Articolo metodologico

3D Multicolor DNA FISH Tool per studiare l'architettura nucleare nelle cellule primarie umane

DOI:

10.3791/60712

⸱

25 gennaio 2020

 ,  ,  , 
1Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi", INGM

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IL DNA FISH multicolore 3D rappresenta uno strumento per visualizzare più loci genomici all'interno dei nuclei 3D conservati, definendo inequivocabilmente le loro interazioni reciproche e la localizzazione all'interno dello spazio nucleare a livello di singola cellula. Qui, un protocollo passo dopo passo è descritto per un ampio spettro di cellule primarie umane.

Abstract

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Una delle principali domande nella biologia cellulare è l'organizzazione genomica all'interno dello spazio nucleare e come l'architettura della cromatina possa influenzare processi come l'espressione genica, l'identità cellulare e la differenziazione. Molti approcci sviluppati per studiare l'architettura 3D del genoma possono essere suddivisi in due categorie complementari: tecnologie basate sulla cattura della conformazione cromosomica (tecnologie C) e imaging. Mentre il primo si basa sulla cattura della conformazione cromosomica e delle interazioni del DNA prossimale in una popolazione di cellule fisse, la seconda, basata sulla fluorescenza del DNA nell'ibridazione situ (FISH) su nuclei conservati in 3D, consente la visualizzazione contemporanea più loci a livello di singola cellula (multicolore), esaminando le loro interazioni e la distribuzione all'interno del nucleo (3D DNA multicolore FISH). La tecnica del DNA FISH multicolore 3D ha una limitazione di visualizzare solo pochi loci predeterminati, non permettendo un'analisi completa dell'architettura nucleare. Tuttavia, data la robustezza dei suoi risultati, 3D DNA FISH multicolore in combinazione con 3D-microscopia e ricostruzione dell'immagine è un possibile metodo per convalidare i risultati basati sulla tecnologia C e per studiare in modo inequivocabile la posizione e l'organizzazione di loci specifici a livello di singola cellula. Qui, proponiamo un metodo passo dopo passo di 3D multicolore DNA FISH adatto per una vasta gamma di cellule primarie umane e discutere tutte le azioni pratiche, passaggi cruciali, nozioni di imaging 3D e analisi dei dati necessari per ottenere un multicolore 3D di successo e informativo DNA FISH all'interno di diversi contesti biologici.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli eucarioti più alti devono condensare e compattare sistematicamente un'enorme quantità di informazioni genetiche nel minuto spazio 3D del nucleo1,2,3,4. Oggi sappiamo che il genoma è spazialmente ordinato in compartimenti e domini topologicamente associati5 e che i molteplici livelli di riduzione del DNA generano contatti tra diverse regioni genomiche che possono comportare la formazione di loop della cromatina6,7. Il loop dinamico 3D della cromatina può influenzare molti processi biologici diversi come la trascrizione8,9, la differenziazione e lo sviluppo10,11, riparazione del DNA12,13, mentre le sue perturbazioni sono coinvolte in varie malattie14,15,16 e difetti dello sviluppo15,17,18.

Molti approcci sono stati sviluppati per studiare l'organizzazione del genoma 3D. Tecnologie basate sulla conformazione cromosomica (tecnologie C, 3C, 4C, 5C, Hi-C e derivati) sono state sviluppate per studiare l'organizzazione del genoma nelle cellule fisse3,4,19,20. Tali approcci si basano sulla capacità di catturare le frequenze di contatto tra loci genomici in prossimità fisica. Le tecnologie C, a seconda della loro complessità, catturano l'organizzazione globale del genoma 3D e la topologia nucleare di una popolazione cellulare3,4,19,20. Tuttavia, le interazioni 3D sono dinamiche nel tempo e nello spazio, altamente variabili tra singole cellule costituite da interazioni multiplex, e sono ampiamente eterogenee21,22.

