Articolo metodologico

Sviluppo di un modello di infezione del pesce zebra Larval per Clostridioides difficile

DOI:

10.3791/60793

⸱

14 febbraio 2020

 ,  ,  ,  , 
1Division of Cellular and Molecular Neurobiology, Zoological Institute, Technische Universität Braunschweig, 2Department of Molecular Biotechnology, Turkish-German University, 3Institut für Mikrobiologie, Technische Universität Braunschweig, 4Braunschweig Integrated Centre of Systems Biology, 5Helmholtz Centre for Infection Research

In questo articolo

Sommario

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Presentato qui è un metodo sicuro ed efficace per infettare le larve di pesce zebra con C. difficile anaerobica etichettato fluorescentmente per microiniezione e microgavage non invasivo.

Abstract

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Clostridioides difficile infezione (CDI) è considerato una delle infezioni gastrointestinali più comuni associate all'assistenza sanitaria negli Stati Uniti. È stata descritta la risposta immunitaria innata contro C. difficile, ma i ruoli esatti dei neutrofili e dei macrofagi nel CDI sono meno compresi. Nello studio attuale, le larve di Danio rerio (pesce zebra) vengono utilizzate per stabilire un modello di infezione da C. difficile per l'imaging del comportamento e della cooperazione di queste cellule immunitarie innate in vivo. Per monitorare C. difficile, è stato stabilito un protocollo di etichettatura utilizzando un tintura fluorescente. Un'infezione localizzata è ottenuta microiniettando etichettato C. difficile, che cresce attivamente nel tratto intestinale del pesce zebra e imita il danno epiteliale intestinale in CDI. Tuttavia, questo protocollo di infezione diretta è invasivo e provoca ferite microscopiche, che possono influenzare i risultati sperimentali. Di conseguenza, un protocollo di microgavazione più non invasivo è descritto qui. Il metodo prevede la consegna di cellule C. difficile direttamente nell'intestino delle larve di pesce zebra per intubazione attraverso la bocca aperta. Questo metodo di infezione imita da vicino il percorso di infezione naturale di C. difficile.

Introduzione

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C. difficile è un bacillo gram-positivo, spore-forming, anaerobico, e tossina che produce la tossina che è la causa principale di gravi infezioni nel tratto gastrointestinale1. I sintomi tipici della CDI includono diarrea, dolore addominale e colite pseudomembranosa fatale, e a volte può portare alla morte1,2. Le prove hanno dimostrato che le risposte immunitarie dell'ospite svolgono un ruolo fondamentale sia nella progressione che nell'esito di questa malattia3. Oltre alla risposta immunitaria, il microbiota intestinale indigeno è fondamentale per l'insorgenza e la patogenesi del CDI4. Nell'ultimo decennio, sia il numero di casi che il tasso di mortalità di CDI sono aumentati in modo significativo a causa dell'emergere di un ceppo ipervirulento di C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. Una migliore comprensione dei meccanismi immunitari sottostanti e del ruolo del microbiota durante il CDI contribuirà a portare a nuovi sviluppi e progressi terapeutici, consentendo un migliore controllo di questa epidemia.

Diversi modelli animali, come il criceto e il topo, sono stati sviluppati per fornire informazioni sulla difesa immunitaria contro C. difficile7,8. Tuttavia, il ruolo delle cellule immunitarie innate è ancora poco compreso, soprattutto perché il comportamento delle cellule immunitarie innate è derivato principalmente dall'analisi istologica o dalle cellule coltivate in vitro. Pertanto, stabilire un modello trasparente di pesce zebra per rivelare la risposta immunitaria innata a C. difficile all'interno di un organismo vertebrato vivente faciliterà tali studi. Le larve di pesce zebra hanno un sistema immunitario innato funzionale, ma non hanno il sistema immunitario adattivo fino alle 4-6 settimane dopo la fecondazione9. Questa caratteristica unica rende le larve di pesce zebra un modello eccellente per studiare la risposta isolata e la funzione delle cellule immunitarie innate in CDI.

