffer di ibridazione (10 mL per 100 cm2 membrana; Tabella dei materiali) in un tubo di ibridazione e agitare a 60 gradi centigradi in un forno di ibridazione.
    6. Mettere la membrana nel tubo di ibridazione e incubare per 60 min a 60 gradi centigradi. Diluire una sonda di DNA con etichetta 5'DIG (concentrazione finale, 50 ng/mL) nella soluzione di ibridazione contenente buffer di ibridazione preriscaldato.
    7. Eliminare il buffer di preiibridazione e sostituirlo immediatamente con una soluzione di ibridazione preriscaldata contenente la sonda con etichetta DIG. Incubare la macchia con sonda a 60 gradi durante la notte, con agitazione delicata.
    8. Dopo l'ibridazione, lavare la membrana due volte in tamponi di rigore crescente a 60 gradi centigradi per 20 min ciascuno. Pulire delicatamente la membrana per rimuovere il buffer di lavaggio supplementare e aggiungere reagenti come suggerito nel kit di ibridazione e rilevamento chemiluminescente (Tabella dei materiali).
    9. Rileva i segnali ibridati mediante reazione chemiluminescente combinata con il sistema di imaging.

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Risultati

In precedenza, descriviamo la procedura passo-passo per un migliore saggio di screening per valutare l'attività RSS degli efpelletori P. sojae RxLR. Complessivamente, l'esperimento richiede 5-6 settimane. Successivamente, gli RSS identificati dal saggio possono essere ulteriormente caratterizzati in termini di funzione e meccanismo molecolare. Come esempio del nostro approccio, abbiamo usato il P. sojae RxLR effecto Phytorphhsor di silenziamento dell'RNA 1 (PSR1), che vi...

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Discussione

Il silenziamento dell'RNA è un meccanismo di difesa chiave impiegato dalle piante per combattere agenti patogeni virali, batterici, oomycete e fungini. A loro volta, questi microbi hanno sviluppato proteine soppressori silenziamento per contrastare il silenziamento antivirale, e questi RSS interferiscono con diversi passaggi del percorso di silenziamento dell'RNA22,23. Sono stati sviluppati diversi saggi di screening per identificare gli RSS10

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del "Programma Shuguang" della Shanghai Education Development Foundation e della Shanghai Municipal Education Commission, del National Key Research and Development Program of China National Key R&D Program of China ( 2018YFD0201500), la National Natural Science Foundation of China (n. 31571696 e 31660510), il Thousand Talents Program for Young Talents of China e la Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (18D-2260500).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acido 2-Morpholinoetansolfonic (MES)Biofroxx1086GR500Tampone
2xTaq Master MixVazyme BiotechP112-AAPCR
3-(N-morfolino) acido propansolfonico (MOPS)Amresco0264C507-1KGMOPS Tampone
Acetosiringone (AS)Sigma-AldrichD134406-5GInduzione di Agrobacterium
AgarSigma-AldrichA1296-1KGLB
medio AgarosioBiofroxx1110GR100Elettroforesi
Amersham Hybond -N+GE HealthcareRPN303 BNothern blot
Amersham ImagerGE HealthcareAmersham Imager 600Image
Bacto TryptoneBD Biosciences211705LB medium
Bacto Estrazionedel lievitoBD Biosciences212750LB media
FotocameraNikonD5100Fotografia
ChemiDoc MP Sistema di imagingBio-Rad
Modulo di rilevamento chemiluminescente componente dei kit dafaThermo Fisher Scientific89880Rilevamento della luminescenza
CloramfenicoloAmresco0230-100GAntibiotici
ClonExpress II Kit di clonazione in un solo passaggioVazyme BiotechC112-01Legatura
DIG Easy HybSigma-Aldrich 11603558001Tampone di ibridazione
Kit di minipreparazione del plasmideEasypure TransGen BiotechEM101-02Estrazione del plasmide
EasyPure Kit di estrazione rapida su gelTransGen BiotechEG101-02Estrazione su gel
EDTA sale disodico diidratoAmresco/VWR0105-1KGMOPS Alimentatore per elettroforesi tampone
LiuYiDYY6DElettroforesi dell'acido nucleico.
FastDigest EcoRVThermo Fisher ScientificFD0304Gel di digestione vettoriale
Sistema di immaginiTanonTanon3500Immagine
GentamicinaAmresco0304-5GAntibiotici
Kanamicina SolfatoSigma-AldrichK1914Antibiotici
LR Clonasi IIenzima Invitrogen11791020reazione LR
Membrana assorbente alla nitrocellulosa 0,45 umGE Healthcare10600002Kit
di etichettatura del dna primario casuale della biotina settentrionale NORTH2southThermo Fisher Scientific17075Etichettatura della biotina
PCR TermociclatoriBio-RadT100PCR
Muschio di torbaPINDSTRUPOro scuro + argilla
Piante Peters Fertilizzante idrosolubileICEPeter Fertilizzante professionale 20-20-20
Phanta Max Super-Fidelity DNA PolimerasiVazyme BiotechP505-d1Enzima
RifampicinaMP Biomedicals219549005Antibiotici
RNA Gel Caricamento Colorante (2X)Thermo Fisher ScientificR0641RNA Gel Caricamento Colorante
Acetato di sodio IdratoAmresco / VWR0530-1KGMOPS Buffer
Cloruro di sodioAmresco0241-10KGLB medio
Citrato trisodicoAmresco0101-1KGSSC Tampone
Reagente TrizolInvitrogen15596018Reagente di isolamento dell'RNA
Lampada UVAnalytik Jena UVPB-100APOsservazione
UVP Hybrilinker FornoAnalytik JenaOV2000Northern

Riferimenti

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