La fluorescenza 3D multicolore del DNA nell'ibridazione situ (FISH) è una tecnica che consente la visualizzazione di loci genomici specifici a livello di singola cellula, consentendo lo studio diretto dell'architettura nucleare 3D in modo complementare alle tecnologie C. Rappresenta una tecnologia attualmente utilizzata per convalidare in modo inequivocabile i risultati C. IL DNA FISH multicolore 3D utilizza sonde etichettate fluorescentmente complementari ai loci genomici di interessi. L'uso di diversi fluorofori e attrezzature di microscopia idonee consentono la visualizzazione contemporanea di più obiettivi all'interno dello spazio nucleare23,24. Negli ultimi anni, FISH è stato combinato con i progressi tecnologici nella microscopia per ottenere la visualizzazione di strutture su scala fine ad alta risoluzione25,26 o con approcci CRISPR-Cas per la visualizzazione degli acidi nucleici nell'imaging dal vivo27,28. Nonostante l'ampia adozione, l'approccio 3D multicolore DNA FISH è ancora considerato difficile in molti laboratori perché il materiale biologico utilizzato deve essere adattato.

Qui, forniamo un protocollo completo per il DNA FISH multicolore 3D (dalla preparazione di cellule/sonde all'analisi dei dati) applicabile a un'ampia gamma di cellule primarie umane, consentendo la visualizzazione di più loci genomici e preservando la struttura 3D dei nuclei. Per studiare l'architettura nucleare, la struttura 3D dei nuclei deve essere preservata. Per questo motivo, a differenza di altri protocolli esistenti29,30,31, evitiamo l'uso di un gradiente di alcol e lo stoccaggio dei copricapi nell'alcool che possono influenzare la struttura della cromatina32. Il metodo è adattato dai protocolli 3D DNA FISH conservati24,33 da applicare a una vasta gamma di cellule primarie umane, sia isolate ex vivo che coltivate in vitro. Ci sono parametri di permeabilizzazione e deproteinizzazione per diverse morfologia nucleare e caratteristiche citologiche (ad esempio, diversi gradi di compattazione nucleare, abbondanza di citoscheletri)34. Questi parametri sono spesso generalmente descritti in altri protocolli24,33, senza fornire una chiara discriminazione della procedura all'interno di diversi tipi di cellule. Inoltre, abbiamo sviluppato uno strumento specifico chiamato NuCLsD (localizzatore di contatti nucleari in 3D)16, fornendo principi per l'analisi dei dati che miglioreranno la vicinanza 3D tra diversi loci e la loro distribuzione topologica nucleare all'interno dello spazio nucleare in modo automatizzato.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Procedure di preparazione ed etichettatura della sonda del DNA con traduzione nick

  1. Purificare e pulire i cromosomi artificiali batterici (BAC), plasmidi o prodotti PCR con kit specifici (Tabella dei materiali), risospendere in ddH2O, controllare per elettroforesi su un gel di agarose e quantificare.
  2. Eseguire la traslazione del nick su 1,5,5 g di DNA dal punto 1,1 in un volume finale di 50 gradi, mescolando tutti i reagenti in un tubo DNA a bassa legatura di 0,5 mL secondo la tabella 1.
    NOTA: le sonde etichettate direttamente possono migliorare il rapporto segnale/rumore. Sono disponibili in commercio in commercio kit per la produzione indiretta e diretta di sonde con vari fluorocrodi Alexa.
  3. Incubare la miscela di traduzione nick in un mixer termico a 16 gradi centigradi per un certo tempo a seconda della lunghezza del materiale DNA iniziale: 45 min per i prodotti PCR (un pool di prodotti PCR di 2.000 bp ciascuno) e fino a 4 h per IL DNA BAC e i plasmidi.
  4. Controllare le dimensioni delle sonde prodotte al passaggio 1.3 mediante elettroforesi su un gel di agarose del 2,2%.
    NOTA: la dimensione ottimale del probe è <200 bp (Figura 1A).
    1. Se il DNA non viene digerito abbastanza, aggiungere 5 U di DNA polymerase I e 0.05 U di DNase I alla reazione e incubare per 1/2 h a 16 gradi centigradi e successivamente ricontrollare. Interrompere la reazione con 0,5 m EDTA (concentrazione finale). Conservare le sonde a -20 gradi centigradi.
  5. Per ogni esperimento DNA FISH, far precipitare le seguenti quantità di sonde a seconda del materiale DNA iniziale da cui vengono prodotte le sonde: 200 ng da prodotti PCR tradotti in nick, 100 ng da NICK tradotti AC o 300 ng da plasmide tradotte nick. Aggiungere ddH2O fino a 150 gradi l, 20 g di DNA di spermatozoi di salmone non etichettato, 3,5 g di DNA Cot-1 specifico per specie, 3 volumi di 100% EtOH e un volume di 3 M di acetato di sodio pH 5.2. Precipitare a -80 gradi centigradi per 1 ora.
  6. Centrifuga alla massima velocità per 1 h a 4 gradi centigradi e scartare il supernatante. Lavare il pellet due volte con il 70% EtOH.
  7. Risospendere il pellet in 2 o L di 100% formamide pH 7,0, agitare a 40 gradi centigradi per 30 min (può richiedere fino a poche ore) e quindi aggiungere un volume uguale di 4x di citrato salina-sodio (SSC)/20% dextransofato.
    1. Preparare 20 volte SSC mescolando 175,3 g di NaCl e 88,2 g di citrato di sodio in un volume finale di 1 L di H2aliquota, filtrare e preparare.
      NOTA: Per DNA FISH multicolore, le diverse sonde possono essere precipitate insieme ad eccezione delle sonde che possono anneal tra loro. In questi casi specifici, trattarli separatamente, precipitare e risospendere le sonde che dividono i reagenti menzionati nei passaggi 1.5-1.7 rispetto al numero di sonde. Raggruppare le sonde solo dopo la sospensione in formamide. Se si utilizzano copricapi di vetro con dimensioni maggiori di 10 mm o inferiori a 10 mm, scalare il volume verso l'alto o verso il basso dei reagenti utilizzati nei passaggi 1,5,1,7 in modo proporzionale alla dimensione della diapositiva. Le sonde di ibridazione possono essere conservate a -20 gradi centigradi per un lungo periodo di tempo (fino a due mesi).

