Method Article

Quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra Larval utilizzando la microscopia Brightfield

DOI:

10.3791/60744

⸱

February 2nd, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Department of Oncological Sciences, and Huntsman Cancer Institute, University of Utah School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui dimostriamo un metodo per quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra larvale, fornendo un modo per valutare gli effetti delle manipolazioni genetiche e farmacologiche sulla crescita e lo sviluppo del fegato.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diversi modelli transgenici di pesce zebra del carcinoma epatocellulare (HCC), l'epatomegalia può essere osservata durante le fasi precoci della larva. Quantificare le dimensioni del fegato larvale nei modelli HCC del pesce zebra fornisce un mezzo per valutare rapidamente gli effetti dei farmaci e di altre manipolazioni su un fenotipo relativo all'oncogene. Qui mostriamo come riparare le larve di pesce zebra, sezionare i tessuti che circondano il fegato, fotografare i fegati usando la microscopia a campo luminoso, misurare l'area del fegato e analizzare i risultati. Questo protocollo consente una quantificazione rapida e precisa delle dimensioni del fegato. Poiché questo metodo comporta la misurazione dell'area del fegato, può sottovalutare le differenze nel volume del fegato e sono necessarie metodologie complementari per distinguere tra i cambiamenti nelle dimensioni delle cellule e i cambiamenti nel numero di cellule. La tecnica di dissezione qui descritta è un ottimo strumento per visualizzare il fegato, l'intestino e il pancreas nelle loro posizioni naturali per una miriade di applicazioni a valle, tra cui la colorazione immunofluorescenza e l'ibridazione in situ. La strategia descritta per la quantificazione delle dimensioni del fegato larvale è applicabile a molti aspetti dello sviluppo e della rigenerazione epatica.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è la malignità primaria più comune del fegato1 e la terza causa principale di mortalità correlata al cancro2. Per comprendere meglio i meccanismi dell'epatocarcinogenesi e identificare potenziali terapie HCC, noi e altri abbiamo sviluppato pesci zebra transgenici in cui l'espressione specifica dell'epatocite di oncogeni come3,4, Kras (V12)5,6, Myc7o Yap18 porta all'HCC negli animali adulti. In questi pesci zebra, l'allargamento del fegato è notato già 6 giorni dopo la fecondazione (dpf), fornendo una piattaforma facile per testare gli effetti dei farmaci e alterazioni genetiche sulla crescita eccessiva del fegato guidato dall'oncogene. Una misurazione accurata e precisa delle dimensioni del fegato larvale è essenziale per determinare gli effetti di queste manipolazioni.

Le dimensioni e la forma del fegato possono essere valutate in modo semi-quantitativo nelle larve fisse di pesce zebra da CY3-SA etichettatura9 o in larve di pesce zebra dal vivo utilizzando giornalisti fluorescenti epatociti specifici e microscopia sesicazione fluorescenza5,6. Quest'ultimo metodo è relativamente veloce, e la sua mancanza di precisione può essere affrontata fotografando e misurando l'area di ogni fegato utilizzando il software di elaborazione delle immagini7,10. Tuttavia, può essere tecnicamente difficile posizionare uniformemente tutte le larve vive in un esperimento tale che l'area epatica bidimensionale è una rappresentazione accurata delle dimensioni del fegato. Una tecnica simile per la quantificazione delle dimensioni del fegato prevede l'utilizzo della microscopia a fluorescenza leggera per quantificare il volume epatico larvale8, che può essere più accurata per rilevare le differenze di dimensioni quando il fegato viene espanso in modo non uniforme in diverse dimensioni. Lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) può essere utilizzato per contare il numero di epatociti fluorescenti e altri tipi di cellule epatiche nei fegati larve8,11. In questo metodo, i fegati larghi sono raggruppati e dissociati, quindi le informazioni sulle dimensioni e la forma del singolo fegato vengono perse. In combinazione con un altro metodo di determinazione delle dimensioni del fegato, FACS consente la differenziazione tra aumento del numero di cellule (iperplasia) e aumento delle dimensioni della cellula (ipertrofia). Tutti questi metodi impiegano una costosa tecnologia a fluorescenza (microscopio o selezionatrice cellulare) e, fatta eccezione per l'etichettatura CY3-SA, richiedono l'etichettatura degli epatociti con un reporter fluorescente.

Qui descriviamo in dettaglio un metodo per quantificare l'area del fegato larvale del pesce zebra utilizzando la microscopia a campo luminoso e il software di elaborazione delle immagini3,12,13,14. Questo protocollo consente una quantificazione precisa dell'area dei singoli fegati in situ senza l'uso della microscopia a fluorescenza. Durante l'analisi delle dimensioni del fegato, accechiamo l'identità dell'immagine per ridurre la distorsione degli sperimentatori e migliorare il rigore scientifico15.