Questo rapporto descrive nuovi metodi che utilizzano larve di pesce zebra per studiare le interazioni tra C. difficile e cellule immunitarie innate, come macrofagi e neutrofili. In primo luogo, viene presentato un protocollo di microiniezione localizzato che include C. difficile inoculum e colorazione. Utilizzando l'imaging confocaltime in vivo, si registra la risposta dei neutrofili e dei macrofagi verso il sito di infezione e si osserva la fagocitosi dei batteri da neutrofili e macrofagi. Tuttavia, è stato riferito che l'iniezione stessa provoca danni ai tessuti e porta al reclutamento di leucociti indipendentemente dai batteri10. Pertanto, viene descritto successivamente un protocollo di microgavage non invasivo per fornire C. difficile nell'intestino delle larve di pesce zebra. Studi precedenti hanno dimostrato che il microbiota gastrointestinale indigeno protegge un ospite dalla colonizzazione di C. difficile11. Pertanto, le larve di pesce zebra gnotobiotiche sono utilizzate anche per predisporre il pesce zebra che sono infettati 12. Successivamente, viene eseguita la dissezione intestinale per recuperare C. difficile praticabile e convalidare la durata della loro presenza nei tratti intestinali del pesce zebra.

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Protocollo

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Tutto il lavoro sugli animali qui descritto è stato svolto in conformità con le normative giuridiche (EU-direttiva 2010/63, licenza A 325.1.53/56.1-TUBS e licenza A 33.9-42502-04-14/1418).

1. Preparazione di agarose a bassa fusione, piastra di gel e aghi microiniezione/Microgavage

  1. Sciogliere 0,08 g di agarose a bassa fusione (Table of Materials, agarose A2576) in 10 mL del 30% medio di Danieau (0,12 mM MgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,21 mM KCl, 1,5 m HEPES (pH - 7,2) e 17,4 mM NaCl, conservati a temperatura ambiente (RT) per ottenere una soluzione dello 0,8%.
    NOTA: È possibile utilizzare concentrazioni superiori o inferiori di agarose. Tuttavia, il tempo necessario per solidificare varia per diverse marche di agarose, anche alla stessa concentrazione.
  2. Preparare gli aghi di microiniezione e microgavage da capillari di vetro (Tabella dei Materiali).
    1. Utilizzare un tiratore a micropipette con le seguenti impostazioni (notare che le unità sono specifiche per l'emittente qui utilizzato; vedi Tabella dei materiali): aghi di microiniezione (pressione dell'aria : 500; calore - 400; tiro : 125; velocità : 75; tempo : 150); e aghi microgavage (pressione dell'aria - 500; calore - 400; tiro : 100; velocità: 75; tempo - 150). Utilizzare una punta di microloader per caricare 3 oltere di H2O senza nuclesino nell'ago tirato.
    2. Introdurre l'ago nell'iniettore e fissarlo correttamente. Regolare l'ago ad un angolo adatto per l'iniezione. Impostare la pressione di iniezione tra 600-900 hPa per l'ago di microiniezione e 200-300 hPa per ago gavage.
    3. Posizionare una goccia di olio minerale sul cerchio nero del vetrino di calibrazione. Utilizzare pinze sottili per tagliare la punta dell'ago. Iniettare una goccia nell'olio minerale per misurare le dimensioni della goccia.
    4. Per la microiniezione, regolare il tempo di iniezione per ottenere una goccia con un diametro di 0,10–0,12 mm, che equivale a un volume di 0,5–1,0 nL. Per il microgavage, ottenere una goccia con un diametro di 0,18–0,20 mm, che equivale a un volume di 3-5 nL.
  3. Preparare una piastra di agarose dell'1,5 % con agarose (Tabella dei materiali, 8050) in un piatto di Petri di 10 cm nel mezzo di 30% Danieau utilizzando uno stampo di plastica come stampo microgavage. Conservare a 4 gradi centigradi per evitare l'idratazione fino a quando necessario. Caldo a RT o 28 gradi centigradi prima dell'esperimento.

