Articolo metodologico

Etichette e acquisizioni Dextran nelle cellule dei capelli Murine Cochlear dal vivo e funzionali

DOI:

10.3791/60769

⸱

8 febbraio 2020

 , 
1Molecular Physiology and Biophysics Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un metodo per visualizzare l'assorbimento di 3 kDa Texas Red-etichetta tono in cellule ciliate uditive con canali di meccanotrazione funzionali. Inoltre, dextrans di 3-10 kDa può essere utilizzato per studiare l'endocitosi nei capelli e le cellule di supporto dell'organo di Corti.

Abstract

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Il canale mechanotransduzione delle cellule ciliate (MET) svolge un ruolo importante nell'udito. Tuttavia, l'identità molecolare e le informazioni strutturali del MET rimangono sconosciute. Studi elettrofisiologici sulle cellule ciliate hanno rivelato che il canale MET ha una grande conduttanza ed è permeabile a molecole cazionali fluorescenti relativamente grandi, tra cui alcuni coloranti di stiryl e antibiotici aminoglycoside etichettati con marchio rosso texas. In questo protocollo, descriviamo un metodo per visualizzare e valutare l'assorbimento di dextrans fluorescente nelle cellule ciliate dell'organo di espianti Corti che può essere utilizzato per testare i canali MET funzionali. Abbiamo scoperto che 3 kDa Texas Red-labeld è etichettato specificamente sulle cellule ciliate uditive funzionali dopo l'incubazione di 1-2 h. In particolare, 3 kDa dextran etichetta le due file stereocilia più corte e si accumula nel corpo cellulare in un modello diffuso quando sono presenti canali MET funzionali. Un ulteriore modello vescino-come di etichettatura è stato osservato nel corpo cellulare delle cellule ciliate e circostante le cellule di supporto. I nostri dati suggeriscono che 3 kDa Texas-Red dextran può essere utilizzato per visualizzare e studiare due percorsi per l'assorbimento del coloranti cellulare; un percorso di ingresso specifico per le cellule di capelli attraverso canali MET funzionali e l'endocitosi, un modello disponibile anche per dextran più grandi.

Introduzione

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Le cellule ciliate dell'orecchio interno sono le cellule sensoriali che rilevano il suono e coprono gli stimoli meccanici nei segnali elettrici, che alla fine vengono interpretati dal nostro cervello. Queste celle hanno un fascio a forma di scala di tre file di filamenti a base di actina, noto come stereocilia, che sporgono dalla loro regione apicale1,2. Gli stimoli meccanici deviano i filamenti di stereocilia verso la fila più lunga e innescano l'apertura della meccanotransduzione (MET) canali3. L'apertura dei canali MET porta ad un afflusso di cations che depolarizza la cellula e di conseguenza segnala il rilascio di vescicoli sinapsi nella regione basale della cellula ciliata.

