Correzione ad alta precisione dei cambiamenti cromatici 3D nell'era dell'imaging biologico a super-risoluzione utilizzando Chromagnon

Sommario

La correzione dei cambiamenti cromatici nelle immagini di microscopia a fluorescenza multicolore tridimensionale (3D) è fondamentale per l'analisi quantitativa dei dati. Questo protocollo è stato sviluppato per misurare e correggere i cambiamenti cromatici nei campioni biologici attraverso l'acquisizione di immagini di riferimento adatte e l'elaborazione con il software open source, Chromagnon.

Abstract

La microscopia quantitativa a fluorescenza multicolore si basa sull'attenta corrispondenza spaziale dei canali di colore acquisiti a diverse lunghezze d'onda. A causa dell'aberrazione cromatica e dell'allineamento imperfetto delle telecamere, le immagini acquisite in ogni canale possono essere spostate e ingrandite, così come ruotate l'una rispetto all'altra in una qualsiasi delle tre dimensioni. Con il metodo di calibrazione classico, gli spostamenti cromatici sono misurati da perline multicolore attaccate alla superficie di un coverslip, e un certo numero di software sono disponibili per misurare gli spostamenti cromatici da tali campioni di calibrazione. Tuttavia, l'aberrazione cromatica può variare con profondità, cambiamento con condizioni di osservazione ed essere indotta dal campione biologico stesso, ostacolando così la determinazione della vera quantità di cambiamento cromatico nel campione di interesse e attraverso il volume. Correggere i cambiamenti cromatici a una maggiore precisione è particolarmente rilevante per la microscopia a super-risoluzione in cui solo lievi spostamenti cromatici possono influenzare le analisi quantitative e alterare l'interpretazione delle immagini multicolore. Abbiamo sviluppato un software open-source Chromagnon e metodi di accompagnamento per misurare e correggere i cambiamenti cromatici 3D nei campioni biologici. Qui forniamo un protocollo applicativo dettagliato che include requisiti speciali per la preparazione dei campioni, l'acquisizione dei dati e l'elaborazione del software per misurare i cambiamenti cromatici nei campioni biologici di interesse.

Introduzione

L'imaging multicolore è uno degli aspetti fondamentali della microscopia biologica a fluorescenza, nei casi in cui la relazione spaziale di diverse molecole o strutture è di grande interesse. L'aberrazione cromatica, un'aberrazione ottica della luce policromatica causata dalla dispersione, cambia la posizione apparente degli oggetti colorati di interesse. Allo stesso modo, i microscopi dotati di più telecamere dedicate all'acquisizione di ogni colore hanno cambiamenti cromatici più complessi a causa delle differenze negli elementi ottici e dell'allineamento imperfetto tra i canali. Così, tali cambiamenti cromatici possono portare a una falsa conclusione a meno che non esplicitamente corretto dall'utente. Anche se i cambiamenti cromatici non sono stati un problema importante finché la risoluzione della microscopia è limitata dal limite di risoluzione classico, il recente sviluppo della microscopia a super-risoluzione¹ ha spinto la necessità di una correzione più accurata dei cambiamenti cromatici.

È stata una pratica comune misurare gli spostamenti cromatici dei sistemi al microscopio utilizzando una diapositiva di calibrazione del tallone multicolore². Il metodo di calibrazione basato sul tallone è appropriato per misurare gli spostamenti cromatici dall'intera ottica del microscopio alla superficie del coperchio². Questo metodo, tuttavia, non è in grado di misurare i cambiamenti cromatici nei campioni biologici di interesse. È importante notare che molti campioni biologici sono tridimensionali (3D), e gli spostamenti cromatici di tali campioni sono diversi da quelli sulla superficie del coverslip. Inoltre, i cambiamenti cromatici cambiano con le condizioni di imaging^2,3. Abbiamo misurato i cambiamenti cromatici nei campioni biologici 3D e abbiamo scoperto che l'incertezza dei cambiamenti cromatici era spesso pari a 350 nm con il classico metodo di calibrazione multicolore-perline³. Pertanto, i cambiamenti cromatici devono essere misurati in campioni biologici alla profondità di interesse e nelle condizioni di imaging utilizzate.

Qui, descriviamo le procedure per misurare i cambiamenti cromatici nei campioni biologici e correggere questi turni utilizzando il nostro software, Chromagnon³. Per misurare gli spostamenti cromatici nei campioni biologici, il nostro metodo utilizza due tipi di set di dati, un'immagine di "bersaglio" e un'immagine di "riferimento". L'immagine "bersaglio" è un'immagine multicolore di interesse, ad esempio, immagini macchiate per DNA, involucro nucleare e microtubuli. Spesso è impossibile misurare i cambiamenti cromatici in tale immagine. Pertanto, abbiamo bisogno di un'immagine di "riferimento" dedicata per misurare i cambiamenti cromatici nel campione. L'unica definizione di immagine di "riferimento" è un'immagine multicolore dello stesso oggetto. In questo senso, un'immagine di perline multicolore è anche un tipo di immagine di riferimento. Qui descriviamo tre diversi tipi di immagine di riferimento che vengono utilizzati per misurare i cambiamenti cromatici nei campioni biologici: "immagini di riferimento trasversali", "immagini di riferimento a campo luminoso" e "immagini di riferimento di calibrazione biologica". Il tipo di immagine di riferimento dipende dal tipo di microscopio utilizzato o dalla precisione di correzione richiesta nella tabella 1.

	Diafonia	Campo luminoso	Calibrazione biologica (su un'altra diapositiva)	Calibrazione biologica (sullo stesso vetrino)
Precisionea	+++	+	B(B) b (B)	+++
Semplicità	++	+++	++	++
Microscopia applicabile	Campo largo	Campo largo	Tutti	Tutti
Disponibilità dell'allineamento locale	+	+	-c	-c
a: Il numero di "" indica un aumento della valutazione. Single plus è di circa 50 nm e 3plus è di circa 15 nm in 3D. b: La precisione dipende da quanto le condizioni di imaging variabili sono mantenute costanti. c: La calibrazione locale misurata da campioni di perline multicolore può essere combinata come descritto nella sezione protocollo 4.

Tabella 1: Parametri quando si sceglie il tipo di immagini di riferimento.