2. Fissazione cellulare, pretrattamento e permeabilizzazione

NOTA: I passaggi di permeabilizzazione e deproteinizzazione sono passi cruciali. Il tempo di reazione e concentrazione dei reagenti dipende fortemente dal tipo di cellula, dall'abbondanza di citoplasma e dalla morfologia nucleare.

  1. Fissazione cellulare, pretrattamento e permeabilizzazione per i linfociti T primari dell'uomo
    NOTA: Questo protocollo è adatto per piccole cellule, con piccoli nuclei e una bassa quantità di citoplasma.
    1. Utilizzare coprivele in vetro (10 mm, spessore no. 1,5H).
    2. Lavare il bicchiere con ddH2O, quindi con il 70% EtOH e lasciarli asciugare. Utilizzare un bicchiere per ogni pozzetto di una piastra di 24 pozzetti.
    3. Aggiungere 200 L di 0,1% poli-L-lisina (w/v) (Tabella dei materiali) direttamente sul vetro per formare una goccia. Prestare attenzione come la goccia deve rimanere sulla superficie del vetro senza toccare il pozzo per 2/5 min. Lasciare fuori la goccia con attenzione, e lasciare asciugare il vetro per 30 min.
    4. Eseguire il passaggio 2.1.3 altre due volte.
    5. Mettere 200 - L di celle di sospensione (2 x 106/ mL, sospensione PBS dei linfociti A T primari osisti ex vivo) direttamente sul vetro, consentire alle cellule di seme a temperatura ambiente (RT) per 30 min.
    6. Rimuovere rapidamente la goccia. Aggiungere il 4% di PFA appena fatto (preparato in PBS/0.1% TWEEN 20, pH 7.0, filtrato) per 10 min e fissare le celle di semi a RT.
    7. Lavare tre volte per 5 min ciascuno con 0,05% Triton X-100/PBS (TPBS) a RT. Permeabilize con 0.5% TPBS per 10 min a RT.
    8. Eseguire il trattamento RNase aggiungendo 2,5 - L di cocktail RNase (Tabella dei materiali) in 250 - L di PBS/pozzo in una piastra di 24 pozze per 1 h a 37 gradi centigradi.
    9. Risciacquare in PBS, aggiungere il 20% glicerol/PBS e incubare durante la notte (ON) a 4 gradi centigradi.
      NOTA: questo passaggio può variare da 1 h a ON. I vetrini possono essere conservati in 20% glicerol/PBS a 4 gradi centigradi fino a 7 giorni.
    10. Congelare sul ghiaccio secco (15-30 s), scongelare gradualmente a RT, e immergere nel 20% glicerolo/PBS. Ripetere il passaggio 2.1.9 altre tre volte.
    11. Lavare in 0,5% TPBS per 5 min a RT. Lavaggio in 0,05% TPBS, due volte per 5 min a RT. Incubate in 0,1 N HCl per 12 min a RT. Rinse in 2x SSC.
    12. Incubare nel 50% formamide pH 7.0/2x SSC ON a RT.
      NOTA: il tempo di incubazione può essere ottimizzato e alla fine ridotto. I vetrini possono essere conservati in formamide 50% /2x SSC per diversi giorni.
  2. Fissazione cellulare, pretrattamento e permeabilizzazione per i mioblasti primari umani