Le proprietà biofisiche del canale MET essenziali per l'udito sono state ampiamente caratterizzate. Tra le altre proprietà, questi canali sono cationic selettivo e hanno una conduttanza relativamente grande (150-300 pS in basso Ca2 ,)4,5,6,7,8,9,10. Sorprendentemente, grandi molecole fluorescenti come FM1-43 e Texas Red-etichettato aminoglycosides sono permeant bloccanti del canale MET, con conseguente loro accumulo nel corpo delle cellule dei capelli che può essere visualizzato utilizzando la microscopia a fluorescenza11,12,13,14. Al contrario, l'identità molecolare e la struttura del canale MET e il suo percorso di permeazione sono rimasti sfuggentemente. Sempre più prove sperimentali indicano che la proteina del canale transmembrana 1 (TMC1) è un componente del canale MET nelle cellule ciliate mature15,16,17,18,19. Le mutazioni nel canale 1 (TMC1) simile alla transmembrana alterano le proprietà del canale MET19,20,21,22 e causano sordità. Inoltre, TMC1 localizza al sito del canale MET18,23 e interagisce con il tip-link responsabile della trasmissione della forza meccanica al canale MET24,25. Inoltre, una recente analisi bioinformatica ha identificato le proteine TMC come evolutive relative ai canali meccanosensibili tMEM63/OSCA e alle proteine TMEM16, una famiglia di canali di cloruro attivati dal calcio e scramblases lipidici26,27,28. Un modello strutturale di TMC1 basato sulla relazione tra queste proteine ha rivelato la presenza di una grande cavità all'interfaccia proteina-lipidico27. Questa cavità ospita le due mutazioni di TMC1 che causano la perdita dell'udito autosomica dominante (DFNA36)27,29,30,31,32, e la modifica selettiva dei mutanti di cisteina per i residui nelle proprietà del canale MET della cavità28, indicando che potrebbe funzionare come percorso di permeazione del canale MET. Le grandi dimensioni di questa cavità prevista nelle proteine TMC potrebbero spiegare la capacità di molecole di grandi dimensioni di permeare il canale MET. Per testare la previsione che il canale MET contenga un percorso di permeazione insolitamente grande e per spingere i limiti delle dimensioni della cavità osservata in TMC1, abbiamo sviluppato un protocollo per eseguire esperimenti di assorbimento nell'organo di Antipiante di Corti con una molecola più grande, 3 kDa dextran fluorescente etichettata con Texas Red.

Dextran è un complesso polisaccaride ramificato composto da molte molecole di D-glucosio legate da collegamenti alfa-1,6 glicosidici. La sua elevata solubilità nell'acqua, la bassa tossicità cellulare e la bioinertità lo rendono uno strumento versatile per studiare diversi processi cellulari. Inoltre, dextran è disponibile in una vasta gamma di dimensioni e fluorescente etichettato con fluorofori di diversi colori. Fluorescently etichettato dextrans sono comunemente utilizzati nella ricerca di permeabilità cellulare e tessuto33,34, per studiare l'endocitosi in più sistemi cellulari35,36, e per la traccia neurale37,38. Nel campo uditivo, le molecole di dextran sono state utilizzate anche per valutare la rottura della giunzione cellulare-cellula e la perdita dell'integrità dell'epitelio sensoriale uditivo dopo l'esposizione a rumore intenso nell'organo cincillà di Corti39,40.

In questo lavoro, abbiamo sfruttato le proprietà di alcuni dei più piccoli (3 e 10 kDa) dextrans fluorescenti per eseguire esperimenti di assorbimento nelle cellule ciliate dell'orecchio interno murine ed esplorare le dimensioni del percorso di permeazione del canale MET della cellula capelli interna. Inoltre, abbiamo utilizzato un microscopio confocale a scansione laser (LSM) 880 dotato di un rilevatore Airyscan per visualizzare e localizzare dextran fluorescente in stereocilia e nel corpo cellulare delle cellule ciliate uditive.

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Protocollo

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Le procedure di cura e sperimentazione degli animali sono state eseguite seguendo le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, che sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Istituto nazionale di disturbi neurologici e ictus (protocollo animale #1336 a KJS).

1. Topi

  1. Impostare un paio di coppie riproduttive di tipo C57BL/6J per riprodursi nella struttura animale per controllare la data di nascita delle cucciolate e tenere traccia dell'età dei cuccioli.