Le "immagini di riferimento trasversali" hanno la massima precisione di correzione e sono relativamente semplici da realizzare^3,4 ( Tabella1). Lo svantaggio è la loro limitazione nelle applicazioni di microscopia a causa della loro incapacità di misurare i cambiamenti cromatici nei percorsi di eccitazione. Inoltre, per ottenere tali immagini, il microscopio deve essere dotato di specchi dicrotice multibanda e di filtri di emissione controllati in modo indipendente dai filtri di eccitazione o dalle sorgenti luminose. La microscopia adatta include microscopia convenzionale a campo largo, microscopia di localizzazione a singola molecola (SMLM) come la microscopia di localizzazione foto-attivata/microscopia di ricostruzione ottica stocastica (PALM/STORM)^5,6 e microscopia di espansione⁷ osservata con microscopia a campo largo. Un'immagine di riferimento cross-talk viene acquisita dal campione di destinazione stesso. È un'immagine di fluorescenza crosstalk (bleed-through) di un colorante ottenuto in tutti i canali richiesti. L'emissione di fluorescenza si espande sempre verso le lunghezze d'onda più lunghe, quindi i coloranti con la lunghezza d'onda di emissione più breve sono entusiasti di ottenere la fluorescenza a gambo incrociato in canali di lunghezze d'onda più lunghe. Ad esempio, quando il campione è macchiato di blu, verde e rosso, solo il colorante blu è eccitato e la luce di emissione viene ottenuta nei canali blu, verde e rosso. In questo protocollo, il DNA macchiato con 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) è stato utilizzato per ottenere la fluorescenza trasversale.

Le "immagini di riferimento a campo luminoso" sono un'alternativa più semplice e meno fototopede alle "immagini di riferimento incrociate", ma sono le meno accurate³ (Tabella 1). Queste sono immagini di campo luminose del campione di destinazione, acquisite in tutti i canali di colore utilizzati nell'immagine di destinazione.

Le "immagini di riferimento di calibrazione biologica" hanno il vantaggio di essere applicabili a qualsiasi tipo di microscopia a causa della loro capacità di misurare i cambiamenti cromatici sia nei percorsi di eccitazione che di emissione^3,8 (Tabella 1). La microscopia adatta comprende microscopia a campo largo, microscopia confocale, microscopia a foglio chiaro, esaurimento delle emissioni stimolate (STED)^9,microscopia di illuminazione strutturata (SIM)¹⁰, Airyscan/SORA^11,12, SMLM osservata con la modalità di fluorescenza totale della riflessione interna (TIRF), Olympus super risoluzione (OSR)¹³e così via. Un'immagine di riferimento di calibrazione biologica viene acquisita da un campione di calibrazione preparato in modo simile come il campione di destinazione, ma con colorazione di una singola struttura con più colori. La precisione di correzione eccelle la risoluzione della maggior parte della microscopia a super-risoluzione e la preparazione di un campione di calibrazione biologica può essere relativamente semplice. Un altro vantaggio è la disponibilità di immagini di riferimento multiple "media". Pertanto, anche se le singole immagini contengono informazioni scadenti per la misurazione dei cambiamenti cromatici, il contenuto delle informazioni può essere aumentato calcolando la media di più immagini. La precisione dipende da quanto le condizioni di imaging sono mantenute costanti. A questo proposito, le migliori prestazioni si ottengono quando sia i campioni di riferimento di destinazione che quelli di riferimento si trovano sullo stesso vetrino, utilizzando, ad esempio, 8 vetrine a camere(tabella 1, più a destra). In questo protocollo, l'actin macchiato con tre colori di phalloidin è stato utilizzato come calibrazione biologica.

Una volta ottenuta un'immagine di riferimento, lo spostamento cromatico viene misurato e corretto dal nostro software Chromagnon. Non vi è alcuna limitazione sul numero di canali, sezioni e intervalli di tempo che Chromagnon può misurare e correggere i cambiamenti cromatici. Chromagnon misura i cambiamenti cromatici in due fasi. Il primo passo acquisisce i parametri di allineamento "globali" o "affini" della traslazione negli assi X, Y, z, l'ingrandimento lungo gli assi X, Y, z e la rotazione intorno all'asse . L'accuratezza di calcolo dell'allineamento globale è di 16 nm in 3D e di 8 nm in 2D. Il secondo passaggio è un "allineamento locale" iterativo 2D opzionale sulle immagini proiettate per ottenere una maggiore precisione. Nel processo di allineamento locale, le immagini sono suddivise in più regioni e vengono misurati i cambiamenti cromatici in queste regioni locali. Successivamente, le regioni vengono ulteriormente divise e gli spostamenti cromatici nelle sottoregioni vengono misurati iterativamente fino a quando il numero di pixel nell'area non raggiunge il numero minimo di pixel (in genere 60 x 60 pixel). La mappa di allineamento locale risultante viene combinata con il parametro di allineamento globale e viene applicata all'immagine di destinazione da una trasformazione elastica. Seguendo questo passaggio, la precisione del calcolo è stata migliorata a 14 nm in 3D e a 6 nm in 2D. L'allineamento locale non è adatto per le immagini di riferimento di calibrazione biologica perché la struttura biologica nel riferimento è diversa da quella nell'obiettivo (Tabella 1). Pertanto, solo l'allineamento globale viene utilizzato per le immagini di riferimento di calibrazione biologica.

I cambiamenti cromatici locali provengono da due fonti; distorsione locale strumentale al microscopio e inomogeneità strutturale biologica. Poiché la distorsione locale strumentale al microscopio è costante, questo può essere misurato dal campione di riferimento perline multicolore e corretto come parametro fisso. Chromagnon può combinare la mappa di distorsione locale strumentale al microscopio e i parametri di allineamento globali dalle calibrazioni biologiche (Tabella 1). Utilizzando questo metodo, si prevede che l'accuratezza media della calibrazione biologica sarà migliorata di un ulteriore 1-2 nm.

Qui, descriviamo un protocollo per correggere gli spostamenti cromatici delle immagini a fluorescenza 3D utilizzando il nostro software Chromagnon, dalla fascia bassa più facile alla massima precisione. Usiamo l'immunostaining delle cellule HeLa come esempio e le abbiamo osservate usando la microscopia 3D a campo largo e la 3D-SIM. Nella prima sezione viene descritto come preparare campioni target e campioni di calibrazione biologica. Questa parte del protocollo dovrebbe essere ottimizzata per gli obiettivi specifici della ricerca. Nella seconda sezione vengono descritti i metodi di acquisizione per tre tipi di immagini di riferimento al microscopio. L'ipotesi era quella di ottenere canali blu, verdi e rossi, ma la composizione dei canali dovrebbe essere modificata dagli obiettivi specifici della ricerca e dalle configurazioni del microscopio. Non importa se il microscopio è dotato di una singola telecamera o di più telecamere. Nella terza sezione, descriviamo come si può utilizzare il nostro software per misurare e correggere gli spostamenti cromatici dell'immagine di destinazione utilizzando immagini di riferimento. Infine, nella quarta sezione, descriviamo un metodo per integrare le immagini di riferimento della taratura biologica utilizzando la calibrazione locale strumentale di un microscopio.