    NOTA: Questo protocollo è adatto per le cellule di grandi dimensioni, con un'elevata quantità di citoplasma.
    1. Coltivare mioblasti primari umani direttamente sui bicchieri coverslip in piastre 24 pozzetti nel mezzo di crescita (Mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM), 20% siero bovino fetale (FBS), 25 ng/mL fattore di crescita fibroblasta (FGF), 10 ng/mLdermica fattore di crescita epidermica (EGF), 10 g/mL di insulina umana, 1x glutammina, 1x penicillina/streptomicina) per almeno 24 h (raggiungendo il 50-70% della confluenza).
      NOTA: Per facilitare l'adesione, la gelatina o il collagene o la poli-lisina può essere utilizzata per rivestire il coperchio prima della semazione.
    2. Risciacquare le cellule in 2-3 cambi di PBS. Aggiungere il 4% di PFA appena fatto e fissare le celle per 10 min a RT.
    3. Lavare tre volte per 3 min ciascuno nello 0,01% TPBS a RT. Permeabilize in 0.5% TPBS per 10 min a RT.
    4. Eseguire il trattamento RNase aggiungendo 2,5 - L di cocktail RNase (Tabella dei materiali) in 250 - L di PBS/pozzo in una piastra di 24 pozze per 1 h a 37 gradi centigradi.
    5. Risciacquare in PBS, aggiungere il 20% glicerol/PBS e incubare ON a RT.
      NOTA: questo passaggio può variare da 1 h a ON. I vetrini possono essere conservati in 20% glicerol/PBS a 4 gradi centigradi fino a 7 giorni.
    6. Congelare sul ghiaccio secco (15-30 s), scongelare gradualmente a RT, e immergere nel 20% glicerolo/PBS. Ripetere questo passaggio tre volte.
    7. Lavare tre volte per 10 min ciascuno in PBS. Incubare in 0.1 N HCl per 5 min a RT. Risciacquare in 2x SSC.
    8. Incubare nel 50% formamide pH 7.0/2x SSC ON a RT.
      NOTA: il tempo di incubazione può essere ottimizzato e alla fine ridotto. I vetrini possono essere conservati in formamide 50% /2x SSC per diversi giorni.
    9. Vetrine Equilibrate (conservate al 50% formamide/2x SSC) in 2x SSC per 2 min. Quindi, equilibrate in PBS per 3 min.
    10. Trattare con 0.01 N HCl/ 0.0025% pepsina da pochi secondi fino a 5 min, a seconda del tipo di cella. Durante questa fase, osservare le cellule al microscopio ottico e interrompere la reazione (passaggio 2.2.11) non appena i nuclei sono liberi dal citoplasma, mantenendo intatta la loro struttura (ad esempio, i nucleoli sono ancora visibili e intatti).
    11. Inattivare la pepsina lavando due volte per 5 min ciascuno in 50 mM MgCl2/PBS.
    12. Post-fix in 1% PFA/PBS per 1 min. Lavaggio per 5 min in PBS. Lavare due volte per 5 min ciascuno in 2x SSC, quindi aggiungere 50% formamide/2x SSC per almeno 30 min.

