Utilizzo di un analizzatore di flusso extracellulare per misurare i cambiamenti nella glicolisi e nel fosforo ossidativo durante la capazione dello sperma del mouse

L'applicazione della spettrometria di massa ha rivoluzionato lo studio del metabolismo. La profilazione metabolica mirata e la tracciatura metabolomica consentono un monitoraggio preciso dei cambiamenti nel metabolismo energetico. Tuttavia, l'esecuzione di metabolomica richiede con successo un'ampia formazione, personale esperto e costosi spettrometri di massa altamente sensibili non prontamente disponibili per ogni laboratorio. Negli ultimi anni, utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare, come il Seahorse XFe96 è diventato popolare come metodo surrogato per misurare i cambiamenti nel metabolismo energetico in vari tipi di cellule^1,2,3^,4,5.

Lo sperma sono cellule motili altamente specializzate; il cui compito è quello di consegnare il genoma paterno all'ovocita. Lo sperma che lascia il tratto riproduttivo maschile dopo l'eiaculazione è ancora funzionalmente immaturo e non può fertilizzare gli ovociti perché non sono in grado di penetrare i paramenti degli ovociti. Lo sperma acquisisce la competenza di fecondazione mentre transitano attraverso il tratto riproduttivo femminile in un processo di maturazione noto come capacitation^6,7. Lo sperma o sperma appena eiaculato sezionato dal cauda epididymis può essere condensato in vitro per incubazione in supporti di capitanatura definiti contenenti Ca^{2 ,}bicarbonato (HCO₃^-) o un analogo cAMP permeabile per le cellule (ad esempio, dibutyryl-cAMP), un accettatore di colesterolo (ad esempio, albumina del siero bovino, BSA) e una fonte di energia (ad esempio, glucosio). Durante la capitazione, gli spermatoi modificano il loro modello di motilità in un battito flagellare asimmetrico, rappresentando una modalità di nuoto chiamata iperattivazione^8,9, e diventano competenti a subire la reazione acrosomi7 , dove vengono rilasciati enzimi proteolitici che digeriscono i paramenti degli ovociti. Questi processi richiedono energia, e simile alle cellule somatiche, sperma generano ATP e altri composti ad alta energia tramite glicolisi così come ciclo TCA mitocondriale e fosforolo ossidativo (opxphos)¹⁰. Mentre studi multipli dimostrano che la glicolisi è necessaria e sufficiente per sostenere la capacità dello sperma^11,12,13,14, il contributo di ophos è meno chiaro. Contrariamente ad altri tipi di cellule in cui la glicolisi è fisicamente accoppiata al ciclo TCA, gli spermatozoi sono altamente compartimentati e si pensa che mantengano questi processi in compartimenti flagellari separati: il midpiece concentra i macchinari mitocondriali, mentre gli enzimi chiave della glicolisi sembrano essere limitati al pezzo principale^15,16. Questa compartimentazione comporta un dibattito in corso sul fatto che il piravate prodotto nel pezzo principale dalla glicolisi possa supportare oxphos mitocondriali nel midpiece, e se l'ATP prodotto da exxphos nel midpiece sarebbe in grado di diffondersi abbastanza rapidamente lungo la lunghezza del flagello per sostenere il fabbisogno energetico in parti distali del pezzo principale^17,18,19. C'è anche il supporto di un ruolo per ophos in capitaneria di sperma. Non solo è oxphos più energeticamente favorevole di glicolisi, generando 16 volte più ATP rispetto alla glicolisi, ma il volume del pezzo in verso e il contenuto mitocondriale sono direttamente correlati con la forma riproduttiva nelle specie di mammiferi che presentano maggiori gradi di concorrenza tra maschi di concorrenza per compagni²⁰. Affrontare queste domande richiede metodi per esaminare i contributi relativi di glicolisi e ophos durante la capitaneria dello sperma.

