Crescita degli strati cellulari endoteliali umani e ovini sulle membrane biomateriali

Sommario

Questo protocollo descrive i passaggi critici necessari per stabilire e coltivare colture di cellule endoteliali corneali da espianti di tessuto umano o o novino. Viene inoltre presentato un metodo per la subcultura delle cellule endoteliali corneali su biomateriali membranosi.

Abstract

Le colture di cellule endoteliali corneali tendono a subire la transizione epiteliale-mesenchica (EMT) dopo la perdita del contatto tra cellule. EMT è deleterio per le cellule in quanto riduce la loro capacità di formare uno strato maturo e funzionale. Qui, presentiamo un metodo per stabilire e sottraire le colture endoteliali umane e ovine che riduce al minimo la perdita di contatto tra cellule. Gli espianti della membrana dell'endotelio/Descemet vengono prelevati dalle cornee dei donatori e messi in coltura dei tessuti in condizioni che consentono alle cellule di migrare collettivamente sulla superficie di coltura. Una volta che una cultura è stata stabilita, gli espianti vengono trasferiti in piastre fresche per avviare nuove culture. Dispase II viene utilizzato per sollevare delicatamente ciuffi di cellule dalle piastre di coltura dei tessuti per una subcultura. Le colture di cellule endoteliali eteliali che sono state stabilite utilizzando questo protocollo sono adatte per il trasferimento a membrane biomateriali per produrre strati cellulari tessuti-ingegnerizzati per il trapianto in sperimentazioni animali. Viene descritto un dispositivo su misura per sostenere le membrane biomateriali durante la coltura dei tessuti e viene presentato un esempio di innesto di tipo tessuto composto da uno strato di cellule endoteliali corneali e da uno strato di cellule stromali corneali su entrambi i lati di una membrana di collagene di tipo I.

Introduzione

La cornea è un tessuto trasparente che si trova nella parte anteriore dell'occhio. È composto da tre strati principali: uno strato epiteliale sulla superficie esterna, uno strato di stroma medio e uno strato interno chiamato endotelio corneale. L'endotelio cornealeè è un monostrato di cellule che si trova su una membrana seminterrato chiamata membrana di Descemet e mantiene la trasparenza della cornea regolando la quantità di liquido che entra nello stroma dall'umorismo acquoso sottostante. Troppo fluido all'interno dello stroma provoca gonfiore corneale, opacità e perdita della vista. L'endotelio è quindi vitale per mantenere la visione.

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Protocollo

Le cornee umane con il consenso del donatore per la ricerca sono state ottenute dalla Queensland Eye Bank e utilizzate con l'approvazione etica del Comitato Etico della Ricerca Umana del Metro South Hospital and Health Service (HREC/07/QPAH/048). Le cornee di pecora sono state ottenute da animali eutanasia presso l'Herston Medical Research Facility dell'Università del Queensland in base a un accordo di condivisione dei tessuti.

1. Preparazione degli strumenti di dissezione

1. Sterilizzare due coppie di pinze da orologiaio numero 4 sia immergendoli in una soluzione di 70% etanolo per 5 min o autoclaving loro.

Risultati

Il metodo per isolare ed espandere le cellule endoteliali corneali da cornee umane o pecore è riepilogato nella Figura 1 e Figura 2. La maggior parte delle espianti che derivano dalle cornee da 1 a 2 anni o donatori umani di età inferiore ai 30 anni si attaccano alle piastre di coltura dei tessuti rivestiti di fattore di attacco entro una settimana, tuttavia, non è insolito scoprire che fino a un terzo degli espianti non riescano ad attaccarsi entro questo perio.......

Discussione

Una sfida tecnica significativa associata alla creazione e all'espansione delle cellule endoteliali corneali umane impedisce che si verifichino EMT nelle colture. EMT può essere attivato nelle cellule endoteliali corneali dalla perdita di contatto cellulare-cellulare, ma la maggior parte dei protocolli di coltura cellulare per queste cellule comporta la dissociazione enzimatica a singole cellule durante l'isolamento e la sottocultura¹⁰. Qui presentiamo un protocollo alternativo di coltura cellular.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fattore di attacco	Gibco	S006100	Una soluzione sterile 1X contenente gelatina che viene utilizzata per rivestire le superfici di coltura dei tessuti. Conservare a 4 °C.
Estratto ipofisario bovino	Gibco	13028014	Un singolo flaconcino contiene 25 mg. Congelare in aliquote.
Cloruro di calcio	Merck	C5670	Sciogliere in HBSS per ottenere una soluzione madre da 1 mM. Filtro sterilizzare.
Provetta da centrifuga, 50 ml	Labtek	650.550.050
Solfato di condroitina	LKT Laboratories	C2960	Questo è solfato di condroitina bovina. Sciogliere in HBSS per ottenere una soluzione madre da 0,08 g/mL. Filtrare, sterilizzare e congelare in aliquote.
Dispase II	Gibco	17105-041	Sciogliere in DPBS per ottenere una soluzione madre da 2 mg/mL. Filtrare, sterilizzare e congelare in aliquote.
Etanolo	Labtek	EA043	100% etanolo non denaturato deve essere diluito al 70% in acqua deionizzata per la sterilizzazione di strumenti e superfici.
Siero bovino fetale	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	Questo è un marchio HyClone di siero bovino fetale.
Coverglass No. 1, Ø 13 mm	Proscitech	G401-13	Posizionare i vetrini di copertura sterilizzati in piastre a 24 pozzetti per la coltura dei tessuti.
HBSS	Gibco	14025-092	Soluzione salina bilanciata di Hank, 1X, contenente cloruro di calcio e cloruro di magnesio.
Acido L-ascorbico 2-fosfato	Merck	A8960	Sciogliere in HBSS per ottenere una soluzione madre da 150 mM. Filtro sterilizzare.
Micro-Boyden camera	CNC Components Pty. Ltd.	Anello superiore: QUT-0002-0006, Anello base: QUT-0002-0007	Entrambi i componenti sono realizzati in politetrafluoroetilene (PTFE).
O-ring per camera micro-Boyden	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Composto da gomma siliconica.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	Un terreno di siero ridotto contenente glutammina.
DPBS	Gibco	14190-144	Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, 1X, senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio.
Pen Strep	Gibco	15140-122	Una soluzione antibiotica 100X contenente 10.000 Unità/mL di penicillina e 10.000 µ g/mL di streptomicina.
Piastra di Petri	Sarstedt	82.14473.001	Piastra di Petri sterile, 92 X 16 mm, per dissezione tissutale.
Piastra per coltura tissutale, 24 pozzetti	Corning Incorporated	Costar 3524	Una piastra contenente 24 pozzetti, ciascuno con una superficie di 2 cm2.
Piastra per coltura tissutale, 6 pozzetti	Corning Incorporated	Costar 3516	Una piastra contenente 6 pozzetti, ciascuno con una superficie di 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	Una soluzione enzimatica 1X per la dissociazione delle cellule.
Versene	Gibco	15040-066	Una soluzione EDTA 1X per la dissociazione delle cellule.
Pinza per orologiaio	Labtek	BWMF4	La pinza per orologiaio numero 4 funziona bene per rimuovere strisce di endotelio/membrana di Descemet dalle cornee.