Protocollo

1. Preparazione del campione

1. Preparazione di un campione di destinazione
   1. Seme 2,5 x 10⁵ cellule Di HeLa su un piatto inferiore di vetro da 35 mm e coltivarle in 2 mL di mezzo di crescita (il mezzo aquila modificato di Dulbecco con piruamina di L e di sodio integrata con 10% siero bovino fetale [FBS]) a 37 gradi centigradi e una concentrazione di CO₂ del 5%. In alternativa, seme 6 x 10⁴ cellule HeLa su una copertura a 8 camere a vetri e farle crescere in 0,5 mL di mezzo di crescita a 37 gradi centigradi e una concentrazione di CO₂ del 5%. Utilizzare #1,5 di vetro (con spessore di 0,170 mm) per la microscopia ad alta risoluzione.
      NOTA: utilizzare volumi 1/4 per la copertina a 8 camere d'ordine per ulteriori passaggi, ad eccezione dei passaggi 1.1.5, 1.1.6, 1.1.8, 1.1.11 e 1.2.5, dove il volume è 100l indipendentemente dal tipo di contenitore.
   2. Dopo circa 24 h di incubazione, sostituire la soluzione con 2 mL del 3,7% di formaldeide in salina tamponata da fosfato (PBS). Dopo una leggera miscelazione, continuare a fissare le celle per 15 min a temperatura ambiente (RT) su una piattaforma di rotazione.
      AVVISO: Lavorare in una cappa di fumi.
   3. Lavare le celle con 2 mL di PBS, 3 volte ciascuna per 5-10 min su una piattaforma di rotazione.
      NOTA: Seguire le normative locali per smaltire i rifiuti di formaldeide.
   4. Celle permeabilizzate con 2 mL dello 0,1% Triton X-100 in PBS per 5 min su una piattaforma di rotazione, seguite da tre lavamenti con 2 mL di PBS, ciascuno per 5-10 min su una piattaforma di rotazione.
   5. Incubare le cellule in 100 - L dell'1% di albumina di siero bovino (BSA) in PBS per 1 h a RT su una piattaforma di rotazione.
   6. Sostituire la soluzione con 100.^{14 15}
   7. Lavare le celle con 2 mL di PBS, 3x5 x ciascuna per 10 min su una piattaforma di rotazione.
   8. Sostituire la soluzione con 100 l di una miscela di anticorpi secondari (anti-coniglio Ig con Alexa Fluor 488 e Anti-topo IgG con Alexa Fluor 555) in 1% BSA in PBS a 1/500 di diluizione, e incubare per 3-4 h a RT.
   9. Lavare le celle con 2 mL di PBS, 3x4x ciascuna per 5 min su una piattaforma di rotazione.
   10. Sostituire la soluzione con 2 mL di 0,5 g/mL DAPI in PBS per macchiare il DNA per 30 min a RT su una piattaforma di rotazione.
       NOTA: Invece di DAPI, è possibile utilizzare anche Hoechst 33342 alla stessa concentrazione.
   11. Sostituire la soluzione con 100 dollari di supporto di montaggio (Tabella dei materiali).
2. Preparazione di un campione di calibrazione biologica
   1. Preparare le celle fisse come descritto nei passaggi 1.1.1.1.4.
      NOTA: Preferibilmente, i campioni vengono preparati su una copertina a camera per posizionare sia i campioni di destinazione che quelli di riferimento in camere separate sullo stesso coverslip (Tabella 1, più a destra). Questa preparazione è preferibile quando l'esperimento richiede la massima precisione di correzione. Quando il campione deve essere preparato su un coverslip regolare, utilizzare coverlips di precisione con variazione ridotta ("N. 1.5H") per assicurare la riproducibilità.
   2. Preparare la soluzione di riserva di fialloidina coniugata a coloranti fluorescente in 1,5 mL di metanolo e conservare a -20 gradi centigradi. Mescolare la soluzione di falloidina in PBS alla seguente diluizione: 1/100 per il phalloidin con Alexa Fluor 405, 1/1.000 per il phalloidin con Alexa Fluor 488 e 1/200 per il phalloidin con Alexa Fluor 594.
   3. Sostituire la soluzione con 1 mL della miscela di phalloidin preparata al punto 1.2.2 e incubare per 30 min a RT su una piattaforma di rotazione.
   4. Lavare le celle con 2 mL di PBS, 3x5 x ciascuna per 10 min su una piattaforma di rotazione.
   5. Sostituire la soluzione con 100 dollari di supporto di montaggio.
      NOTA: I campioni di calibrazione possono essere conservati a 4 o -20 gradi centigradi per un uso ripetuto.

2. Acquisizione di immagini di riferimento

1. Immagini di riferimento crosstalk
   1. Posizionare il campione di destinazione preparato nel passaggio 1.1 su un microscopio a campo largo.
   2. Acquisire un'immagine a fluorescenza del bersaglio nei canali blu, verde e rosso.
      NOTA: per le immagini 3D, la dimensione del passo z nell'immagine di riferimento può essere diversa da quella nell'immagine di destinazione, purché il file di immagine contenga informazioni per la dimensione del passo. La dimensione del passo z per le immagini di riferimento e di destinazione è preferibilmente inferiore alla metà della risoluzione ottica dell'asse z, che viene calcolata per una microscopia limitata alla diffrazione, dove la lunghezza d'onda in nanometri e NA è l'apertura numerica dell'obiettivo. Ad esempio, se la risoluzione assiale è 550 nm, utilizzare un passaggio di z minore di 275 nm. Non è richiesta alcuna serie temporale per l'immagine di riferimento.
   3. Successivamente, per acquisire un'immagine a fluorescenza del riferimento, selezionare la luce di eccitazione solo per DAPI e scegliere di acquisire in canali blu, verde e rosso. Acquisire l'immagine di riferimento esattamente nella stessa posizione di fase e l'altezza di z, nel caso di una pila 3D.
      NOTA: per lunghezze d'onda a emissione più lunghe, sarà necessaria una maggiore intensità di illuminazione e tempo di esposizione.
2. Immagini di riferimento per campi luminosi
   1. Posizionare il campione di destinazione preparato nel passaggio 1.1 su un microscopio a campo largo.
   2. Acquisire un'immagine a fluorescenza del bersaglio nei canali blu, verde e rosso.
      NOTA: la dimensione del passo di z soddisfa preferibilmente il criterio di Nyquist come descritto nel passaggio 2.1.2.
   3. Acquisire un'immagine di campo luminoso del bersaglio nei canali blu, verde e rosso esattamente nella stessa posizione dello stage come in 2.2.2 e la stessa altezza in una pila 3D.
3. Immagini di riferimento per la taratura biologica
   1. Posizionare il campione di destinazione preparato nel passaggio 1.1 su un microscopio 3D-SIM.
   2. Acquisisci un'immagine a fluorescenza del bersaglio nei canali blu, verde e rosso tramite 3D-SIM. Ricostruire l'immagine super-risolta.
      NOTA: Il tipo di microscopio può essere di qualsiasi tipo, ad esempio 3D-SIM, confocal, STED, ecc. La dimensione del passo, preferibilmente, soddisfa il criterio di Nyquist, come descritto al punto 2.1.2.
   3. Acquisire più immagini a fluorescenza del riferimento preparate nel passaggio 1.2 in posizioni di fase diverse simili all'immagine di destinazione (passaggio 2.3.2) di 3D-SIM. Ricostruire le immagini super-risolte.
      NOTA: il numero totale di pixel in XY deve essere lo stesso in tutte le immagini di riferimento. La dimensione del passo in : deve essere la stessa in tutte le immagini di riferimento. È preferibile che il numero totale di sezioni di z sia lo stesso di quello nell'immagine di destinazione, ma questo non è un requisito assoluto. La posizione XY sul palco per queste immagini di riferimento non è importante perché la posizione o la coverslip è già diversa dalla posizione del campione di destinazione e inoltre la differenza di spostamento cromatico su una singola coverslip è inferiore a 15 nm³. Le condizioni di imaging, tra cui obiettivo, temperatura di osservazione, olio di immersione, dimensioni del foro stenopeico nella microscopia confocale e angolo di inclinazione in microscopia di illuminazione altamente inclinata¹⁶, dovrebbero corrispondere al riferimento per le migliori prestazioni. Se il microscopio consente l'acquisizione simultanea di più canali per l'acquisizione simultanea di più canali, le immagini di riferimento devono essere acquisite con la frequenza settimanale per correggere la deriva strumentale.