Tourmente ealtri applicato un analizzatore di flusso extracellulare 24-well per confrontare il metabolismo energetico di specie di topi strettamente correlati con significativamente diversi parametri di prestazioni dello sperma²¹. Invece di riportare i valori basali ECAR e OCR dello sperma non-capacitato, qui, adattiamo il loro metodo utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare di 96 pozzetti per monitorare i cambiamenti nel metabolismo energetico durante la capacità dello sperma del mouse in tempo reale. Abbiamo sviluppato un metodo che permette contemporaneamente di monitorare glicolisi e sfiorare in tempo reale nello sperma con flagelli che battono flagelli in fino a dodici diverse condizioni sperimentali misurando il flusso di ossigeno (O₂) e protoni (H⁾(Figura 1A). A causa della rottura del pirovano al lattato durante la glicolisi e della produzione di CO₂ tramite il ciclo TCA, lo sperma non contraente e condensato extrude H^- nel supporto di analisi che vengono rilevati dall'analizzatore del flusso extracellulare tramite H^-fluofori sensibili immobilizzati sulla punta della sonda di una cartuccia sensore. Parallelamente, il consumo di O₂ mediante fosforoorylazione ossidativa viene rilevato tramite fluorofori sensibili con O₂immobilizzati alla stessa punta della sonda (Figura 1B). La rilevazione efficace dell'H rilasciato e del consumato O₂ richiede un buffer di spermatozoi modificato con bassa capacità di buffering senza bicarbonato o fenolo rosso. Così, per indurre la capatazione in assenza di bicarbonato, abbiamo adottato l'uso di un analogo cAMP permeabile alle cellule iniettato insieme all'inibitore PDE ad ampio raggio IBMX²². Altre tre porte di iniezione indipendenti consentono l'iniezione di attivatori e/o inibitori farmacologici, che facilita il rilevamento in tempo reale dei cambiamenti nella respirazione cellulare e nel tasso di glicolisi a causa di manipolazioni sperimentali.

Gli spermatomani sono raccolti da topi maschi CD-1 di 8-16 settimane. Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di Weill Cornell Medicine (IACUC).

1. Giorno prima del saggio

1. Preparazione della cartuccia del sensore e del calibro dell'analizzatore del flusso extracellulare
   1. Per idratare la cartuccia del sensore, rimuovere la cartuccia del sensore dal kit di analisi del flusso extracellulare XFe96 e posizionare la cartuccia del sensore a testa in giù accanto alla piastra di utilità.
   2. Riempire un serbatoio di soluzione con 25 mL di doppio distillato H₂O utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 200 L di H₂O a ogni pozzetto della piastra di utilità. Riposizionare la cartuccia del sensore nella piastra di utilità e incubare per tutta la notte in un'incubatrice non CO₂ di 37 gradi centigradi.
      NOTA: La cartuccia deve essere idratata per almeno 4 h.
   3. Aliquota 25 mL del calibro dell'analizzatore del flusso extracellulare in un tubo conico da 50 mL e incubarlo durante la notte in un'incubatrice non-CO₂ da 37 .
2. Preparazione di microplacche rivestite con ConA
   1. Sciogliere 2,5 mg di ConA in 5 mL di doppio distillato H₂O per preparare uno 0,5 mg/mL (w/v) stock.
   2. Utilizzando una pipetta multicanale, riempire ogni pozzetto di un analizzatore di flusso extracellulare 96 pozze con 50 -L della soluzione 0,5 mg/mL Con A. Lasciare il coperchio aperto e lasciare asciugare il piatto durante la notte a temperatura ambiente.
      NOTA: Più piastre possono essere rivestite contemporaneamente e conservate a 4 gradi centigradi per un massimo di quattro settimane fino a quando non sono pronte per l'uso.
3. Preparazione del buffer di spermatozoi
   1. Preparare 250 mL di buffer TYH analizzatore di flusso extracellulare con HEPES basso contenente 138 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,7 mM CaCl₂, 1,2 mM KH₂PO₄, 1,2 mM MgSO₄, 5,6 m di glucosio e 1 mM HEPES. Riscaldare il buffer a 37 gradi centigradi e regolare il pH a 7,4.

