Descriviamo un metodo per la tracciatura retrograda dei motoneuroni embrionali della Drosophila usando coloranti fluorescenti lipofilici.
Articolo metodologico
Descriviamo un metodo per la tracciatura retrograda dei motoneuroni embrionali della Drosophila usando coloranti fluorescenti lipofilici.
Descriviamo una tecnica per l'etichettatura retrograda dei motoneuroni in Drosophila. Usiamo un coloranti lipofilo disciolto di olio e forniamo una piccola gocciolina a una preparazione di filetto embrionale da un microiniettore. Ogni neurone motorio la cui membrana viene contattata dalla goccia può quindi essere rapidamente etichettato. I singoli motoneuroni sono continuamente etichettati, consentendo di visualizzare chiaramente i dettagli strutturali fini. Dato che i coloranti lipofili sono disponibili in vari colori, la tecnica fornisce anche un mezzo per ottenere neuroni adiacenti etichettati in multicolore. Questa tecnica di tracciamento è quindi utile per studiare la morfogenesi neuronale e la connettività sinaptica nel sistema dei neuroni motori della Drosophila.
Il sistema di motoneuroni embrionali della Drosophila offre un potente modello sperimentale per analizzare i meccanismi alla base dello sviluppo del sistema nervoso centrale (CNS)1,2,3. Il sistema dei motoneuroni è suscettibile alle tecniche biochimiche, genetiche, di imaging ed elettrofisiologiche. Utilizzando le tecniche, le manipolazioni genetiche e le analisi funzionali possono essere effettuate a livello di singoli motoneuroni2,4,5,6.<....
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1. Attrezzature e forniture
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Un'immagine rappresentativa dei motoneuroni aCC e RP3 è mostrata nella Figura 3C per dimostrare l'etichettatura multicolore dei motoneuroni a 15 h AEL. Le loro morfologie dendritiche sono in gran parte invariabili tra gli embrioni. Il modello di colorazione ottenuto con anticorpo anti-HRP è mostrato in grigio. Una piccola goccia di DiO o DiD è stata depositata sull'NMJ del muscolo 1 o 6/7, rispettivamente. La figura 4 dimostra la capacità di mis.......
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L'uso dell'etichettatura dei coloranti per studiare la morfologia neuronale ha diversi vantaggi rispetto alle tecniche di etichettatura delle cellule genetiche. La tecnica di etichettatura dei colori può ridurre al minimo il tempo necessario per etichettare e immaginare le morfologie dei motoneuroni. Il processo di etichettatura del colore è abbastanza veloce in quanto ci vuole meno di 2 h e ci permette di definire il contorno delle proiezioni neuronali. In alternativa, si può visualizzare il neurone motore aCC scegliend.......
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamo i membri del Kamiyama Lab per i commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da un NIH R01 NS107558 (a M.I., K.B. e D.K.).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Obiettivo 10x | Nikon | Plan | |
| Obiettivo ad immersione in acqua 40x | Nikon | NIR Apo | |
| Tubo capillare | Frederick Haer& Co | 27-31-1 | |
| Microscopio confocale | Andor | N/A | Libellula Unità confocale a disco rotante |
| Vetro di copertura | Corning | 22x22 mm Quadrato #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Microscopio da dissezione | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Nastro Biadesivo | Scotch | 665 | |
| Dow Corning Grasso per Alto Vuoto | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Pinze | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Gabbia per la raccolta delle uova | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | fuori produzione | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Software di elaborazione delle immagini | |
| Micromanipolatore | Sutter | MP-225 | |
| Smussatrice per micropipette | Sutter | BV-10-B | |
| Estrattore per aghi | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Polvere di agar d'uva Pacchetti premiscelati FlyStuff | 47-102 | ||
| Filtro a rete in nylon | Millipore | ||
| Paraformaldeide 16% Soluzione, Microscopia elettronica di grado EM | Scienze | 15710 | Qualsiasi grado EM |
| PBS | Roche | 11666789001 | Venduto su sigmaaldrich, in scatola 10x soluzione |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Agente bagnante |
| Microscopio a fluorescenza verticale | Nikon | N/A | Eclipse Ci con una sorgente luminosa a LED |
| Nastro isolante in vinile | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Lievito | FlyStuff | 62-103 | Lievito secco attivo (RED STAR) |
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