3. Correzione del turno cromatico con il software Chromagnon

1. Utilizzando un browser web, andare su https://github.com/macronucleus/Chromagnon/releasese scaricare la versione binaria più recente di Chromagnon.
   NOTA: le versioni binarie sono disponibili per Windows, Mac e alcune versioni Linux.
2. Estrarre il programma e inserire il file eseguibile in una posizione comoda. Su Windows o Mac fare doppio clic sul file per aprirlo, oppure eseguire il file binario dalla riga di comando su un sistema Linux.
   NOTA: si aprirà l'interfaccia utente grafica come nella Figura 1. Il programma può essere impedito di aprire facendo doppio clic per la prima volta a causa di un motivo di sicurezza. In questo caso, utilizzare il metodo dipendente dalla piattaforma per aprire il programma scaricato da Internet.

Figura 1: Uno screenshot dell'interfaccia utente grafica di Chromagnon. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Trascinare i file di riferimento nella "casella riferimento" (Figura 1) oppure fare clic su File di riferimento (Figura 1A) per aprire una finestra di dialogo di selezione file. A seconda dei formati di file, se il programma chiede di installare un Java Development Kit (JDK), premere sì e l'utente verrà navigato alla pagina di download. Scaricare e installare JDK per il sistema operativo come indicato. Chromagnon dovrebbe essere in grado di leggere il formato del file di immagine dopo aver riavviato il programma.
   NOTA: Chromagnon può leggere la maggior parte dei formati di file di immagine (multipagina 'tif', 'czi', 'nd2', 'oib', 'lif', 'dv', ecc.). Il formato immagine originale del microscopio è preferibile in questo passaggio perché i metadati possono andare persi quando un formato immagine viene convertito in un file tif a più pagine. Se il nome del canale viene visualizzato come 0, 1, 2, ecc. anziché lunghezze d'onda come 528, 609 (Figura 2A, caselle verdi), Chromagnon non conosce l'identità dei canali nell'immagine. In questo caso, assicurati che l'ordine dei canali e le dimensioni dei pixel nel file di riferimento corrispondano a quelli nel file di destinazione. Ad esempio, se l'ordine dei canali nel riferimento è verde e rosso, anche l'ordine dei canali nella destinazione deve essere verde e rosso, ma non rosso e verde.

