Qui dimostriamo un metodo per quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra larvale, fornendo un modo per valutare gli effetti delle manipolazioni genetiche e farmacologiche sulla crescita e lo sviluppo del fegato.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra Larval utilizzando la microscopia Brightfield
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
In diversi modelli transgenici di pesce zebra del carcinoma epatocellulare (HCC), l'epatomegalia può essere osservata durante le fasi precoci della larva. Quantificare le dimensioni del fegato larvale nei modelli HCC del pesce zebra fornisce un mezzo per valutare rapidamente gli effetti dei farmaci e di altre manipolazioni su un fenotipo relativo all'oncogene. Qui mostriamo come riparare le larve di pesce zebra, sezionare i tessuti che circondano il fegato, fotografare i fegati usando la microscopia a campo luminoso, misurare l'area del fegato e analizzare i risultati. Questo protocollo consente una quantificazione rapida e precisa delle dimensioni del fegato. Poiché questo metodo comporta la misurazione dell'area del fegato, può sottovalutare le differenze nel volume del fegato e sono necessarie metodologie complementari per distinguere tra i cambiamenti nelle dimensioni delle cellule e i cambiamenti nel numero di cellule. La tecnica di dissezione qui descritta è un ottimo strumento per visualizzare il fegato, l'intestino e il pancreas nelle loro posizioni naturali per una miriade di applicazioni a valle, tra cui la colorazione immunofluorescenza e l'ibridazione in situ. La strategia descritta per la quantificazione delle dimensioni del fegato larvale è applicabile a molti aspetti dello sviluppo e della rigenerazione epatica.
Introduzione
Il carcinoma epatocellulare (HCC) è la malignità primaria più comune del fegato1 e la terza causa principale di mortalità correlata al cancro2. Per comprendere meglio i meccanismi dell'epatocarcinogenesi e identificare potenziali terapie HCC, noi e altri abbiamo sviluppato pesci zebra transgenici in cui l'espressione specifica dell'epatocite di oncogeni come3,4, Kras (V12)5,6, Myc7o Yap18 porta all'HCC negli animali adulti. In questi pesci zebra, l'allargame....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Gli studi sugli animali sono effettuati seguendo le procedure approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università dello Utah.
1. Fissaggio larve
- A 3-7 giorni dopo la fecondazione (dpf), le larve di eutanasia con metanotrico tricaino (0,03%) e raccogliere fino a 15 larve in un tubo da 2 mL utilizzando una pipetta di vetro e una pompa pipetta.
- Lavare le larve due volte con 1 mL di freddo (4 gradi centigradi) 1x salina tampone di fosfato (PBS) sul ghiaccio. Per ogni lavaggio, rimuovere il più liquido possibile dal tubo con una pipetta di vetro e una pompa pipetta, quindi aggiungere 1 mL di PBS....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Pesci zebra transgenici che esprimono l'epatocite specifico attivato a z-catenina(Tg(fabp10a:pt-z-cat) pesce zebra)3 e i fratelli di controllo non transgenici sono stati eutanasiati a 6 dpf e l'area del fegato è stata quantificata utilizzando un software di microscopia e elaborazione delle immagini a campo luminoso. I pesci zebra transgenici hanno aumentato significativamente le dimensioni del fegato (0,0006 cm2) rispetto ai loro fratelli non transgenici (0,0004 cm
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Quantificazione della dimensione del fegato è cruciale negli studi volti a comprendere lo sviluppo del fegato, rigenerazione, e oncogenesi. Il protocollo qui descritto è una tecnica relativamente rapida, facile ed economica per la quantificazione delle dimensioni del fegato nel pesce zebra larvale. L'esercizio di un'adeguata cautela durante l'esecuzione di determinati aspetti del protocollo può aiutare a migliorare la precisione dei risultati e a ridurre la frustrazione.
Una corretta fissazion.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo riconoscere Maurine Hobbs e la Centralit zebrefish Animal Resource dell'Università dello Utah per aver fornito allevamento di pesci zebra, spazi di laboratorio e attrezzature per svolgere porzioni di questa ricerca. L'espansione del cSAR è supportata in parte dalla sovvenzione NIH - 1G20OD018369-01. Ringraziamo anche Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum e il Huntsman Cancer Institute (HCI) zebrefish Facility per la cura del pesce zebra. Vorremmo ringraziare Kenneth Kompass per l'aiuto con la programmazione R. Questo lavoro è stato finanziato in parte dalle sovvenzioni della Huntsman Cancer Foundation (in collaborazione con la so....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Telecamera per microscopio da dissezione | Leica, ad esempio | ||
| Microscopio da dissezione | Leica, ad esempio | ||
| Fine (Dumont #5) pinza | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Pipette in vetro | VWR | 14672-608 | |
| Software di analisi delle immagini | Immagine J/FIJI | ImageJ/FIJI può essere scaricato gratuitamente: https://imagej.net/Welcome | |
| Metilcellulosa | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldeide | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Fornitori | ||
| Pompa per pipette | VWR | 53502-233 | |
| Piastre di Petri in plastica | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex Piastra in vetro a fondo tondo a 9 pozzetti | VWR | 89090-482 | |
| Software per l'accecamento dei file | R project | R può essere scaricato gratuitamente: https://www.r-project.org/ | |
| Software scientifico per grafici e statistiche | GraphPad Prism | ||
| Foglio di calcolo Microsoft | Excel | ||
| Tricaina metanesolfonato (Tricaina-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Molto fine (Dumont #55) pinza | Fine Science Tools | 11255-20 |
Riferimenti
- Lin, D. -C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
- Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