2. Dissezione cocleae

  1. Impostare uno spazio pulito vicino a uno stereoscopio per eseguire le dissezioni (Figura 1A). Utilizzare il 70% di etanolo per pulire lo spazio e l'ambiente circostante e posizionare un panca pulito. Sarebbe necessario un sacchetto di plastica Medical Pathological Waste (MPW) per scartare le carcasse animali.
  2. Prepara diversi piatti da 35 mm con alcuni supporti L15 di Leibovitz.
    NOTA: Il supporto cellulare L-15 di Leibovitz contiene 1-2 mM Ca2,che è necessario per mantenere l'integrità dei collegamenti delle persone, e contiene aminoacidi essenziali, vitamine e pirati di sodio per migliorare la salute e la sopravvivenza delle cellule. Il siero è stato escluso per evitare la variabilità sperimentale a causa della sua composizione mal definita e della potenziale interferenza con il dextran.
  3. Eutanasia i topi postnatali-giorno-6 (P6) per decapitazione.
    NOTA: i topi di 6 giorni sono in qualche modo resistenti agli anestetici inalanti. Anche se per l'eutanasia può essere utilizzato un metodo fisico secondario per garantire la morte di isoflurane oco2 prolungata (fino a 50 min), si raccomanda un metodo fisico secondario per garantire la morte.
  4. Utilizzare forbici chirurgiche per rimuovere la pelle del cranio facendo un taglio superficiale dall'estremità anteriore a quella posteriore e attraverso i canale uditivi esterni.
  5. Piegare la pelle verso il naso per esporre il cranio (Figura 2B).
  6. Fare un'incisione dalla parte posteriore alla parte anteriore del cranio e attraverso la linea degli occhi (Figura 2B-C).
  7. Separare il cranio in due metà e rimuovere il cervello con l'uso di una piccola spatola per esporre le ossa temporali (Figura 2C-D).
  8. Con piccole forbici, tagliare intorno alle ossa temporali, e accisa il tessuto.
  9. Mettere entrambe le ossa temporali in un piatto da 35 mm e assicurarsi che siano coperte con supporti L15 (Figura 2E).
    NOTA: i seguenti passaggi vengono eseguiti sotto lo stereomicroscopio. Uno sfondo nero di solito aiuta a visualizzare il tessuto durante i passaggi di dissezione fine.
  10. Sotto uno stereomicroscopio dotato di un oculare widefield (una potenza di ingrandimento 10X (WF10X) e di una sorgente luminosa alogena a corrente alternata esterna (AC), rimuovere il tessuto cocleare circostante, i canali semicircolari e gli organi vestibolari con pinze chirurgiche (Figura 2F).
  11. Per consentire al dextran e al supporto L15 di entrare nel condotto cocleare, eseguire due limiti di foratura sulle coclee dissetate, una sulla finestra rotonda e l'altra nella regione cocleare apicale.
  12. Aggiungere 300 mL di supporto L15 di Leibovitz in ogni pozzo da una piastra di depressione di vetro 9-well.
  13. Mettere almeno tre coclee sezionate su ogni pozzo.

3. Etichettatura Dextran

  1. Ricostituire il dextran nella soluzione di sale bilanciato di Hanks senza Ca2 e Mg 2 (HBSS-CFM) ad una concentrazione finale di 10 mg/mL. Questa soluzione di riserva deve essere rivestita in tubi neri opachi (protetti dalla luce) e conservata a -30 gradi centigradi fino all'uso.
    NOTA: L'uso di dextran lisina-fixable è fondamentale per un esito positivo di questo protocollo.
  2. Preparare ogni dextran ad una concentrazione finale di 2 mg/mL in 500 mL del supporto L15 di Leibovitz.
  3. Rimuovere il supporto dalla coclea e aggiungere il supporto L15 di Leibovitz contenente il dextran di interesse ad una concentrazione finale di 2 mg/mL.
    NOTA: Anche se una parte dei canali MET è aperta ariposo 41,42, l'incubazione dextran è stata eseguita con una leggera agitazione degli espianti per aumentare la probabilità aperta del canale MET.
  4. Incubare a temperatura ambiente per 2 h con agitazione delicata (25 giri/) utilizzando uno shaker tridimensionale con un angolo inclinato di 25 gradi.
    NOTA: dextran fluorescente deve essere protetto dalla luce quando possibile. Per proteggere il dextran durante l'incubazione di 2 h, posizionare la lastra di vetro 9-well all'interno di un piatto P150 coltura cellulare avvolto in un foglio di alluminio.