Figura 2: Schermata di esempio per il caricamento di più file. (A) Un caso in cui tutte le immagini di riferimento hanno le immagini di destinazione corrispondenti. I nomi dei canali sono identificati correttamente dalle lunghezze d'onda (indicate da una casella verde) nei file di immagine utilizzati in questo esempio. (B) Caso in cui una singola immagine di riferimento viene utilizzata per correggere più immagini di destinazione. (C) Un caso in cui vengono utilizzate più immagini di riferimento (indicate da una casella rossa) e l'immagine di riferimento risultante dopo la media viene utilizzata per correggere più immagini di destinazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Trascinare i file di destinazione nella "casella di destinazione" (Figura 1) o fare clic su File di destinazione (Figura 1B) per aprire una finestra di dialogo di selezione dei file.
   NOTA: se sono presenti più immagini di destinazione e ognuna di esse dispone di immagini di riferimento corrispondenti, l'immagine di riferimento e l'immagine di destinazione corrispondenti devono trovarsi sulla stessa riga nelle rispettive caselle di riferimento e di destinazione (Figura 2A). Una singola immagine di riferimento può essere utilizzata anche per allineare più immagini di destinazione (Figura 2B).
5. Selezionare la casella di controllo Margini ritaglio se deselezionata (Figura 1C).
   NOTA: se questa casella di controllo è selezionata, i margini risultanti dall'allineamento vengono ritagliati. Selezionate questa opzione per un uso generale, ma deselezionate se è necessario un confronto a livello di pixel tra le immagini prima e dopo l'allineamento.
6. Scegliere un formato di immagine di output dall'elenco di scelte (Figura 1D).
   NOTA: i formati disponibili sono 'tif' (formato ImageJ^17), 'dv' e 'ome.tif'; il formato 'ome.tif' è disponibile solo dopo l'installazione di JDK.
7. Specificare il suffisso per il nome del file di output (Figura 1E, il valore predefinito è '_ALN'), che viene aggiunto al nome del file di destinazione.
8. Per le immagini di riferimento tra gambo con un elevato rapporto segnale-rumore, utilizzate l'allineamento locale dall'elenco di scelte di Allineamento locale (Figura 1F), scegliete Proiezione per utilizzare l'allineamento locale e Nessuno per disabilitarlo. Utilizzare una dimensione minima della finestra di 60 (Figura 1G).
   NOTA: quando si utilizza l'allineamento locale, tutte le immagini di destinazione devono avere immagini di riferimento corrispondenti (Figura 2A). L'allineamento locale non è raccomandato per le immagini di riferimento della taratura biologica, poiché gli spostamenti cromatici locali variano da un campione all'altro (Tabella 1). Per lo stesso motivo, non è possibile applicare un singolo allineamento locale a molte immagini di destinazione (Figura 2B). Come eccezione, può essere utilizzato quando il campione di interesse è solo sulla superficie del coverslip, e il campo visivo è riempito con oggetti luminosi, proprio come i campioni di perline fluorescenti multicolore.
9. Per più immagini di riferimento di calibrazione biologica, controllare l'opzione dei riferimenti medi (Figura 1H) per misurare un singolo parametro di allineamento dall'immagine mediata e il parametro di allineamento singolo viene quindi applicato a tutte le immagini di destinazione (Figura 2C). Scegliere Nessuno per Allineamento locale ( Figura1F).
10. Fare clic su Esegui tutto (Figura 1I) per avviare le misurazioni; i parametri di allineamento vengono applicati alle immagini di destinazione.
    NOTA: dopo aver misurato gli spostamenti cromatici dai file di riferimento, il programma crea file con estensione "chromagnon.csv" o "chromagnon.tif". Il tipo di file di output dipende dall'effetto dell'allineamento locale (Figura 1F). Se l'allineamento viene eseguito senza allineamento locale, l'output è "chromagnon.csv", mentre se viene utilizzato l'allineamento locale, l'output è "chromagnon.tif". I nomi dei file sono gli stessi del file di riferimento, ad eccezione del suffisso specificato (Figura 1J, il valore predefinito è senza suffisso) e dell'estensione ("chromagnon.csv" o "chromagnon.tif"). Una descrizione dettagliata del processo di allineamento è disponibile nel file "Chromagnon.log" creato nella stessa cartella.
11. Attendere che l'immagine corretta venga visualizzata nel visualizzatore (Figura 3).
    NOTA: Trascinando l'immagine con il mouse si sposta l'immagine e spostando la rotellina del mouse si modifica lo zoom. Spostare il dispositivo di scorrimento (Figura 3A) per modificare la sezione di z (e/o T quando applicabile) per la visualizzazione. Se il visualizzatore è troppo lento per aggiornare un'immagine, fare clic sul pulsante Carica interi dati in memoria ( Figura3B) per impedirgli di accedere ai dati sul disco rigido. Trascinando il bordo sinistro o destro delle caselle di colore (Figura 3C) è possibile controllare i valori minimi o massimi per la visualizzazione. Facendo clic sul pulsante per ogni canale (Figura 3D) si passa dalla visualizzazione o dall'occultamento del canale selezionato nel visualizzatore. Facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla casella dei colori (Figura 3D) consente agli utenti di scegliere i colori per la visualizzazione, o modificare le opzioni di visualizzazione della barra dei colori, e permette anche agli utenti di specificare i valori minimi e massimi esatti per il ridimensionamento della visualizzazione scegliendo "scala a ...". Facendo clic sul pulsante della vista ortogonale (Figura 3E) vengono mostrate le immagini delle viste . Spostando le linee trasversali si modifica la posizione da visualizzare nelle viste laterali.

Figura 3: Schermata del visualizzatore di immagini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

12. Per verificare se la misurazione è stata eseguita correttamente, trascinare le immagini di riferimento nella casella "Riferimento" e nella "casella di destinazione". Eseguire il programma e verificare se le immagini sono perfettamente sovrapposte.
    NOTA: se disponibile, i file "chromagnon.csv" o "chromagnon.tif" possono essere utilizzati come riferimenti per ignorare le misurazioni. Se lo spostamento cromatico nell'immagine non viene corretto, provare le soluzioni riepilogate nella tabella 2.
13. Per accedere ai parametri di allineamento nell'esempio o quando i parametri di allineamento devono essere modificati manualmente, aprire i file "chromagnon.csv" direttamente con qualsiasi editor di testo o software di foglio di calcolo. Quando viene modificato, salvarlo come "csv".
    NOTA: i valori sono in pixel per "tz", "ty", "tx" e in gradi per "r" e in fattori di ingrandimento per "mz", "my" e "mx".
    1. In alternativa, caricare un file "chromagnon.csv" o "chromagnon.tif" nella casella Riferimento o Destinazione di Chromagnon(Figura 1), quindi fare doppio clic su di esso per aprire l'editor di allineamento (Figura 4).
    2. Per vedere quanto viene spostato un canale quando i parametri vengono modificati, trascinare il file di immagine di riferimento nell'area inferiore (Figura 4A) per aprire l'immagine nell'editor. Quando si modificano i valori nella tabella (Figura 4B) e premendo il tasto invio/ritorno, osservare come si muove l'immagine del canale corrispondente quando i valori vengono modificati. Dopo la modifica, fare clic su Salva con nome... (Figura 4C) per salvare le modifiche.

Figura 4: Schermata di un editor di parametri di allineamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

14. Per controllare la mappa di allineamento locale, caricare il "chromagnon.tif" tramite Chromagnon's Riferimento o Destinazione casella(Figura 1) e fare doppio clic su di esso per aprire l'editor di allineamento (Figura 4). Fare clic su visualizzazione (Figura 4D) per visualizzare lo spostamento locale indicato dalle linee le cui lunghezze sono ingrandite dal fattore specificato nell'elenco di scelta dell'ingrandimento (Figura 4E).
    NOTA: specificando il "file di immagine originale"(Figura 4F), gli spostamenti vengono mappati insieme all'immagine originale.

4. Generazione di una mappa di allineamento locale specifica per il microscopio

1. Diluire 2 -L di perline fluorescenti multicolore di 200 nm di diametro in 18 -L di etanolo.
2. Vorticare la soluzione e posizionare 10 l della soluzione di perline al centro di un piatto inferiore in vetro. Assicurarsi di utilizzare #1,5 (con spessore di 0,170 mm) per la microscopia ad alta risoluzione.
3. Lasciare il piatto a RT per 1 h per asciugare completamente.
4. Posizionare il piatto su un microscopio da calibrare e concentrarsi sulle perline fluorescenti.
5. Ottenere immagini 2D o 3D con la microscopia da calibrare. Ottenere più immagini modificando la posizione dello stage.
6. Aprire l'interfaccia utente grafica di Chromagnon.
7. Trascinare i file di immagine di bead nella "casella di riferimento" (Figura 1) o fare clic su File di riferimento (Figura 1A) per aprire una finestra di dialogo di selezione dei file.
8. Controllare l'opzione media dei riferimenti ( Figura1H). Dall'elenco di scelte Di Align locale ( Figura1F), scegliere Proiezione. Utilizzare una dimensione minima della finestra di 60 (Figura 1G). Fare clic su Esegui tutto (Figura 1I) per avviare le misurazioni.
   NOTA: viene creato un file ".chromagnon.tif", in cui è memorizzata la mappa di allineamento locale del microscopio.
9. Dopo la misurazione, fare clic su Parametri aggiuntivi (Figura 1K). Dalla casella Distorsione locale dello strumento del microscopio, fare clic sull'elenco di scelte e scegliere Nuovo... per aprire una finestra di dialogo. Trascinare e rilasciare il file "chromagnon.tif" generato nel passaggio 4.8 nella casella del nome del file o fare clic sul pulsante Scegli file per aprire una finestra di dialogo di selezione file. Immettere il nome del microscopio e fare clic su OK.
10. Quando si misurano spostamenti cromatici da immagini di riferimento a gambo incrociato o di calibrazione biologica, fare clic su Parametri aggiuntivi (Figura 1K). Dalla casella Distorsione locale dello strumento al microscopio, scegliere il nome del microscopio specificato al punto 4.9. Fare clic su OK.
    NOTA: La scelta della "distorsione locale dello strumento da microscopio" non viene salvata dopo l'arresto del programma.
11. Procedere alla correzione cromatica senza allineamento locale come nella sezione 3.
    NOTA: È anche possibile utilizzare l'allineamento locale oltre alla calibrazione del microscopio. In questo caso, l'allineamento locale inizia con la calibrazione del microscopio.

