Presentato qui è un protocollo per l'utilizzo di una preparazione di estratto di rene corticale e la normalizzazione totale delle proteine per dimostrare la correlazione tra fattore di crescita endoteliale vascolare e ormone luteinizzante nel rene dei mammiferi.
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Articolo metodologico
Dimostrazione di una relazione lineare tra il fattore di crescita endoteliale vascolare e l'ormone luteinizzante negli estratti della corteccia renale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) aiuta a controllare l'angiogenesi e la permeabilità vascolare nel rene. Disturbi renali, come la nefropatia diabetica, sono associati con la disregolazione VEGF nel rene. I fattori che governano il VEGF in condizioni fisiologiche nel rene non sono ben compresi. L'ormone luteinizzante (LH), un ormone pro-angiogenico, aiuta a regolare l'espressione fisiologica VEGF negli organi riproduttivi. Dato che i recettori LH si trovano nel rene, noi, presso l'Istituto di ricerca di zietchick, abbiamo ipotizzato qui che LH aiuta anche a regolare l'espressione VEGF nel rene pure. Per fornire prove, abbiamo cercato di dimostrare che i livelli di LH sono in grado di prevedere i livelli di VEGF nel rene dei mammiferi. La maggior parte delle indagini relative al VEGF che coinvolgono il rene hanno utilizzato come modelli mammiferi di ordine inferiore (ad esempio, roditori e conigli). Per tradurre questo lavoro nel corpo umano, si è deciso di esaminare la relazione tra VEGF e LH nei mammiferi di ordine superiore (ad esempio, modelli bovini e suini). Questo protocollo utilizza la proteina totale lisato dalla corteccia renale. Le chiavi del successo di questo metodo includono l'approvvigionamento di reni da animali da macello subito dopo la morte, nonché la normalizzazione dei livelli di analita (nell'estratto renale) per proteina totale. Questo studio dimostra con successo una relazione lineare significativa tra LH e VEGF nei reni bovini e porcili. I risultati sono riproducibili in due specie diverse. Lo studio fornisce prove a sostegno che l'uso di estratti renali da mucche e maiali sono una risorsa eccellente, economica e abbondante per lo studio della fisiologia renale, in particolare per esaminare la correlazione tra VEGF e altri analiti.
Introduzione
Fattore di crescita endoteliale vascolare A (VEGF-A), aiuta a regolare l'angiogenesi e la permeabilità vascolare nel rene e in altri organi1,2 (qui di seguito, VEGF-A sarà indicato come VEGF). I livelli di VEGF nel rene sono sotto stretto controllo omeostatico. Quando i livelli di VEGF renale sono elevati o depressi, il rene può non funzionare correttamente. Ad esempio, entro 3 settimane dalla nascita, i topi con eterozigosità specifica podocite per il VEGF sviluppano endoteliosi e glomeruli senza sangue (cioè lesioni renali osservate nella preeclampsia umana), e il rene di insufficienza allo stadio finale si ....
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Protocollo
Per questo studio non sono stati utilizzati animali vivi o sperimentali.
1. Manipolazione dei tessuti
- Procurarsi reni interi bovini e porcini subito dopo la macellazione da un mattatoio. Trasporto su ghiaccio al laboratorio.
- All'arrivo in laboratorio, risciacquare i reni con 50 mL di fosfato freddo ghiaccio tamponato salina (PBS). Ripetere questo passaggio 2x per rimuovere completamente il sangue.
- Conservare i reni sul ghiaccio (o refrigerati) fino a un'ulteriore estrazione.
2. Dissezione dei reni
- Utilizzare forbici sterili, pinze, un coltello e piatti Petri per sezio....
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Risultati
I livelli medi e medici di LH e VEGF per tipo di animale e per sesso sono indicati nella Tabella 1. Dopo aver verificato la normalità dei dati da parte di Kolmogorov-Smirnov Test della normalità, sono stati utilizzati modelli di regressione lineare per esaminare la relazione tra LH e VEGF. LH è risultato essere un forte e significativo predittore di VEGF sia nei reni bovini che su gola (modello renale bovino: n : 7, R2 , 0,86, p - 0,002; modello renale porcine:.......
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Discussione
Procurarsi i reni dal mattatoio subito dopo la morte animale è la chiave del successo in questa metodologia. Questo è il vantaggio principale dell'utilizzo di organi da mucche e maiali invece di cadaveri umani. Di solito c'è almeno un ritardo di 12-24 ore dal momento della morte fino a quando gli organi cadaveri umani sono procurati. Poiché la composizione chimica degli organi corporei cambia in modo significativo entro 2 h dopo la morte15,16, gli studi VEGF nei .......
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Dichiarazioni
Tammy Movsas (fondatore e direttore della società DI ricerca) ha una domanda di brevetto in sospeso e brevetti convalidati per l'uso di antagonisti della gonadotropina nel trattamento delle malattie oculari e il diabete. Oltre ad essere un dipendente (biochimico) presso la società, il Dr. A. Muthusamy non ha altri conflitti finanziari da segnalare. A. Arivalagan (stagista estivo presso la studentessa universitaria dell'Università del Michigan) non ha altri conflitti finanziari da segnalare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Scholl's Slaughterhouse (Blissfield, MI) per aver fornito i reni bovini e porcinici. Per questo studio non è stato utilizzato alcun finanziamento per sovvenzioni.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit ELISA LH bovino | MyBiosource, San Diego, CA. | ||
| Kit ELISA VEGF-A Bovino | MyBiosource, San Diego, CA. | Kit per | |
| il dosaggio delle proteine Micro BCA | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 23235 | |
| Kit ELISA LH suino | MyBiosource, San Diego, CA. | ||
| suino VEGF-A ELISA | Ray Biotech, Norcross, GA. | ELP-VEGFA-1 | |
| RIPA Tampone di lisi ed estrazione | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | Codice 89901 |
Riferimenti
- Advani, A., et al. Role of VEGF in maintaining renal structure and function under normotensive and hypertensive conditions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (36), 14448-14453 (2007).
- Majumder, S., Advani, A.
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Ristampe e permessi
