Combinazione di dispositivi fluidici con microscopia e citometria di flusso per studiare il trasporto microbico nei mezzi porosi attraverso le scale spaziali

Sommario

Le curve di svolta (BTC) sono strumenti efficienti per studiare il trasporto di batteri nei mezzi porosi. Qui introduciamo strumenti basati su dispositivi fluidici in combinazione con microscopia e conteggio citometrico del flusso per ottenere I BTC.

Abstract

Comprendere il trasporto, la dispersione e la deposizione di microrganismi nei mezzi porosi è un compito scientifico complesso che comprende argomenti diversi come l'idrodinamica, l'ecologia e l'ingegneria ambientale. La modellazione del trasporto batterico in ambienti porosi su diverse scale spaziali è fondamentale per prevedere meglio le conseguenze del trasporto batterico, ma i modelli attuali spesso non riescono a scalare da laboratorio a condizioni sul campo. Qui introduciamo strumenti sperimentali per studiare il trasporto batterico in mezzi porosi su due scale spaziali. Lo scopo di questi strumenti è quello di ottenere osservabili macroscopici (come curve rivoluzionarie o profili di deposizione) di batteri iniettati in matrici porose trasparenti. Su piccola scala (10-1000 μm), i dispositivi microfluidici sono combinati con la video-microscopia ottica e l'elaborazione delle immagini per ottenere curve rivoluzionarie e, allo stesso tempo, per tracciare singole cellule batteriche alla scala dei pori. Su scala più ampia, la citometria a flusso è combinata con un distributore robotico autoprofeso per ottenere curve rivoluzionarie. Illustriamo l'utilità di questi strumenti per capire meglio come i batteri vengono trasportati in complessi mezzi porosi come la zona iporeica dei corsi d'acqua. Poiché questi strumenti forniscono misurazioni simultanee su scale, aprono la strada a modelli basati su meccanismo, di fondamentale importanza per l'upscaling. L'applicazione di questi strumenti può non solo contribuire allo sviluppo di nuove applicazioni di biorimediazione, ma anche gettare nuova luce sulle strategie ecologiche dei microrganismi che colonizzano substrati porosi.

Introduzione

Gli studi volti a comprendere il trasporto di microbi attraverso mezzi porosi sono stati principalmente guidati da^{preoccupazioni di contaminazione 1,}trasmissione della^{malattia 2} e biorimediazione³. A questo proposito, i batteri sono stati per lo più trattati come particelle nei^{modelli di trasporto 4} e processi come filtrazione, deformazione, sedimentazione gravitazionale o rimobilitazione da biofilm sono stati identificati come fattori di ritenzione o trasporto di microbi⁵. Tuttavia, studiare il trasporto di batteri attraverso paesaggi porosi può anc....

Protocollo

1. Condizioni di coltura batterica

1. Lavorando sotto una cappa di flusso laminare, utilizzare 100 μL di uno stock di glicerolo di Pseudomonas putida KT2440 (1 × 10⁷ mL^-1,conservato a -80 °C) per inoculare 5 mL di mezzo Luria-Bertani (LB). Incubare a 30 °C mentre si trema a 250 giri/min durante la notte.
2. Il giorno successivo, resospend 100 μL della coltura notturna in mezzo LB da 5 mL e incubare nelle stesse condizioni per 5h (fase esponenziale). Campionare un'aliquota di 1 mL in un tubo da 2 ml, lasciare raffreddare a temperatura ambiente (~15 min) e centrifugare (2300 x g per 5 min).
3. Rimuovere il sup....

Risultati

Per illustrare la funzionalità del flusso di lavoro presentato, abbiamo eseguito esperimenti utilizzando Pseudomonas putida KT2440 geneticamente modificato, un batterio motile gram negativo importante per la bioremediazione e la biotecnologia. Le versioni geneticamente modificate di questo ceppo che esprimono la produzione di FPG sono disponibili in commercio. È disponibile anche un ceppo non mobile di P. putida KT2440 che manca dei geni strutturali e regolatori rilevant.......

Discussione

Qui suggeriamo due mezzi per studiare il trasporto di microbi attraverso sistemi porosi a livello di singola cellula e popolazione. Mentre lo studio dei fenomeni di trasporto mediante modellazione BTC ha fornito preziose informazioni sulla diffusione di agenti patogeni o contaminanti su scala ecosistemica, esistono ancora difficoltà da scalare dagli esperimenti di laboratorio alle condizioni sul campo. Gli strumenti qui descritti consentono ai ricercatori di risolvere sperimentalmente le scale spaziali e temporali al fin.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
EDTA	Sigma
Elastomero Sylgard 184	Dowsil	101697
Citometro a flusso NovoCyte	Acea
Glucosio	Sigma		https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit
LB brodo	BD
Distributore di liquidi, XY Plotter Robot Kit	makeblock
Microscopio Axio Imager	Zeiss
Microscopio AxioZoom v16	Zeiss
Vetrini per microscopio, 75 mm & volte; 25 mm	Pompa
Minipuls 3	Gilson
Plasma bonder Corona SB	BlackHole Lab
Fosfato di potassio	Sigma
Pompa a siringa New Era NE 4000	New Era
Syto 13 Sonde molecolari fluorescenti per macchie di acido nucleico verde	, tubi Invitrogen
Tygon Fresatrice	Ismatec
WF31SA	Mikron

peristaltica Corning universale