Risultati

Un esempio di correzione cromatica del cambiamento utilizzando un'immagine di riferimento a un gambo incrociato è illustrato nella Figura 5. L'immagine è stata ottenuta con un microscopio ad ampio campo dotato di una singola telecamera. L'emissione di fluorescenza da DAPI è stata utilizzata come riferimento (Figura 5A,B) per correggere i canali blu, verde e rosso. L'immagine comprende 3 canali di 60 sezioni, ciascuno composto da 256 x 256 pixel. Le immagini sono state deconvocate prima di misurare i cambiamenti cromatici. Misurare i turni cromatici locali utilizzando Chromagnon ha richiesto 51 s su un Mac con Intel Core i7 (quad core, 8 thread, 2,7 GHz), 16 GB di RAM e 1 TB di memoria flash. Il parametro di allineamento è stato applicato all'immagine di destinazione (Figura 5C,D), che ha esattamente lo stesso numero di voxel dell'immagine di riferimento. La preparazione del file allineato ha richiesto 3 s. Come risultato del taglio dei pixel del bordo durante il processo di allineamento (casella di controllomargini di ritaglio nella figura 1C), il numero di voxel è stato ridotto dopo l'allineamento (Figura 5B, 51 sezioni, 252 x 251 pixel). Il DNA nel ponte anaphase (indicato da punte di freccia) viene visualizzato in modo non corretto al di fuori dell'involucro nucleare prima dell'allineamento (Figura 5C, ovvio nel pannello inferiore che mostra la vista X ) ma come previsto all'interno dell'involucro dopo l'allineamento (Figura 5D).

Un esempio di correzione cromatica dello spostamento mediante un'immagine di riferimento di calibrazione biologicaè illustrato nella Figura 6 . Le immagini sono state ottenute con un microscopio SIM dotato di tre telecamere. Sono state stampate una media di tre immagini di cellule HeLa macchiate di faliidine coniugate a coloranti blu, verdi e rossi (Figura 6A). L'immagine di riferimento comprende 3 canali di 76 sezioni, ciascuno composto da 1.024 x 1.024 pixel. Misurare i turni cromatici utilizzando Chromagnon senza l'allineamento locale richiesto 194 s sul sistema Mac descritto sopra. Il parametro è stato applicato a un'immagine di destinazione costituita da 3 canali di 73 sezioni, ciascuno composto da 1.024 x 1.024 pixel. La generazione del file allineato ha richiesto 25 s. La vista X è mostra le posizioni dei canali non corrette lungo le direzioni X (Figura 6A,C), ma questa registrazione errata è stata corretta dopo l'allineamento (Figura 6B,D).

Figura 5: Un esempio di allineamento con un'immagine di riferimento del gambo incrociato. Le cellule di HeLa sono state macchiate con DAPI per il DNA (mostrato in magenta), Alexa Fluor 488 (mostrato in giallo) per l'involucro nucleare e Alexa Fluor 555 (mostrato in blu) per i microtubuli. Le immagini sono state acquisite mediante microscopia 3D a campo largo con una singola telecamera e deconvolved. (A,B) Immagine di riferimento cross-talk rappresentativa con emissione DAPI, prima e dopo l'allineamento di Chromagnon. Tre canali di colore vengono visualizzati come sovrapposti. (C,D) Una sezione ottica della pila 3D in tre canali prima e dopo l'allineamento. L'aberrazione cromatica assiale è evidente al ponte anaphase mostrato dalle punte di freccia. La barra di scala nel pannello A indica 5 m per tutti i pannelli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Un esempio di allineamento con un'immagine di riferimento di calibrazione biologica Le immagini sono state acquisite con 3D-SIM dotato di tre telecamere. (A,B) Un'immagine di riferimento ha una media da tre immagini prima (A) e dopo (B) allineamento. Le cellule di HeLa sono state macchiate di phalloidin a congiunta con Alexa Fluor 405, 488 o 594. (C,D) L'immagine di destinazione prima (C) e dopo (D) allineamento. Le cellule di HeLa sono state macchiate con DAPI per il DNA (mostrato in magenta), Alexa Fluor 488 (mostrato in giallo) per l'involucro nucleare e Alexa Fluor 594 (mostrato in blu) per i microtubuli. La barra di scala nel pannello A indica 5 m per tutti i pannelli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

La procedura per la correzione cromatica è un compromesso tra precisione e sforzo. Per risparmiare sforzi inutili, è meglio sapere quanta precisione è necessaria per il vostro studio. La massima precisione potrebbe non essere richiesta per l'imaging tradizionale a campo largo (dal vivo) e, pertanto, le immagini di riferimento luminose sono spesso sufficienti per correggere lo spostamento cromatico. Allo stesso modo, quando la condizione di imaging e l'ambiente sono costanti, l'uso ripetuto di una calibrazione biologica farà risparmiare tempo. D'altra parte, se si desidera una registrazione altamente accurata, sono necessarie immagini di riferimento trasversali o di calibrazione biologica di alta qualità. Per ottenere prestazioni ottimali, le immagini di riferimento devono essere ottenute con condizioni e tempi simili il più possibile le immagini di destinazione. Finché sia le immagini di riferimento che le immagini di destinazione sono ottenute dalla stessa microscopia, una maggiore risoluzione spaziale migliorerà la precisione di correzione. Se la deconvoluzione è disponibile sia per le immagini di riferimento che per le immagini di destinazione, l'implementazione di questa correzione prima della correzione può migliorare la precisione della correzione. Inoltre, per ottenere le migliori prestazioni, il teorema di campionamento per l'asse ottico (sezione) deve essere soddisfatto sia nel file di riferimento che in quello di destinazione per un'interpolazione precisa dei subpixel (passaggio del protocollo 2.1.3).

