3D Multicolor DNA FISH Tool per studiare l'architettura nucleare nelle cellule primarie umane

Federica Marasca; Alice Cortesi; Lara Manganaro; Beatrice Bodega

doi:10.3791/60712

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Articolo metodologico

3D Multicolor DNA FISH Tool per studiare l'architettura nucleare nelle cellule primarie umane

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DOI:

10.3791/60712

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25 gennaio 2020

Federica Marasca¹ , Alice Cortesi¹ , Lara Manganaro¹ , Beatrice Bodega¹

¹Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi", INGM

In questo articolo

Sommario

IL DNA FISH multicolore 3D rappresenta uno strumento per visualizzare più loci genomici all'interno dei nuclei 3D conservati, definendo inequivocabilmente le loro interazioni reciproche e la localizzazione all'interno dello spazio nucleare a livello di singola cellula. Qui, un protocollo passo dopo passo è descritto per un ampio spettro di cellule primarie umane.

Abstract

Una delle principali domande nella biologia cellulare è l'organizzazione genomica all'interno dello spazio nucleare e come l'architettura della cromatina possa influenzare processi come l'espressione genica, l'identità cellulare e la differenziazione. Molti approcci sviluppati per studiare l'architettura 3D del genoma possono essere suddivisi in due categorie complementari: tecnologie basate sulla cattura della conformazione cromosomica (tecnologie C) e imaging. Mentre il primo si basa sulla cattura della conformazione cromosomica e delle interazioni del DNA prossimale in una popolazione di cellule fisse, la seconda, basata sulla fluorescenza del DNA nell'ibridazione situ (FISH) su nuclei conservati in 3D, consente la visualizzazione contemporanea più loci a livello di singola cellula (multicolore), esaminando le loro interazioni e la distribuzione all'interno del nucleo (3D DNA multicolore FISH). La tecnica del DNA FISH multicolore 3D ha una limitazione di visualizzare solo pochi loci predeterminati, non permettendo un'analisi completa dell'architettura nucleare. Tuttavia, data la robustezza dei suoi risultati, 3D DNA FISH multicolore in combinazione con 3D-microscopia e ricostruzione dell'immagine è un possibile metodo per convalidare i risultati basati sulla tecnologia C e per studiare in modo inequivocabile la posizione e l'organizzazione di loci specifici a livello di singola cellula. Qui, proponiamo un metodo passo dopo passo di 3D multicolore DNA FISH adatto per una vasta gamma di cellule primarie umane e discutere tutte le azioni pratiche, passaggi cruciali, nozioni di imaging 3D e analisi dei dati necessari per ottenere un multicolore 3D di successo e informativo DNA FISH all'interno di diversi contesti biologici.

Introduzione

Gli eucarioti più alti devono condensare e compattare sistematicamente un'enorme quantità di informazioni genetiche nel minuto spazio 3D del nucleo¹^,²^,3^,⁴. Oggi sappiamo che il genoma è spazialmente ordinato in compartimenti e domini topologicamente associati⁵ e che i molteplici livelli di riduzione del DNA generano contatti tra diverse regioni genomiche che possono comportare la formazione di loop della cromatina⁶^,⁷. Il loop dinamico 3D della cromatina può in....