3. Ibridazione DNA FISH multicolore 3D

  1. Denaturare le sonde a 80 gradi centigradi per 5 min, quindi mettere rapidamente sul ghiaccio.
  2. Caricare le sonde di ibridazione su un vetrino al microscopio pulito. Ruotare il coperchio con le celle a testa in giù sulla goccia di sonde di ibridazione.
  3. Sigillare il coperchio con cemento di gomma. Lasciare asciugare completamente il cemento di gomma. Quindi posizionare i vetrini su un blocco di riscaldamento e denaturare a 75 gradi centigradi per 4 min.
    NOTA: I tempi di denaturazione e la temperatura di denaturazione possono essere aumentati, fino a 80 gradi centigradi.
  4. Ibridare a 37 gradi centigradi in una scatola metallica galleggiante in un bagno d'acqua.
    NOTA: Per migliorare il rapporto segnale/rumore, la temperatura di ibridazione può salire fino a 42 gradi centigradi.
  5. Sbucciare il cemento di gomma, immergere i vetrini in 2x SCC, togliere la coverslip di vetro e trasferirlo a 2x SSC in 6 pozzetti.
  6. Lavare in 2x SSC tre volte per 5 min ciascuno a 37 gradi centigradi, agitando a 90 giri al rinfuso in uno shaker incubatore. Lavare in 0,1 x SSC tre volte per 5 min ciascuno a 60 gradi centigradi, agitando a 90 giri in uno shaker incubatore. Risciacquare brevemente in 4x SSC/0.2% TWEEN 20.

4. Rilevamento DNA FISH multicolore 3D

NOTA: per le sonde etichettate direttamente, saltare i passaggi 4.1 e 4.2.

  1. Blocco in 4x SSC/0,2% TWEEN 20/4% di albumina di siero bovino (BSA) per 20 min a 37 gradi centigradi in un piatto di 24 pozzetti, tremando a 20 giri in uno shaker incubatore.
  2. Incubare con l'adeguata concentrazione di anti-digoxygenina (1:150) e/o streptavidin (1:1.000) (Tabella dei materiali) diluiti in 4x SSC/0,2% TWEEN 20/4% BSA per 35 min in una camera buia e umida a 37 gradi centigradi.
  3. Lavare in 4x SSC/0,2% TWEEN 20 tre volte per 5 min ciascuno a 37 gradi centigradi, agitando a 90 giri in una piastra 6-well in uno shaker di incubatrice.
  4. Equilibrio in PBS e post-fisso in 2% formaldeide/PBS per 2 min a RT in una piastra di 24 pozze.
    NOTA: le sonde etichettate direttamente non necessitano di post-fissazione.
  5. Lavare brevemente 5 volte in PBS. Macchie con 1 ng/mL DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)/PBS per 5 min a RT.
  6. Lavare brevemente 5 volte in PBS. Monta con soluzione anti-dissolvenza (Tabella dei materiali).

5. Microscopia e analisi 3D multicolore DNA FISH

  1. Acquisire immagini 3D con un sistema al microscopio.
    NOTA: In questo caso, viene utilizzato un microscopio a più ampio campo con una distanza assiale di 0,2 m 0,25 m tra sezioni consecutive (Figura 1B).
  2. Analizza gli stack di immagini 3D utilizzando diversi software e strumenti (qui, NuCL- d o Nuclear Contacts Locator in 3D).
    NOTA: L'utensile NuCL- D è stato sviluppato al fine di analizzare automaticamente 3D multicolore DNA FISH in immagine cella di fluorescenza immagine z-stack. NuCL- ricostruisce i nuclei dagli stack di immagini delle cellule in 3D, nonché rileva e localizza i punti 3D fluorescenti. Misura il posizionamento relativo dei punti nel nucleo (ad esempio, la distanza dal centroide dei nuclei e/o della periferia dei nuclei) e il raggio massimo per ogni nucleo e le distanze tra macchie. Lo strumento e l'algoritmo utilizzato sono descritti completamente in Cortesi et al.16.
  3. Analizzare i dati (ad es. distanze 3D tra i loci genomici specificati e il centroide nucleare e le frequenze di contatto) recuperati da NuCL.
    NOTA: per le distanze 3D tra i loci genomici specificati e il centroide nucleare, normalizzare le distanze sul raggio massimo per ogni nucleo e rappresentare questi dati come distribuzioni di frequenza delle distanze normalizzate dal centroide nucleare. Per gli studi sulle interazioni a lungo raggio, le frequenze di contatto dovrebbero essere nell'intervallo del 10-20%21 con una soglia inter-distanza che può variare e può essere messa intorno a 2 m35.
    1. Per eseguire analisi statistiche, analizzare circa 100 nuclei per replica biologica. Rappresentano le distanze 3D tra i loci genomici specificati come distribuzioni cumulative di frequenza delle distanze che si trovano al di sotto della soglia inter-distanza selezionata e utilizzano un test tper valutare l'importanza delle differenze nelle distribuzioni. Inoltre, calcola la percentuale di nuclei positivi per le interazioni che sono al di sotto della soglia inter-distanza selezionata e usa il test esatto di Fisher per valutare il significato delle differenze nelle percentuali.