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Protocol

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Gli studi sugli animali sono effettuati seguendo le procedure approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università dello Utah.

1. Fissaggio larve

  1. A 3-7 giorni dopo la fecondazione (dpf), le larve di eutanasia con metanotrico tricaino (0,03%) e raccogliere fino a 15 larve in un tubo da 2 mL utilizzando una pipetta di vetro e una pompa pipetta.
  2. Lavare le larve due volte con 1 mL di freddo (4 gradi centigradi) 1x salina tampone di fosfato (PBS) sul ghiaccio. Per ogni lavaggio, rimuovere il più liquido possibile dal tubo con una pipetta di vetro e una pompa pipetta, quindi aggiungere 1 mL di PBS freddo al tubo.
  3. Rimuovere il più possibile PBS utilizzando una pipetta di vetro e una pompa pipetta, e aggiungere 1 mL di freddo (4 C) 4% paraformaldeide (PFA) in PBS.
    AVVISO: il PFA è un cancerogeno irritante e sospetto. I guanti devono essere indossati durante la movimentazione di PFA e le soluzioni concentrate devono essere maneggiate in una cappa di fumi chimici.
  4. Incubare a 4 gradi centigradi almeno durante la notte (ma fino a diversi mesi) con dondolo delicato.

2. Dissezionare i tessuti che circondano il fegato

  1. Rimuovere le larve dal PFA risciacquando 3x con 1 mL di PBS freddo (4 gradi centigradi) e dondolando per 5 min tra i risciacqui.
    NOTA: È bene mantenere le larve sciacquate in PBS per un giorno o due a 4 gradi centigradi.
  2. Pipette diverse larve in PBS in un pozzo di una teglia di vetro a fondo rotondo 9 pozzetto.
  3. Rimuovere la pelle che circonda il fegato.
    1. Utilizzare pinze sottili per trattenere la larva sulla schiena (pancia in su), afferrando su entrambi i lati della testa il più delicatamente possibile. Quindi utilizzare pinze molto sottili nell'altra mano per afferrare la pelle appena sopra il cuore.
    2. Tirare la pelle in diagonale verso la coda del pesce e il fondo del piatto sul lato sinistro o destro del pesce. Ripetere l'operazione per l'altro lato (destro o sinistro).
    3. Continuare a afferrare lembi di pelle e tirare verso il basso / indietro fino a quando tutta la pelle e melanofori sovrastanti o vicino al fegato sono stati rimossi.
  4. Rimuovere il tuorlo, se presente.
    1. Per 5-6 larve dpf, sollevare il tuorlo in un unico pezzo tenendo il pesce con pinze sottili sulla schiena e utilizzando le pinze molto sottili per spingere delicatamente il tuorlo.
    2. Per 3-4 larve dpf, raschiare il tuorlo a pezzi. Tenere il pesce con pinze sottili sulla schiena e utilizzare le pinze molto sottili per accarezzare il tuorlo, a partire dal lato ventrale.
  5. Mettere le larve sezionate in PBS freddo fresco utilizzando una pipetta di vetro e una pompa pipetta.

3. Imaging

  1. Per montare le larve, versare qualche mL di cellulosa metilica del 3% sul coperchio di un piatto di Petri di plastica pulita.
  2. Utilizzare una pipetta di vetro e una pompa pipetta per aggiungere larve alla cellulosa metile, aggiungendo il minor numero possibile di PBS alle larve.
  3. Sotto un microscopio sezionato a bassa ingrandimento, utilizzare pinze sottili per orientare i pesci in modo che siano posati sul loro lato destro, rivolto a sinistra.
    NOTA: Assicurarsi che i pesci siano perfettamente orientati su un fianco o che le misurazioni del fegato non siano accurate.
  4. Scatta una foto di ogni pesce.
    1. Verificare che il pesce da fotografare sia perfettamente allineato, con un occhio direttamente sopra l'altro occhio. Se necessario, utilizzare pinze sottili per toccare leggermente sulla testa o sulla coda dei pesci per regolare l'orientamento. Se la coda del pesce è piegata, rimuovere la coda pizzicandola con forza con pinze per rimuoverla in modo che il pesce si stende piatta.
    2. Ingrandire l'ingrandimento elevato e concentrarsi sul fegato, facendo in modo che il contorno del fegato è chiaramente visibile.
    3. Scattare una foto e salvare il file.
    4. Ripetere l'operazione per tutti i pesci, assicurandosi che l'ingrandimento sia lo stesso per ogni immagine.
    5. Scattare una foto di un micrometro utilizzando lo stesso ingrandimento (vedere Figura 2H).