4. Preparazione del campione per l'imaging

  1. Dopo l'incubazione con il dextran, lavare il tessuto per 2 min due volte con il supporto e una volta con HBSS.
  2. Incubare il tessuto a temperatura ambiente per 30 min con 4% paraformaldeide nella soluzione di sale equilibrato di Hanks (HBSS).
    DESTRA: L'esposizione alla formaldeide può essere irritante per gli occhi, il naso e il tratto respiratorio superiore. In alcuni individui, l'esposizione ripetuta della pelle alla formaldeide può causare sensibilizzazione che può provocare dermatite allergica. La formaldeide è un noto cancerogeno umano e un sospetto rischio riproduttivo.
  3. Lavare rapidamente e delicatamente il tessuto fisso due volte con HBSS per rimuovere la paraformaldeide.
    NOTA: La decalcificazione delle ossa temporali non è necessaria in questa fase di sviluppo della coclea.
  4. Rimuovere il legamento a spirale e la membrana tenziale con pinze di punta fine per sezionare l'organo di Corti (Figura 2G).
  5. Rimuovere tutti i piccoli pezzi di tessuto e lavare il tessuto con HBSS.
  6. Permeabilizzare il tessuto nello 0,5% Triton X-100 in PBS contenente phalloidin fluorescente (coniugato al verde o al rosso durante il test dell'assorbimento del dextran con etichetta TR o FITC) a una diluizione di 1:200 per 30 min per etichettare F-actin e visualizzare il stereocilia basata sull'actin.
  7. Lavare il tessuto 2-3 volte per 2 min ogni volta con il tampone HBSS per rimuovere l'eccesso di triton e phalloidin, e una volta con PBS per rimuovere i sali.
  8. Montare l'organo dei tessuti Corti su un vetrino al microscopio e coprirlo con supporti di montaggio.
    NOTA: Durante il montaggio del tessuto, assicurarsi che il lato del tessuto contenente la stereocilia delle cellule cili sia rivolto verso il coperchio.
  9. Rimuovere eventuali bolle generate durante l'aggiunta del supporto di montaggio e impedire la generazione di nuove bolle durante il posizionamento del coperchio.
    NOTA: Aspirate con una pipetta qualsiasi bolla generata durante l'aggiunta del supporto di montaggio. Per evitare che le bolle d'aria rimangano intrappolate sotto la vescosina, posizionare un bordo del coperchio vicino al campione e ridurre attentamente e abbassare lentamente il coperchio sul tessuto utilizzando pinze o una punta pipetta.
  10. Coprire il tessuto in supporti di montaggio con un coperchio di vetro (Figura 2H).
    NOTA: Gli obiettivi con un'apertura numerica superiore a 0,4 sono progettati per utilizzare copricoperture #1,5 (spessore di 0,17 mm). L'utilizzo di coverslip sbagliato può avere gravi implicazioni per l'intensità e la qualità delle immagini.
  11. Incubare il tessuto montato durante la notte a temperatura ambiente per far asciugare il supporto di montaggio e conservare i vetrini a 4 gradi centigradi fino all'imaging.

5. Acquisizione di immagini ed elaborazione delle immagini

NOTA: Le immagini confocali sono state scattate con un microscopio confocale LSM 880 dotato di un rilevatore Airyscan a 32 canali in modalità super-risoluzione (SR)43 e un obiettivo 63x.

