Generazione di organoidi mammari mosaici per provepsinizzazione differenziale

Stefany Rubio; Oscar Cazares; Hector Macias; Lindsay Hinck

doi:10.3791/60742

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Articolo metodologico

Generazione di organoidi mammari mosaici per provepsinizzazione differenziale

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DOI:

10.3791/60742

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11 marzo 2020

Stefany Rubio¹ , Oscar Cazares¹ , Hector Macias¹ , Lindsay Hinck¹

¹Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Santa Cruz

In questo articolo

Sommario

La ghiandola mammaria è una struttura bistrato, che comprende cellule epiteliali mitraeliliali ed interne interne. Presentato è un protocollo per preparare gli organoidi utilizzando la prova differenziale. Questo metodo efficiente consente ai ricercatori di manipolare separatamente questi due tipi di cellule per esplorare le domande riguardanti i loro ruoli nella forma e nella funzione della ghiandola mammaria.

Abstract

Gli organiidi offrono strutture tissutali tridimensionali auto-organizzanti che riassumono i processi fisiologici nella comodità di un piatto. La ghiandola mammaria murina è composta da due distinti compartimenti cellulari epiteliali, che servono diverse funzioni: l'esterno, il compartimento mioeile contrattile e il compartimento luminoso interno e secretorico. Qui, descriviamo un metodo con cui le cellule che compongono questi compartimenti vengono isolate e poi combinate per studiare i loro contributi individuali di lignaggio alla morfogenesi e differenziazione della ghiandola mammaria. Il metodo è semplice ed efficiente e non richiede sofisticate tecnologie di separazione come lo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza. Invece, raccogliamo e digeriamo enzimaticamente il tessuto, seminamo l'epitelio su piatti di coltura tissutale aderenti, e poi usiamo la provadifferenziata per separare il mioepitheal dalle cellule luminali con purezza del 90%. Le cellule vengono poi placcate in una matrice extracellulare dove si organizzano in organoidi bistrato tridimensionali (3D) che possono essere differenziati per produrre latte dopo 10 giorni di coltura. Per testare gli effetti delle mutazioni genetiche, le cellule possono essere raccolte da modelli murini di tipo selvatico o geneticamente modificati, oppure possono essere geneticamente manipolate prima della coltura 3D. Questa tecnica può essere utilizzata per generare organoidi a mosaico che consentono di sapieggiare la funzione genica specificamente nel compartimento luminooso o mioepitele.

Introduzione

La ghiandola mammaria (MG) è una struttura epiteliale tubolare simile ad un albero incorporata all'interno di uno stroma ricco di adipociti. L'epitelio duttale bistrato comprende uno strato basale esterno e basale di contratture, cellule mioepiteliali (MyoEC) e uno strato interno di cellule epiteliali luminali e secretorie (LEC), che circondano un lumaro centrale¹. Durante l'allattamento, quando i myoEC esterni si contraggono per spremere il latte dai LEC dell'alveolar interno, la MG subisce numerosi cambiamenti che sono sotto il controllo dei fattori di crescita (ad esempio, EGF e FGF) e degli ormoni (ad esempio progne, insulina e prolattina).....