La mancata correzione del cambiamento cromatico porta a conclusioni errate. Inoltre, l'uso della calibrazione sbagliata può persino peggiorare i cambiamenti cromatici piuttosto che correggerli, e questo deve quindi essere evitato. Abbiamo riassunto le possibili cause degli errori e le loro soluzioni comuni nella tabella 2. Per esaminare la causa di un guasto, in primo luogo, è necessario controllare visivamente se lo spostamento cromatico nell'immagine di riferimento è corretto con precisione (passaggio del protocollo 3.12). La maggior parte degli errori sono dovuti alla qualità delle immagini di riferimento e sono facilmente risolvibili secondo le descrizioni nella tabella 2. Per quanto riguarda la qualità delle immagini di riferimento, è importante notare che la precisione dell'allineamento globale diminuisce se l'intero campo visivo non viene riempito con il campione (Figura 7, Tabella 2). Rispetto al buon esempio illustrato nella figura 7A, l'esempio non valido illustrato nella figura 7B contiene solo tre inviluppi nucleari nell'area superiore sinistra e Chromagnon non è riuscito ad allineare una parte di questa immagine. Questo perché il metodo di allineamento globale di Chromagnon divide il campo visivo in quattro regioni (Figura 7C) al fine di misurare le differenze di rotazione e ingrandimento con alta precisione³. Questo metodo, se correttamente utilizzato, è un ordine più preciso rispetto ad altri metodi lineari come la trasformazione polare del log e i metodi simplex³. Se una delle quattro regioni non è disponibile, Chromagnon passerà a metodi lineari meno efficaci. Pertanto, per ottenere prestazioni ottimali, gli esempi illustrati nella figura 7B e nella figura 7C sono indesiderati e le quattro aree devono essere riempite con oggetti. Gli utenti possono verificare se qualsiasi area quadratica del campo visivo non è disponibile per la misurazione esaminando il file di registro ("Chromagnon.log"; vedere il passaggio 3.10 del protocollo). Fortunatamente, questo problema può essere facilmente risolto calcolando la media di più immagini di calibrazione biologica o utilizzando l'allineamento locale per le immagini di riferimento crosstalk o bright-field (Tabella 2). Contrariamente al caso di mancata corretta delle immagini di riferimento, è più difficile identificare le immagini di destinazione. Poiché tali errori sorgono a causa di differenze nei formati di file, nelle condizioni di imaging, nei tempi di imaging, nei metodi di imaging/allineamento tra le immagini di riferimento e di destinazione (Tabella 2), gli utenti devono sempre prestare attenzione quando utilizzano immagini di riferimento ottenute in condizioni/intervalli diversi dalle immagini di destinazione. Alcune immagini di esempio sono disponibili per il test (https://github.com/macronucleus/Chromagnon) per ottenere un'idea concreta delle immagini di esempio buone e cattive.

Problema	Causa	Soluzione
Impossibile correggere l'immagine di riferimento	Basso contrasto	Se possibile, acquisire un'immagine a contrasto più elevato. Se viene utilizzata un'immagine di riferimento di campo luminoso, riacquisire l'immagine in una soluzione basata sull'acqua per ottenere un contrasto maggiore della cella. In alternativa, provare ad applicare la riduzione del rumore computazionale (ad esempio il filtraggio gaussiano). Disattivare l'allineamento locale, che è più sensibile al disturbo.
	Contaminazione di immagini non correlate	Se possibile, rimuovere l'origine delle immagini non correlate nell'esempio. Per le immagini di riferimento tra gambo, controllare gli spettri di eccitazione dei coloranti utilizzati per le immagini di destinazione. Se i coloranti sono eccitati durante l'acquisizione di un'immagine crosstalk (ad esempio Alexa Fluor 568 o 594), prendere in considerazione altri coloranti (ad esempio Alexa Fluor 555). Se le polveri sul chip della fotocamera creano un'ovvia differenza di canale, pulire il chip della fotocamera o utilizzare un metodo di applicazione a campo piatto computazionale.
	Un punto estremamente luminoso fatto da un raggio cosmico	Se possibile, acquisire nuovamente l'immagine. In alternativa, provate ad applicare la riduzione del rumore computazionale (ad es. filtro mediano o gaussiano).
	Artefatti di deconvoluzione (segnali artificiali ai bordi assiale e laterale)	Tagliare i pixel del bordo o le sezioni , dopo la deconvoluzione. Se un lato è tagliato, anche l'altro lato deve essere tagliato per mantenere il centro dell'immagine.
	La dimensione del passo di z troppo scarsa	Per soddisfare il criterio nyquist, come indicato nel protocollo 2.1.3, è necessario acquisire uno stack di tipo z.
	Aberrazione ottica	L'aberrazione sferica è la principale aberrazione causata dagli utenti. Scegliere l'obiettivo giusto per il campione e utilizzare uno spessore coverslip di 170 m. Se l'obiettivo è dotato di un anello di correzione, regolarlo per trovare la posizione in cui si ottiene il numero di fluorescenza più alto dalla messa a fuoco. Nel caso di un obiettivo di immersione dell'olio senza un anello di correzione, regolare l'indice di rifrazione dell'olio di immersione che aumenta il conteggio della fluorescenza al fuoco.
	Il campo visivo non è riempito (Fig. 7)	Nel caso delle immagini di riferimento della calibrazione biologica, mediamente molte immagini. Nel caso di immagini a gambo incrociato o a campo luminoso, utilizzare l'allineamento locale.
	Un bug software non identificato	Segnalare il problema tramite GitHub(https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)
Impossibile correggere l'immagine di destinazione	I metadati del file di immagine vengono persi	Utilizzare il formato di file dell'ambito originale che contiene metadati completi ed evitare la conversione in un file tiff a più pagine prima dell'elaborazione. Utilizzare lo stesso ordine dei canali come scritto nel protocollo 3.3.
	Metodi di allineamento errati per la microscopia data	Non applicare il metodo di allineamento locale durante la misurazione da immagini di riferimento di calibrazione biologica alle immagini di destinazione. Non utilizzare immagini di riferimento a gambo incrociato diverse dalla microscopia a campo largo.
	Differenze nelle condizioni di imaging	Mantenere costanti le condizioni di imaging tra le immagini di riferimento e di destinazione come scritte nel protocollo 2.3.3.
	Differenze nel campione (compreso coverslip)	Utilizzare sempre lo stesso supporto di montaggio, coverslip (ad es. n. 1.5H) e una profondità di messa a fuoco simile.
	Deriva del microscopio dall'ultima	Effettuare una calibrazione tutte le volte ogni due settimane. Mantenere la temperatura costante e utilizzare una tabella mobile per evitare la deriva hardware del microscopio.