  1. Aggiungere una piccola goccia di olio di immersione sull'obiettivo.
  2. Posizionare il vetrino del microscopio contenente il campione di tessuto montato nello stadio del microscopio con il coperchio di vetro rivolto verso l'olio di immersione.
  3. Concentrarsi sul campione e impostare i parametri di imaging utilizzando il software di acquisizione delle immagini.
  4. Usa impostazioni di acquisizione immagini identiche e parametri ottimali per la risoluzione x, y e z per ogni esperimento indipendente. Un sistema di messa a fuoco piezo-driven è necessario per spostare rapidamente e con precisione l'obiettivo quando si acquisisce lo z-stack di immagini.
    NOTA: Per immaginare l'intera regione apicale delle cellule ciliate, raccogliere uno z-stack di immagini dalla stereocilia alla metà apicale del corpo delle cellule ciliate utilizzando le impostazioni ottimali. È fondamentale raccogliere una grande z-stack lungo la cellula dei capelli per assicurare l'imaging delle particelle vesciche-like.
  5. Utilizzare il software di acquisizione delle immagini per elaborare le immagini confocalraw utilizzando l'algoritmo di ricostruzione 3D Airyscan con le impostazioni del filtro di deconvoluzione predefinito automatico.
  6. Aprire le immagini confocali in un software di elaborazione delle immagini per regolare la luminosità e il contrasto, aggiungere la barra di scala ed esportare le immagini per le figure finali.

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Risultati

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Abbiamo osservato un'etichettatura robusta e specifica delle cellule ciliate dopo l'incubazione di 2h di organi di espianti Corti da topi postnatali-giorno-6 (P6) di tipo selvaggio con 3 kDa dextran fluorescente etichettati con Texas Red (dextran-TR) (Figura 2A-B). L'etichettatura Dextran è stata osservata nelle cellule ciliate interne ed esterne (IHC e OHC) nelle regioni basale, centrale e apicale dell'organo di Corti(Figura 2B).

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Discussione

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Questo protocollo descrive come eseguire esperimenti di assorbimento nell'organo murno degli esoti di Corti con 3 kDa dextran Texas Red. L'obiettivo di questo metodo è quello di verificare se le molecole più grandi di altre precedentemente testate sono state anche in grado di etichettare specificamente le cellule ciliate uditive e permeare attraverso il canale MET. Protocolli sperimentali simili sono stati precedentemente utilizzati per valutare la permeabilità delle cellule ciliate ad altri coloranti fluorescenti come F...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Vincent Schram del nucleo di microscopia e imaging NICHD per aver aiutato nell'acquisizione di immagini confocali, e Tsg-Hui Chang per un aiuto inestimabile con la gestione delle cozioni e la cura dei topi. Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di Ricerca Intramurale del NINDS, NIH, Bethesda, MD, a K.J.S. A.B. è stata supportata dal Programma di Ricerca Intramurale del NINDS, NIH, e da una Robert Wenthold Postdoctoral Fellowship del programma di ricerca intramurale del NIDCD.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
#1.5 vetrini coprioggetti 18mmWarner Instruments64-0714
Alexa Fluor 488 FalloidinaThermoFisherA12379
Alexa Fluor 594 FalloidinaThermoFisherA12381
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 obiettivoCarl Zeiss420780-9970-000
Amiloride cloridratoEMD MILLIPORE
Benchwaver 3-dimensional RockerBenchmarks B3D5000
C57BL/6J ceppo di topi wild-type000664The Jackson
Cell imperentato BAPTA sale tetrapotassicoThermoFisherB1204
Destrano, fluoresceina, 10.000 MW, anionico, lisina TermoFisher fissabileD1820
Dextran, Texas Red, 10.000 MW, Lysine FixableThermoFisherD1863
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine FixableThermoFisherD3328
Formaldeide Soluzione acquosa EM Grade Microscopiaelettronica15710
HBSS, calcio, magnesio, no fenolo rossoThermoFisher14025
HBSS, no calcio, no magnesio, no fenolo rossoThermoFisher14170
Immagine J o FIJINIHhttp://fiji.sc/
Immersol 518F mezzi di immersione in olioCarl Zeiss444970-9000-000
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX SupplementThermoFisher31415029
neomicina trisolfato sale idratoSigmaN6386
PBS (10X), pH 7.4ThermoFisher70011069
Phalloidin-CF405MBiotium00034
ProLong Diamond antifade mezzi di montaggioThermoFisherP36970
superfrost plus vetrino per microscopioFisherbrand22-037-246
Triton X-100SigmaT8787
Software Zen Black 2.3 SP1Carl Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html
129876scientifico Laboratory

Riferimenti

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