Un approccio intravitale basato sulla microscopia per valutare la permeabilità intestinale e le prestazioni di spargimento di cellule epiteliali

Luz DC. Martínez-Sánchez; Rashmita Pradhan; Phuong  A. Ngo; Lena Erkert; Lukas S. Becker; Alastair  J. Watson; Imke Atreya; Markus  F. Neurath; Rocío López-Posadas

doi:10.3791/60790

Articolo metodologico

Un approccio intravitale basato sulla microscopia per valutare la permeabilità intestinale e le prestazioni di spargimento di cellule epiteliali

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DOI:

10.3791/60790

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3 dicembre 2020

Luz DC. Martínez-Sánchez^*¹ , Rashmita Pradhan^*¹ , Phuong A. Ngo¹ , Lena Erkert¹ , Lukas S. Becker¹ , Alastair J. Watson² , Imke Atreya^*¹ , Markus F. Neurath^*¹ , Rocío López-Posadas^*¹

¹Medical Clinic 1, University of Erlangen-Nuremberg, University Hospital of Erlangen, ²Norwich Medical School, University of East Anglia, Norwich Research Park

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Sfruttando la microscopia intravitale, il metodo qui presentato consente la visualizzazione in tempo reale dello spargimento di cellule epiteliali intestinali negli animali viventi. Pertanto, la mucosa intestinale macchiata localmente (acriflavina e rodiamminaB-dextran) dei topi anestetizzati viene imageizzata fino alla risoluzione a singola cellula utilizzando la microscopia confocale.

Abstract

La microscopia intravitale dell'intestino con imaging confocale consente l'osservazione in tempo reale dello spargimento di cellule epiteliali e la perdita di barriere negli animali viventi. Pertanto, la mucosa intestinale dei topi anestetizzati è macchiata localmente con colorazione non specifica (acriflavina) e un tracciante fluorescente (rodiammina-B dextran), montato su una piastra risciacquata a soluzione salina e direttamente immaginato utilizzando un microscopio confocale. Questa tecnica può integrare altre tecniche non invasive per identificare la perdita di permeabilità intestinale, come il passaggio transmucoso di traccianti somministrati per via orale. Oltre a questo, l'approccio qui presentato consente l'osservazione diretta degli eventi di spargimento di cellule in tempo reale. In combinazione con appropriati topi reporter fluorescenti, questo approccio è adatto per far luce nei meccanismi cellulari e molecolari che controllano l'estrusione delle cellule epiteliali intestinali, nonché in altri processi biologici. Negli ultimi decenni, studi interessanti che utilizzano la microscopia intravitale hanno contribuito alla conoscenza della permeabilità endoteliale, del homing intestinale delle cellule immunitarie, della comunicazione immuno-epiteliale e dell'invasione dei componenti luminali, tra gli altri. Insieme, il protocollo qui presentato non solo aiuterebbe ad aumentare la comprensione dei meccanismi che controllano l'estrusione cellulare epiteliale, ma potrebbe anche essere la base per lo sviluppo di altri approcci da utilizzare come strumenti per visualizzare altri processi cellulari altamente dinamici, anche in altri tessuti. Tra le limitazioni tecniche, le proprietà ottiche del tessuto specifico, così come la tecnologia di imaging selezionata e la configurazione del microscopio, determinerebbero a loro volta la distanza di lavoro dell'imaging e la risoluzione delle immagini acquisite.

Introduzione

L'intestino è un organo altamente specializzato con una funzione strettamente regolata che consente processi contrastanti, vale a dire nutrizione e protezione contro le sostanze luminali nocive. Foderando tra il corpo umano e l'ambiente, l'epitelio intestinale agisce come barriera fisica e immunologica e contribuisce al mantenimento dell'omeostasi mucosa^{nell'intestino 1,}^,². La perdita di integrità epiteliale e l'aumento della permeabilità alla giunzione stretta sono ben noti per essere associati alla malattia infiammatoria intestinale (IBD)^3,^,^4,^,<....