Tabella 2: Risoluzione dei problemi relativi alla correzione cromatica.

Figura 7: Esempi di immagini di riferimento. Busta nucleare in celle di lievito di fissione etichettate con GFP e mCherry. Le immagini sono state acquisite con la microscopia a campo largo convenzionale. I cambiamenti cromatici sono stati corretti utilizzando Chromagnon senza allineamento locale utilizzando le immagini stesse come immagini di riferimento. Le immagini sono state poi deconvolved per mostrare i dettagli. (A) Un buon esempio con molti oggetti nel campo visivo. (B) Un cattivo esempio con gli oggetti solo nell'angolo in alto a sinistra. Il disallineamento è evidente in una determinata regione dell'immagine. (C) Un esempio indesiderato in cui una delle quadrisezioni (separate da linee trasversali tratteggiate) è vuota. La barra della scala nel pannello A indica 5 m per la vista a campo intero e 1,25 m per la vista ingrandita ed è applicabile a tutti i pannelli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In questo protocollo sono stati descritti tre diversi tipi di riferimento(Tabella 1). Tra questi, le immagini di riferimento tra le gambo incrociate e le immagini di riferimento di calibrazione biologica necessitano di un'ulteriore attenta discussione. Per le immagini di riferimento ai concrologi, i campioni macchiati con DAPI o Hoechst 33342 e montati in glicerolo o supporti di montaggio commerciali possono essere utilizzati in modo efficiente per allineare i canali blu, verde e rosso. Allo stesso modo, Alexa Fluor 488 può essere utilizzato per allineare i canali verde e rosso. Tuttavia, ottenere la fluorescenza trasversale è spesso difficile dal momento che molti coloranti blu tranne DAPI e Hoechst sono dimmer e decadimento più velocemente rispetto alla maggior parte coloranti verdi e rossi. Inoltre, gli spettri di emissione dei coloranti moderni sono più stretti, il che rende difficile l'allineamento di più di tre canali con questo metodo. Attenzione dovrebbe essere prestata anche ad alcuni coloranti rossi comuni (ad esempio, Alexa Flour 568 e 594, ma non Alexa Fluor 555) che possono essere eccitati dalla luce viola, che impediscono di ottenere immagini di crosstalk ad alto contrasto da coloranti blu. Un altro inconveniente è che questo metodo non può misurare l'aberrazione cromatica dei percorsi di luce di eccitazione in eccitazione multicolore, perché solo una singola lunghezza d'onda di eccitazione viene utilizzata per l'eccitazione (Tabella 1). Poiché la microscopia più avanzata utilizza un'ottica di illuminazione alterata, l'applicazione di questo metodo è limitata. Tuttavia, la maggiore precisione di correzione è sufficientemente vantaggiosa per essere descritta in questo protocollo. In generale, un'immagine crosstalk deve essere scattata dopo un'immagine di destinazione per evitare effetti sbiancanti o fototossici. Per SMLM osservato con la modalità wide-field, un'immagine di riferimento deve essere acquisita prima di acquisire un'immagine di destinazione come coloranti a fluorescenza può essere sbiancata durante l'imaging.

Le immagini di riferimento della taratura biologica consentono agli utenti di allineare facilmente qualsiasi numero desiderato di canali a costo di una preparazione aggiuntiva del campione. Un altro vantaggio delle immagini di riferimento della taratura biologica è la disponibilità di "media" più riferimenti che aiuta a riempire tutti i campi visivi. Questo metodo può soffrire di differenze nelle condizioni di imaging se il campione di calibrazione viene preparato su un vetrino diverso. La maggior parte di questo problema può essere risolta se sia le destinazioni che i riferimenti vengono preparati sulla stessa diapositiva utilizzando le coperture a camere commerciali (Tabella 1) e altre condizioni di imaging sono mantenute costanti come nel passaggio di protocollo 2.3.3. In questo caso, ci si può aspettare una precisione di correzione simile a quella delle immagini di riferimento del gambo incrociato³. Il protocollo per l'utilizzo della falloidina come mostrato qui è uno dei modi più semplici per macchiare una singola struttura cellulare con più colori. Ci sono numerosi scenari possibili per preparare campioni di calibrazione biologica. Per l'immunostaining, un campione può essere etichettato con un singolo anticorpo primario seguito da colorazione con anticorpi secondari di più colori. In questo modo, una singola struttura di destinazione può essere etichettata con più colori. In alternativa, 5-ethynyl-2'-deoxyuridina, rilevata da etichette chimiche "click" appena sintetizzate DNA in più colori ad alta densità, come descritto nel dettaglio precedentemente⁸. Per le cellule vive, è utile preparare un ceppo transgenico che ospita due copie di un gene che vengono fuse in GFP o mCherry per etichettare la stessa struttura con due colori. Se il numero di copie del gene è critico come spesso osservato per le proteine della membrana, una singola copia del gene può essere tandemly fusa a GFP e mCherry (Figura 7). Le proteine fluorescenti fotoconvertibili, come mEOS2¹⁸, possono essere utilizzate anche illuminando un livello moderato di luce viola per ottenere entrambe le specie proteiche con o senza fotoconversione. In basse condizioni di ossigeno, GFP può anche essere utilizzato come proteina fotoconvertibile dal verde al rosso^19,20. La scelta del campione di calibrazione corretto renderà quindi l'esperimento più robusto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione di formaldeide al 16%	Polyscience	18814-10
Piatto con fondo in vetro da 35 mm	MatTek	P35G-1.5-10-C
Alexa Fluor 405 falloidina	Thermo Fisher Scientific	A30104
Alexa Fluor 488 falloidina	Thermo Fisher Scientific	A12379
Alexa Fluor 594 falloidina	Thermo Fisher Scientific	A12381
Siero Bovino	Thermo Fisher Scientific	16170078
Vetrino Coprioggetti	Matsunami	n. 1S HT
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Dulbecco' s Eagle Medium modificato con L-Gln e piruvato di sodio	Nacalai Tesque	08458-16
Terreno di montaggio (VECTASHIELD)	Vector Laboratories	H-1000
Anticorpo monoclonale anti-tubulina di topo (TAT1)			Descritto in Ref 15.
Nunc Lab-Tek II chambered coverglass (8 pozzetti)	Thermo Fisher Scientific	155409
Anticorpo policlonale anti-emerina di coniglio (ED1)			Un dono da Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Giappone e Kiichi Arahata, National Center of Neurology and Psychiatry, Tokyo, Giappone; deceduto.
Anticorpo secondario con Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11034
Anticorpo secondario con Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-21424
Anticorpo secondario con Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032
TetraSpeck Microspheres, 0,2 &; m	Thermo Fisher Scientific	T7280