Utilizzo di un analizzatore di flusso extracellulare per misurare i cambiamenti nella glicolisi e nel fosforo ossidativo durante la capazione dello sperma del mouse

Sommario

Descriviamo l'applicazione di un analizzatore di flusso extracellulare per monitorare i cambiamenti in tempo reale nella glicolisi e nel fosforilazione ossidativa durante la capitaneria dello sperma del topo.

Abstract

Lo sperma di mammaliano acquisisce la capacità di fecondazione nel tratto riproduttivo femminile in un processo noto come capacitation. I processi associati alla capitaneria richiedono energia. Resta un dibattito in corso sulle fonti che generano l'ATP che alimenta lo sperma tosilità progressiva, la capitaneria, l'iperattivazione e la reazione acroso. Qui, descriviamo l'applicazione di un analizzatore di flusso extracellulare come strumento per analizzare i cambiamenti nel metabolismo energetico durante la capacitazione dello sperma del topo. Utilizzando^losperma sensibile a fluorofori sensibili H - e O_2,questo metodo consente di monitorare la glicolisi e il fosforo ossidativo in tempo reale in spermatozoi non capacitari e capacitari. L'utilizzo di questo test in presenza di diversi substrati energetici e/o attivatori e/o inibitori farmacologici può fornire importanti informazioni sul contributo di diverse vie metaboliche e l'intersezione tra le cascate di segnalazione e il metabolismo durante la capacitation dello sperma.

Introduzione

L'applicazione della spettrometria di massa ha rivoluzionato lo studio del metabolismo. La profilazione metabolica mirata e la tracciatura metabolomica consentono un monitoraggio preciso dei cambiamenti nel metabolismo energetico. Tuttavia, l'esecuzione di metabolomica richiede con successo un'ampia formazione, personale esperto e costosi spettrometri di massa altamente sensibili non prontamente disponibili per ogni laboratorio. Negli ultimi anni, utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare, come il Seahorse XFe96 è diventato popolare come metodo surrogato per misurare i cambiamenti nel metabolismo energetico in vari tipi di cellule¹

Protocollo

Gli spermatomani sono raccolti da topi maschi CD-1 di 8-16 settimane. Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di Weill Cornell Medicine (IACUC).

1. Giorno prima del saggio

1. Preparazione della cartuccia del sensore e del calibro dell'analizzatore del flusso extracellulare
   1. Per idratare la cartuccia del sensore, rimuovere la cartuccia del sensore dal kit di analisi del flusso extracellulare XFe96 e posizionare la cartuccia del sensore a testa in giù accanto alla piastra di utilità.
   2. Riempire un serbatoio di soluzione con 25 mL....

Risultati

Questo metodo utilizza un analizzatore di flusso extracellulare per monitorare i cambiamenti in tempo reale nel tasso di glicolisi e ophos durante la capitaneria dello sperma del mouse. La figura 4 mostra un esperimento esemplare in cui lo sperma era capacitato in presenza di glucosio come unico substrato energetico e 2 DG e antimicina e rotenone come modulatori farmacologici. Il substrato energetico nel buffer TYH dell'analizzatore di flusso extracellulare e.......

Discussione

La perdita di capitalizzazione dello sperma in assenza di alcuni substrati metabolici o enzimi metabolici critici ha rivelato il metabolismo energetico come un fattore chiave a sostegno della fecondazione di successo. Un interruttore metabolico durante l'attivazione cellulare è un concetto consolidato in altri tipi di cellule, tuttavia, stiamo appena iniziando a capire come gli spermatofori adattano il loro metabolismo alla crescente domanda di energia durante la capacitation. Utilizzando un analizzatore di flusso extrac.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagents
2-Deoxy-D-glucose	Sigma-Aldrich	D8375	2-DG
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	IBMX; preparare una soluzione madre da 500 mM in DMSO (111,1 mg/ml) e conservare in piccole aliquote
Antimicina A	Sigma-Aldrich	A8674	AntA; preparare una soluzione madre da 5 mM in DMSO (2,7 mg/ml) e conservare in piccole aliquote Albumina
sierica bovina	Sigma-Aldrich	A1470	BSA
Cloruro di calcio	Sigma-Aldrich	C1016	CaCl2
Concanacalina A, Lectina da Arachis hypogaea (arachide)	Sigma-Aldrich	L7381	ConA
Glucosio	Sigma-Aldrich	G7528
Hepes	Sigma-Aldrich	H0887
Isothesia	Henry Schein Salute animale	1169567761	Isoflurano
Solfato di magnesio	Sigma-Aldrich	M2643	MgSO4
N6,2'-O-Dibutirriladenosina 3',5'-monofosfato ciclico sale sodico	Sigma-Aldrich	D0627	db-cAMP
Cloruro di potassio	Sigma-Aldrich	P9333	KCl
Potassio diidrogeno fosfato	Sigma-Aldrich	P5655	KH2PO4
Rotenone	Cayman Chemical Company	13995	Rot; preparare una soluzione madre di 5 mM in DMSO (2mg/ml) e conservare in piccole aliquote
Bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich	S5761	NaHCO3-Cloruro
sodio	Sigma-Aldrich	S9888	NaCl
Equipment e materiali
12 canali pipetta 10-100 μ L	eppendorf	ES-12-100
pipetta a 12 canali 50-300 μ L	vwr	613-5257
37 Incubatore C, non-CO2	vwr	1545
Provette cetrifughe da 5 mL	Eppendorf	30119380
Provette da centrifuga coniche da 50 mL	vwr	76211-286
Centrifuga con adattatore per piastre	Thermo Scientific	IEC FL40R
Kit di dissezione	World Precision Instruments	MOUSEKIT
Microscopio a contrasto di fase invertito con obiettivo 40X	Nikon
OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divisi	Thomas Scientific	1159X93
OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divisi	Thomas Scientific	1159X95
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	Venduto anche come XFe96 FluxPak mini (102601-100) con 6 invece di 18 cartucce.

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