2. Preparazione ed etichettatura di C. difficile e Spore con disteso fluorescente

  1. Preparare una soluzione di riserva da 1 mM di un tinrito fluorescente (Tabella dei materiali). Poiché il tinrito è venduto in 50 g di polvere, aggiungere 69 -L di DMSO alla fiala per ottenere una concentrazione di scorte di 1 mM.
  2. Preparare una soluzione di lavoro da 100 M del colorante fluorescente aggiungendo 2 -L di 1 mM di soluzione di riserva a 18 -L di DMSO in un tubo centrifuga, e mescolare bene.
  3. Cultura C. difficile (R20291, un ceppo ribotipo 027) inoculando 10 mL di mezzo liquido BHIS con due o tre colonie da una piastra in cappuccio anaerobico senza scuotere durante la notte. BHIS è BHI integrato con 0.5% (w/v) estratto di lievito e 0.1% (w/v) L-cysteine. Sciogliere 1 g di L-cisteina in 10 mL di ddH2O e sterilizzare per filtrazione, quindi aggiungere al mezzo autoclaved per ottenere una concentrazione finale di 1 g/L. Le piastre vengono preparate aggiungendo 15 g/L agar-agar al mezzo prima dell'autoclaving. La coltura selettiva di C. difficile viene eseguita utilizzando piastre croromidi C. difficile (Tabella dei materiali).
  4. Colorazione C. difficile con il colorante fluorescente
    1. Raccogliere C. difficile a un OD600 di 1.0–1.2 e lavare 1x con 1 mL di 1x PBS (5.000 x g per 3 min a RT). Risospendere in 1 mL di 1 x PBS.
    2. Aggiungere 3 - L di soluzione di lavoro del tintura fluorescente in 1 mL di sospensione batterica. Incubare il campione per 15 min a RT al buio. Lavare la c. difficile macchiata una volta con 1 mL PBS per rimuovere il coloranti residuo e risospendere in 1x PBS a un OD600 di 1.0 (1.0 OD600 equivale approssimativamente a 108 cfu/mL).

3. Iniezione di C. difficile macchiata nelle larve di pesce zebra

  1. Anestesizza 20-30 larve di pesce zebra a 5 giorni dopo la fecondazione (indicati come 5 dpf) con 0,02%–0,04% di tricaina (la polvere di tricaina viene sciolta in acqua a doppia distillazione e regolata a pH - 7 con soluzione Tris-HCL da 1 M) nel 30% medio di Danieau Iniezione. Trasferire le larve anestesizzate in un piatto fresco di Petri di 10 cm e rimuovere qualsiasi eccesso di 30% medio di Danieau.
  2. Mettere una goccia di agarose a bassa fusione dello 0,8% sulle larve di pesce zebra da coprire. Regolare delicatamente le larve in posizione laterale. Mettere il piatto Petri sul ghiaccio per 30-60 s per far solidificare la bassa fusione delle agarose. Aggiungere il 30% del mezzo di Danieau contenente 0,02%–0,04% di tricaina per coprire l'agarose.
  3. Preparare la soluzione di iniezione. Aggiungete 1 L dello 0,5% di fenolo rosso nella soluzione PBS a 9 l di C. difficile inoculum colorante per visualizzare il processo di iniezione.
  4. Caricare un ago di microiniezione calibrato con la soluzione di iniezione utilizzando un microloader. Montare l'ago caricato su un micromanipolatore e posizionarlo sotto uno stereoscopio.
  5. Regolare la pressione di iniezione tra 600-900 hPa. Impostare il tempo di iniezione su 0,1–0,3 s per ottenere 0,5–1,0 nL. Impostare l'ago nel micromanipolatore ad un angolo di 45 gradi che punta verso le larve incorporate.
  6. Posizionare la punta dell'ago sopra il tratto gastrointestinale vicino al poro urogenitale. Pierce attraverso agarose poi il muscolo con la punta dell'ago, quindi inserirlo nel lume intestinale e iniettare 0.5–1.0 nL di C. difficile. Utilizzare un microscopio a fluorescenza per monitorare le larve iniettate e raccogliere le larve iniettate correttamente per l'imaging confocale.

4. Generazione di larve di pesce zebra gnotobiotiche

  1. Utilizzare il metodo di allevamento naturale ben consolidato per generare embrioni di pesce zebra gnotobiotici, tra cui: fecondazione in vitro, lavaggio con mezzo contenente antibiotici (1 g/mL amphotericinB, 10 g/mL di kanamycin e 20 ampicillina, lavaggio con 0,1% wt/vol polycinyl pyrrolidone-iodina (PVP-I) soluzione e incubazione degli embrioni in una cappa cellulare12.
  2. Mantenere tutte le larve di pesce zebra gnotobiotiche in condizioni gnotobiotiche fino a 5 dpf o poco prima del gavage. Dopo il gavage, le larve di pesce zebra saranno trasferite in un'incubatrice standard, ma con il mezzo sterile 30% Danieau.

