Qui, presentiamo un metodo per visualizzare l'assorbimento di 3 kDa Texas Red-etichetta tono in cellule ciliate uditive con canali di meccanotrazione funzionali. Inoltre, dextrans di 3-10 kDa può essere utilizzato per studiare l'endocitosi nei capelli e le cellule di supporto dell'organo di Corti.
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Articolo metodologico
Etichette e acquisizioni Dextran nelle cellule dei capelli Murine Cochlear dal vivo e funzionali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il canale mechanotransduzione delle cellule ciliate (MET) svolge un ruolo importante nell'udito. Tuttavia, l'identità molecolare e le informazioni strutturali del MET rimangono sconosciute. Studi elettrofisiologici sulle cellule ciliate hanno rivelato che il canale MET ha una grande conduttanza ed è permeabile a molecole cazionali fluorescenti relativamente grandi, tra cui alcuni coloranti di stiryl e antibiotici aminoglycoside etichettati con marchio rosso texas. In questo protocollo, descriviamo un metodo per visualizzare e valutare l'assorbimento di dextrans fluorescente nelle cellule ciliate dell'organo di espianti Corti che può essere utilizzato per testare i canali MET funzionali. Abbiamo scoperto che 3 kDa Texas Red-labeld è etichettato specificamente sulle cellule ciliate uditive funzionali dopo l'incubazione di 1-2 h. In particolare, 3 kDa dextran etichetta le due file stereocilia più corte e si accumula nel corpo cellulare in un modello diffuso quando sono presenti canali MET funzionali. Un ulteriore modello vescino-come di etichettatura è stato osservato nel corpo cellulare delle cellule ciliate e circostante le cellule di supporto. I nostri dati suggeriscono che 3 kDa Texas-Red dextran può essere utilizzato per visualizzare e studiare due percorsi per l'assorbimento del coloranti cellulare; un percorso di ingresso specifico per le cellule di capelli attraverso canali MET funzionali e l'endocitosi, un modello disponibile anche per dextran più grandi.
Introduzione
Le cellule ciliate dell'orecchio interno sono le cellule sensoriali che rilevano il suono e coprono gli stimoli meccanici nei segnali elettrici, che alla fine vengono interpretati dal nostro cervello. Queste celle hanno un fascio a forma di scala di tre file di filamenti a base di actina, noto come stereocilia, che sporgono dalla loro regione apicale1,2. Gli stimoli meccanici deviano i filamenti di stereocilia verso la fila più lunga e innescano l'apertura della meccanotransduzione (MET) canali3. L'apertura dei canali MET porta ad un afflusso di cations che depolarizza la cellula e di c....
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Protocollo
Le procedure di cura e sperimentazione degli animali sono state eseguite seguendo le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, che sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Istituto nazionale di disturbi neurologici e ictus (protocollo animale #1336 a KJS).
1. Topi
- Impostare un paio di coppie riproduttive di tipo C57BL/6J per riprodursi nella struttura animale per controllare la data di nascita delle cucciolate e tenere traccia dell'età dei cuccioli.
2. Dissezione cocleae
- Impostare uno spazio pulito vicino a uno stereoscopio per eseguire....
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Risultati
Abbiamo osservato un'etichettatura robusta e specifica delle cellule ciliate dopo l'incubazione di 2h di organi di espianti Corti da topi postnatali-giorno-6 (P6) di tipo selvaggio con 3 kDa dextran fluorescente etichettati con Texas Red (dextran-TR) (Figura 2A-B). L'etichettatura Dextran è stata osservata nelle cellule ciliate interne ed esterne (IHC e OHC) nelle regioni basale, centrale e apicale dell'organo di Corti(Figura 2B).
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Discussione
Questo protocollo descrive come eseguire esperimenti di assorbimento nell'organo murno degli esoti di Corti con 3 kDa dextran Texas Red. L'obiettivo di questo metodo è quello di verificare se le molecole più grandi di altre precedentemente testate sono state anche in grado di etichettare specificamente le cellule ciliate uditive e permeare attraverso il canale MET. Protocolli sperimentali simili sono stati precedentemente utilizzati per valutare la permeabilità delle cellule ciliate ad altri coloranti fluorescenti come F.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Vincent Schram del nucleo di microscopia e imaging NICHD per aver aiutato nell'acquisizione di immagini confocali, e Tsg-Hui Chang per un aiuto inestimabile con la gestione delle cozioni e la cura dei topi. Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di Ricerca Intramurale del NINDS, NIH, Bethesda, MD, a K.J.S. A.B. è stata supportata dal Programma di Ricerca Intramurale del NINDS, NIH, e da una Robert Wenthold Postdoctoral Fellowship del programma di ricerca intramurale del NIDCD.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| #1.5 vetrini coprioggetti 18mm | Warner Instruments | 64-0714 | |
| Alexa Fluor 488 Falloidina | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Falloidina | ThermoFisher | A12381 | |
| alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 obiettivo | Carl Zeiss | 420780-9970-000 | |
| Amiloride cloridrato | EMD MILLIPORE | ||
| Benchwaver 3-dimensional Rocker | Benchmarks B3D5000 | ||
| C57BL/6J ceppo di topi wild-type | 000664 | The Jackson | |
| Cell imperentato BAPTA sale tetrapotassico | ThermoFisher | B1204 | |
| Destrano, fluoresceina, 10.000 MW, anionico, lisina TermoFisher fissabile | D1820 | ||
| Dextran, Texas Red, 10.000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1863 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D3328 | |
| Formaldeide Soluzione acquosa EM Grade Microscopia | elettronica | 15710 | |
| HBSS, calcio, magnesio, no fenolo rosso | ThermoFisher | 14025 | |
| HBSS, no calcio, no magnesio, no fenolo rosso | ThermoFisher | 14170 | |
| Immagine J o FIJI | NIH | http://fiji.sc/ | |
| Immersol 518F mezzi di immersione in olio | Carl Zeiss | 444970-9000-000 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31415029 | |
| neomicina trisolfato sale idrato | Sigma | N6386 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011069 | |
| Phalloidin-CF405M | Biotium | 00034 | |
| ProLong Diamond antifade mezzi di montaggio | ThermoFisher | P36970 | |
| superfrost plus vetrino per microscopio | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Software Zen Black 2.3 SP1 | Carl Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |
Riferimenti
- Furness, D. N., Hackney, C. M. The Structure and Composition of the Stereociliary Bundle of Vertebrate Hair Cells. , Springer. New York. (2006).
- Barr-Gillespie, P. G. Assembly of hair bundles, an amazing problem for cell biology. Molecular Biology of the Cell. 2....
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Ristampe e permessi
