Mappatura del circuito a lungo raggio assistita da Channelrhodopsin dei neuroni Colliculus inferiori con Channelrhodopsins blu e rosso

David Goyer; Michael T. Roberts

doi:10.3791/60760

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Articolo metodologico

Mappatura del circuito a lungo raggio assistita da Channelrhodopsin dei neuroni Colliculus inferiori con Channelrhodopsins blu e rosso

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DOI:

10.3791/60760

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7 febbraio 2020

David Goyer¹ , Michael T. Roberts¹

¹Kresge Hearing Research Institute, Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Michigan

In questo articolo

Sommario

La mappatura dei circuiti assistiti da channelrhodopsin (CRACM) è una tecnica di precisione per la mappatura funzionale delle proiezioni neuronali a lungo raggio tra gruppi di neuroni anatomicamente e/o geneticamente identificati. Qui, descriviamo come utilizzare CRACM per mappare le connessioni uditive del tronco, incluso l'uso di un opsin in rosso, ChrimsonR.

Abstract

Quando si studiano i circuiti neurali, una limitazione standard dell'approccio di morsetto patch in vitro è che gli assoni provenienti da più fonti sono spesso intermixed, rendendo difficile isolare gli input da singole fonti con stimolazione elettrica. Tuttavia, utilizzando channelrhodopsin assistited circuit mapping (CRACM), questa limitazione può ora essere superata. Qui, riportiamo un metodo per utilizzare CRACM per mappare gli input ascendenti da nuclei del tronco encefalico meno bassi uditivi e input commissurali a una classe identificata di neuroni nel collicolo inferiore (IC), il nucleo midbrain del sistema uditivo. Nell'IC, gli assoni locali, commissri, ascendenti e discendenti sono fortemente intrecciati e quindi indistinguibili dalla stimolazione elettrica. Iniettando un costrutto virale per guidare l'espressione di una channelrhodopsin in un nucleo presintatico, seguita dalla registrazione dei blocchi di patch per caratterizzare la presenza e la fisiologia degli ingressi sinaptici che esprimono channelrhodopsin, proiezioni da una fonte specifica a una popolazione specifica di neuroni IC possono essere mappati con precisione specifica del tipo di cellula. Dimostriamo che questo approccio funziona sia con Chronos, una channelrhodopsin ad attivazione della luce blu, sia con ChrimsonR, una channelrhodopsin con cambio rosso. In contrasto con i precedenti rapporti dal prosencefalo, troviamo che ChrimsonR è robustamente trafficato lungo gli assi dei neuroni principali del nucleo cocleare dorsale, indicando che ChrimsonR può essere uno strumento utile per gli esperimenti CRACM nel tronco encefalico. Il protocollo qui presentato include descrizioni dettagliate della chirurgia di iniezione di virus intracranico, incluse le coordinate stereotassiche per indirizzare le iniezioni al nucleo cocleare dorsale e all'IC dei topi, e come combinare la registrazione dei morsetti a tutta cella con attivazione della channelrhodopsin per studiare le proiezioni a lungo raggio ai neuroni IC. Anche se questo protocollo è adattato per caratterizzare gli input uditivi all'IC, può essere facilmente adattato per studiare altre proiezioni a lungo raggio nel tronco encefalico uditivo e oltre.

Introduzione

Le connessioni sinaptiche sono fondamentali per la funzione del circuito neurale, ma la topologia precisa e la fisiologia delle sinapsi all'interno dei circuiti neurali sono spesso difficili da sondare sperimentalmente. Questo perché la stimolazione elettrica, lo strumento tradizionale dell'elettrofisiologia cellulare, attiva indiscriminatamente gli assoni vicino al sito di stimolazione, e nella maggior parte delle regioni cerebrali, gli assoni provenienti da fonti diverse (locali, ascendenti e/o discendenti) si intrecciano. Tuttavia, utilizzando channelrhodopsin assisted circuit mapping (CRACM)¹^,², questa lim....