4. Analisi dell'immagine

  1. Misurare l'area del fegato di ogni pesce utilizzando il software di elaborazione delle immagini.
    1. Cieco tutte le immagini di fegato per evitare potenziali pregiudizi investigatori e promuovere il rigore scientifico15. Questo passaggio può essere eseguito manualmente da un altro membro del laboratorio o utilizzando un programma per computer (Supplementary Material). Rinominare i file in modo casuale e creare un "file di randomizzazione" contenente un elenco dei nomi di file originali e corrispondenti nomi di file accecati.
    2. Aprire i file randomizzati in ordine, a partire dal file 1.
    3. Scegliere lo strumento selezioni a mano libera e delineare ogni fegato.
    4. Premere Ctrl-M per misurare l'area di ogni fegato.
    5. Per tutti i fegati che non possono essere misurati con precisione, inserire una misura segnaposto (molto piccola o molto grande, quindi può essere facilmente esclusa in seguito).
    6. Salvare le misure in un file di testo ("file di misurazioni").
  2. Un-blind e analizzare i dati
    1. Aprire "file di misurazione" e "file di randomizzazione" in un foglio di calcolo.
    2. Inserire una nuova colonna nel "file di misurazione" e aggiungere i nomi dei file originali per i file accecati, utilizzando il "file di randomizzazione". Salvare il file come "file di misure non cieche".
    3. Ordinare i dati in base al nome file originale.
    4. Assicurarsi di escludere eventuali misurazioni epatiche per le quali le immagini erano inadeguate (vedere figura 2A–G).
    5. Se necessario, convertire i valori di misurazione nella scala desiderata (mm2, ad esempio).
      1. Aprire la barra della scala nel software di elaborazione delle immagini.
      2. Utilizzare lo strumento linea retta per misurare 1 mm sulla barra della scala. Il software di elaborazione delle immagini misurerà nelle stesse unità dei fegati (pixel), dando un fattore di conversione.
      3. Utilizzare il fattore di conversione per convertire le misurazioni nel "file di misure non cieche".
    6. Utilizzando il programma per fogli di calcolo o incollando i dati in un software scientifico di grafici e statistiche, determinare la media e la deviazione standard e calcolare i valori p.

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Results

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Pesci zebra transgenici che esprimono l'epatocite specifico attivato a z-catenina(Tg(fabp10a:pt-z-cat) pesce zebra)3 e i fratelli di controllo non transgenici sono stati eutanasiati a 6 dpf e l'area del fegato è stata quantificata utilizzando un software di microscopia e elaborazione delle immagini a campo luminoso. I pesci zebra transgenici hanno aumentato significativamente le dimensioni del fegato (0,0006 cm2) rispetto ai loro fratelli non transgenici (0,0004 cm

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Discussion

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Quantificazione della dimensione del fegato è cruciale negli studi volti a comprendere lo sviluppo del fegato, rigenerazione, e oncogenesi. Il protocollo qui descritto è una tecnica relativamente rapida, facile ed economica per la quantificazione delle dimensioni del fegato nel pesce zebra larvale. L'esercizio di un'adeguata cautela durante l'esecuzione di determinati aspetti del protocollo può aiutare a migliorare la precisione dei risultati e a ridurre la frustrazione.

Una corretta fissazion...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorremmo riconoscere Maurine Hobbs e la Centralit zebrefish Animal Resource dell'Università dello Utah per aver fornito allevamento di pesci zebra, spazi di laboratorio e attrezzature per svolgere porzioni di questa ricerca. L'espansione del cSAR è supportata in parte dalla sovvenzione NIH - 1G20OD018369-01. Ringraziamo anche Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum e il Huntsman Cancer Institute (HCI) zebrefish Facility per la cura del pesce zebra. Vorremmo ringraziare Kenneth Kompass per l'aiuto con la programmazione R. Questo lavoro è stato finanziato in parte dalle sovvenzioni della Huntsman Cancer Foundation (in collaborazione con la sovvenzione P30 CA042014 assegnata al Huntsman Cancer Institute) (KJE) e NIH/NCI R01CA222570 (KJE).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Telecamera per microscopio da dissezioneLeica, ad esempio
Microscopio da dissezioneLeica, ad esempio
Fine (Dumont #5) pinzaFine Science Tools11254-20
Pipette in vetroVWR14672-608
Software di analisi delle immaginiImmagine J/FIJIImageJ/FIJI può essere scaricato gratuitamente: https://imagej.net/Welcome
MetilcellulosaSigmaM0387
ParaformaldeideSigma AldrichP6148
Soluzione salina tamponata con fosfatoFornitori
Pompa per pipetteVWR53502-233
Piastre di Petri in plasticaUSA Scientific Inc2906
Pyrex Piastra in vetro a fondo tondo a 9 pozzettiVWR89090-482
Software per l'accecamento dei fileR projectR può essere scaricato gratuitamente: https://www.r-project.org/
Software scientifico per grafici e statisticheGraphPad Prism
Foglio di calcolo MicrosoftExcel
Tricaina metanesolfonato (Tricaina-S)Western Chemical200-226
Molto fine (Dumont #55) pinzaFine Science Tools11255-20
vari

References

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