5. Gavage di larve di pesce zebra

  1. Calibrare l'ago microgavage come descritto al punto 1.2.
  2. Misurare il diametro della punta dell'ago posizionando l'ago su un vetrino di calibrazione con una goccia di olio minerale. Assicurarsi che la punta sia di 30-40 m di diametro, smussata e liscia. Scartare gli aghi affilati o ruvidi.
    NOTA: I bordi taglienti degli aghi possono essere smussati da fiammeggianti veloci.
  3. Preparare la soluzione gavage come descritto nel passaggio 3.3.
  4. Caricare e montare l'ago su un micromanipolatore come descritto al punto 3.4. Regolare il micromanipolatore per posizionare l'ago con un angolo di 45 gradi.
  5. Anestesizzare le larve di pesce zebra di cui al punto 3.1. Quando le larve smettono di muoversi, trasferirle nella scanalatura di uno stampo microgavage utilizzando una pipetta Pasteur.
  6. Mettere una goccia di agarose a bassa fusione dello 0,8% sulle larve di pesce zebra da coprire. Regolare delicatamente le larve con teste rivolte in posizione verticale ad angoli di 45 gradi nella scanalatura e code contro la parete della scanalatura. Assicurarsi che gli angoli delle teste siano approssimativamente gli stessi in modo che siano allineati con l'angolo degli aghi gavage. Posizionare lo stampo microgavage sul ghiaccio per 30-60 s, permettendo alle agarose di fusione bassa di solidificare al fine di stabilizzare le posizioni delle larve.
  7. Regolare la pressione di iniezione tra 200-300 hPa. Impostare il tempo di iniezione su 0,1–0,3 s per ottenere un volume di iniezione di 3–5 nL di C. difficile.
  8. Operare delicatamente l'ago attraverso l'agarose poi nella bocca delle larve di pesce zebra, attraverso l'esofago. Una volta che la punta dell'ago è all'interno della lampadina intestinale anteriore, premere il pedale di iniezione per rilasciare i batteri. Riempire il lume dell'intestino con il volume consegnato. Non lasciate che trabocca dall'esofago o dalla cloaca. Ritirare delicatamente l'ago dalla bocca del pesce zebra.
  9. Dopo la gavage, salva le larve di pesce zebra infette dall'agarose con una punta flessibile del microloader tagliando prima l'agarose e poi sollevando le larve. Trasferire queste larve in sterile 30% Danieau medio. Sciacquare le larve in mezzo sterile due volte. Trasferire le larve in un piatto Petri fresco di 10 cm. Le larve saranno mantenute fino a 11 dpf.

6. Analisi della microscopia confocale delle larve di pesce zebra iniettate

  1. Anestesizzare le larve di pesce zebra riferito al passaggio 3.1. Fare un foro nella parte inferiore di una parabola Petri 35 mm con un vetrino di vetro collegato al foro, indicato come la camera di imaging. Trasferire gli embrioni sul fondo della camera di imaging con una quantità adeguata del mezzo di Danieau del 30%.
  2. Aggiungere 200-300 agarose di fusione basse dell'1% per coprire le larve apitizzate. Poiché viene utilizzato un microscopio confocale invertito, posizionare il più possibile la regione infetta delle larve contro lo scivolo di vetro.
  3. Lasciamo che l'agarose si solidifichi sul ghiaccio per 30-60 s. Sommergi l'agarose con il 30% danieau contenente 0,02%–0,04% di tricaina.
  4. Immagina le larve con un microscopio a scansione laser confocale (Tabella dei materiali).

7. Dissezione del pesce zebra Larvale Intestine per recuperare C vitale.

  1. Isolare i tratti gastrointestinali dalle larve per analizzare il carico batterico. Inizia con larve di pesce zebra eutanasia con 0,4 % di tricaina.
  2. Sciacquare brevemente il pesce zebra con sterile 1x PBS e trasferirli in una piastra di agarose fresca.
  3. Dissezione del pesce zebra
    1. Inserire un ago nel tronco dorsale delle larve di pesce zebra vicino alla testa per immobilizzare il pesce zebra. Togliere la testa dietro le branchie con una lancetta.
    2. Inserire il secondo ago al centro del tronco dorsale. Inserire il terzo ago nell'addome del pesce zebra e tirare l'intestino dalla cavità del corpo.
      NOTA: è necessaria una cura estrema per isolare l'intestino intatto. Se è difficile farlo, eseguire ulteriori tiri per separare il resto dell'intestino dagli organi interni rimanenti.
    3. Utilizzare un ago per microiniezione per trasferire 10-15 intestini in un tubo da 1,5 mL contenente 200 sterili di 1x PBS.
    4. Omogeneizzare l'intestino con un pestello per interrompere il tessuto e preparare gli omogenei. Assicurarsi che il pestello raggiunga il fondo del tubo per interrompere completamente tutti gli intestini.
  4. Incubare gli omogenati nel mezzo di allevamento C. difficile contenente D-cycloserine e cefoxitina, con o senza taurocholate (TCA, un germinante delle spore di C. difficile) nella camera anaerobica.
  5. Incubare la piastra anaerobicamente per 48 h a 37 gradi centigradi.
  6. Utilizzare la coltura batterica per 16S rRNA-PCR.
    1. Risospendere una colonia a 50 gradi di H2O e farla bollire a 95 gradi centigradi per 15 min. Pellet i detriti lisci per centrifugazione (14.000 rpm per 2 min a RT) e utilizzare 2 L del supernatante come modello in 25 - L di reazione PCR utilizzando primer C. difficile-specifici(Cdiff16Sfw: 5' GTG AGC CAG TACG AGG 3'; Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').
    2. Quando si utilizzano batteri provenienti da colture liquide, raccogliere 1 mL di coltura e lavare una volta con 1 mL di PBS (14.000 rpm per 2 min a RT). Risospendere il pellet in 100 : L di H2Odd e trattare come fatto sopra. Per caratterizzare ulteriormente le colonie batteriche, striscia su una piastra di BHIS o cromo (Tabella dei materiali).