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Risultati

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Il metodo del DNA FISH multicolore 3D descritto in questo articolo consente la visualizzazione contemporanea di diversi loci genomici all'interno dei nuclei 3D conservati (Figura 1B). Questo protocollo consente la misurazione delle distanze tra gli alleli e dei diversi loci genomici per valutarne la vicinanza spaziale e per valutarne la posizione all'interno dello spazio nucleare (ad esempio, la distanza loci dal centroide o dalla periferia dei nuclei)16

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il metodo attuale descrive un protocollo passo dopo passo per eseguire DNA FISH multicolore 3D su una vasta gamma di cellule primarie umane. Anche se DNA FISH è una tecnologia di ampio uso, 3D multicolore DNA FISH su nuclei interfase 3D conservati è ancora difficile da eseguire in molti laboratori, principalmente a causa delle caratteristiche dei campioni utilizzati23,24.

La traduzione di nick probe è un passo fondamentale per il succe...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori riconoscono l'assistenza tecnica dello strumento di imaging INGM (Istituto Nazionale di Genetica", "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM), Milano, Italia), in particolare C. Cordiglieri, per assistenza nell'arte 3D multicolore DNA FISH Acquisizione. Questo lavoro è stato sostenuto dalle seguenti sovvenzioni a B.B.: programma di punta italiano EPIGEN, Associazione Francese contre les Myopathies (AFM-Telethon, grant nr 18754) e GiovaniI, Ministero della Sanità Italiano (GR-2011-02349383). Questo lavoro è stato sostenuto dalla seguente sovvenzione a F.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastre a 24 pozzettiThermo Fisher Scientific142475
Piastre a 6 pozzettiThermo Fisher Scientific140675
Anti-Digossigenina 488DBADI7488
b-MercaptoetanoloSigmaM3148
bFGFPeproTech100-18B
Biotina 11 d-UTPThermo Fisher ScientificR0081
BSA (albumina sierica bovina)SigmaA7030
CoverlsipsMarienfeld117500
CY3 d-UTPGE HealthcarePA53022
DAPI (4,6-diamidino-2-fenilidolo)Thermo Fisher ScientificD21490
Acidi desossiribonucleici a singolo filamento da testicoli di salmoneSigmaD7656
Destrano solfato (polvere)Santa Cruzsc-203917A
Digoxigenina 11 d-UTPRoche11093088910
DMEMThermo Fisher Scientific21969-035 500mL
DNA polimerasi IThermo Fisher Scientific18010-017
DNasi ISigmaAMPD1
dNTP (C-G-A-T)EurocloneBL0423A/C/G
EGFSigmaE9644.2MG
EtanoloSigma02860-1L
FBS HycloneThermo Fisher ScientificSH30109
Soluzione di formaldeideSigmaF8775-25mL
FormamideSigmaF9037
GlutamminaThermo Fisher Scientific25030-024 100mL
GliceroloSigmaG5516-100mL
GlicogenoThermo Fisher ScientificAM9510
HClSigma30721
Human Cot-1 DNAThermo Fisher Scientific15279-001
Insulina HumanSigmaI9278-5 mL
MgCl2Sigma63069
NaAc (Acetato di sodio, pH 5,2, 3 M)SigmaS2889
NaClSigmaS9888
ParaformaldeideSigma158127-25G
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)SigmaP4417
Pennicillina/StreptavidinaThermo Fisher Scientific15070-063 100mL
PepsinaBioradP6887
PhasePrep BAC Kit DNASigmaNA0100-1KT
Soluzione di poli-L-lisinaSigmaP8920
ProLong Diamond Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36970
PureLink Estrazione rapida del gel & Kit combinato di purificazione PCRThermo Fisher ScientificK220001
PureLink Quick Plasmid Miniprep KitThermo Fisher Scientific K210010
cocktail RNAseThermo Fisher ScientificAM2288
RubbercementBostik
SlidesVWR631-0114
Streptavidina Alexa fluor 647Thermo Fisher ScientificS21374
Citrato di trisodioSigma1110379026
Tris-HClSigmaT3253-500g
Triton X-100SigmaT8787-250mL
TWEEN 20SigmaP9416-100mL

Riferimenti

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