   

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Risultati

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C. difficile è strettamente anaerobica, ma il cromoforo delle proteine fluorescenti di solito richiede ossigeno per maturare. Per ovviare a questo problema, è stato utilizzato un coloranti fluorescente per macchiare le cellule C. difficile vive che stavano attivamente crescendo (R20291, un ceppo di ribotype 027; Figura 1A). Utilizzando il sistema Gal4/UAS, sono state generate linee di pesce zebra transgenici stabili per l'imaging dal vivo, in cui i promotor...

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Discussione

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I metodi presentati modificano ed estendono un approccio esistente per infettare le larve di pesce zebra eseguendo sia iniezione che microgavage10,14. Dimostra anche un approccio per studiare gli agenti patogeni anaerobici con le larve di pesce zebra22. Inoltre, il protocollo facilita l'analisi delle risposte delle cellule immunitarie innate in vivo su CDI e sulla colonizzazione di C. difficile nel pesce zebra. Il metodo è riprodu...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Siamo grati a Timo Fritsch per un'eccellente cura degli animali. Ringraziamo i membri dei laboratori di K'ster e Steinert per il supporto e le discussioni utili. Ringraziamo il dottor Dandan Han per aver letto criticamente il manoscritto. Riconosciamo con gratitudine il finanziamento dello Stato federale della Bassa Sassonia, Nieders-chsisches Vorab (VW-N2889).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AgarosioSigma-AldrichA2576Agarosio gelificante ultra-basso
Agarosio a basso punto di fusione (LM)Pronadisa8050Viene utilizzato nelle piastre di agarosio
BacLight Red Bacterial StainThermo Fisher ScientificB35001Colorante fluorescente
Brodo per infusione di cuoreCarl Roth GmbHX916.1
Ottone (wild-type)carente nella sintesi della melanina, utilizzato per generare linee transgeniche stabili
Nitrato di calcio (Ca(NO3)2)Sigma-AldrichC1396
Capillary GlassHarvard Apparatus30-0019Injection needles
Clostridioides difficileR20291,, un ceppo di ribotipo 027, produzione TcdA+/TcdB+/CDT+
DMSOCarl Roth GmbHA994
open sourceFIJIElaborazione delle immagini
HEPESCarl Roth GmbH6763
Estrattore ad ago orizzontaleSutter instrument IncP-87
L-cisteinaSigma-Aldrich168149
Leica Application Suite X (LAS X)Elaborazione
Solfato di magnesio (MgSO4)Carl Roth GmbHP026
Micro iniettoreeppendorf5253000017
Stampi per microiniezioneAdaptive Science ToolsTU1
Leica SP8 microscopio confocaleLeica
Fenolo RossoSigma-AldrichP0290
Cloruro di potassio (KCl)Carl Roth GmbH5346
Cloruro di sodio (NaCl)Carl Roth GmbH9265
TaurocholateCarl Roth GmbH8149
Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3stable linea transgenica in cui i promotori lyZ guidano l'espressione della proteina fluorescente
EGFP nei neutrofiliTg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3stable linea transgenica in cui il mpeg1.1 guida l'espressione della proteina fluorescente EGFP nei macrofagi
TricainaSigma-AldrichE10521
Estratto di lievitoBD Bacto212750
Piattaforma delle immagini Leica

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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