2. Giorno del saggio

1. Preparazione per la calibrazione della cartuccia
   1. Sostituire l'H₂O nella piastra di utilità con 200 L di calibro XF per pozzo e incubare per almeno 1 h in un'incubatrice non CO₂ 37 gradi centigradi.
      NOTA: invece di un PBS calibratore, filtrato sterile, è possibile utilizzare pH 7.4.
   2. Riscaldare 50 mL di tampone TYH a 37 .
2. Generazione di un modello di onda per l'analizzatore del flusso extracellulare
   1. Accendere l'analizzatore del flusso extracellulare e lasciare che la temperatura si stabilizzi a 37 gradi centigradi.
   2. Aprire il software wave e progettare un nuovo modello aprendo un modello vuoto (vedere File supplementare 1, modello di onda).
   3. Aprire la scheda Definizioni di gruppo. Definire i media di saggio come TYH; pH 7.4 e il tipo di cellula come spermatozoi del topo, lasciano vuote strategie di iniezione e pretrattamenti. Creare gruppi diversi per ogni condizione di saggio; in questo esempio, ci sono 6 gruppi diversi (TYH, TYH - db-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG - db-cAMP/IBMX, Ant/Rot, Ant/Rot : db-cAMP/IBMX); dibutyryl cAMP (db-cAMP) e 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) per indurre la capacitazione, 2-deossiglucosio (2-DG) come inibitore della glicolisi, antimicina A (antA) e rotenone (rotenone) come inibitore del complesso III e complesso I della catena di trasporto elettronico.
      NOTA: Per tenere conto della variabilità tra i pozzi, è necessario misurare almeno 7-8 pozzi per condizione in parallelo.
   4. Aprire la scheda Mappa piastre e definire la mappa delle piastre assegnando gruppi a pozzi specifici.
      NOTA: I quattro pozzi d'angolo (A1, A12, H1, H12) saranno riempiti con buffer TYH (senza spermatori) e successivamente verranno utilizzati per la sottrazione in background.
   5. Aprire la scheda Protocollo, aggiungere 4 cicli di misurazione diversi, selezionare la porta rispettiva e modificare i dettagli di misurazione (Figura 2, Tabella 1). Evidenziare misura dopo l'iniezione e non evidenziare equilibrate.
   6. Salvare il modello di analisi, compilare il riepilogo del progetto e definire il percorso di salvataggio per il file dei risultati.
3. Preparazione di composti da caricare nella cartuccia del sensore
   1. Preparare 2 mL di 50 mM db-cAMP sciogliendo 9,8 mg di composto nel buffer TYH e aggiungere IBMX ad una concentrazione finale di 5 mM.
      NOTA: IBMX ha la tendenza a precipitare dopo essere stato diluito nel buffer TYH. I precipitati possono essere disciolti vorticando e incubando la soluzione TYH/db-cAMP/IBMX in un blocco termico a 37 gradi centigradi per 5 minuti.
   2. Preparare 1 mL di 500 mM 2-DG sciogliendo 82,1 mg di composto nel buffer TYH.
   3. Preparare 1 mL di 5 M di AntA/Rot diluindo entrambi i farmaci nel tampone TYH.
      NOTA: I composti vengono diluiti di 10 volte per iniezione nella cartuccia dell'analizzatore del flusso extracellulare; pertanto, assicurarsi che le soluzioni di iniezione siano 10 volte più concentrate.
4. Isolamento dello sperma del topo
   1. Anestesizza 3 topi maschi tra 8 e 16 settimane da isoflurane e sacrifica i topi per lussazione cervicale dopo che non è stata rilevata alcuna risposta alla pizzicatura dei tibi. Rimuovere gli epididymides cauda e vasa deferentia.
   2. Mettere ogni cauda in 500 gradi di tampone PREriscaldato di TYH in un pozzo 24-well, immobilizzare la cauda sul fondo della piastra utilizzando un paio di pinze e aprire il tessuto facendo 5-7 piccole incisioni con forbici piume.
   3. Trasferire immediatamente la piastra in un'incubatrice non CO₂ 37 gradi centigradi e lasciare che lo sperma si disperda per 15 min.
5. Caricamento della cartuccia del sensore
   1. Nel kit Extracellular Flux sono disponibili due guide di caricamento delle porte per le porte A e D e le porte B e C. Per caricare una porta specifica, rimuovere il coperchio dalla cartuccia del sensore e allineare la lettera della rispettiva guida di caricamento della porta con l'angolo superiore sinistro della cartuccia. Durante l'iniezione, utilizzare la punta delle dita della mano non iniettatrice per tenere la guida di caricamento della porta in posizione e inserire le punte della pipetta verticalmente nei fori guida di caricamento della porta.
   2. Porta A: Utilizzando una pipetta multicanale, iniettare 20 l del buffer TYH in ogni colonna.
   3. Porta B: Iniettare 22 l di tampone TYH nella colonna 1-4, iniettare 22 - L di 500 mM 2-DG nella colonna 5-8 e 25 - L di 5 .M AntA/Rot nella colonna 9-12.
   4. Porta C: Iniettare 25 l di TYH tampone in ogni colonna con numeri dispari, iniettare 25 - L di 10 mM db-cAMP/ 500 - M IBMX in ogni colonna con numeri pari.
   5. Posizionare la cartuccia del sensore con la piastra di calibrazione nell'analizzatore del flusso extracellulare e avviare l'analisi. La calibrazione richiede 10 - 15 min.
6. Preparazione di piastre di sperma
   1. Sciogliere 45 mg di BSA in 15 mL di tampone TYH (3 mg/mL w/v) e preparare tre aliquote di soluzione BSA/TYH da 3 mL ciascuna in 5 mL di tubi di centrifuga.
   2. Unire due pozzi di sperma ciascuno in un tubo di centrifuga di 1,5 mL, contare lo sperma utilizzando un ematocitometro e diluire lo spermatoma ad una concentrazione di 2 x 10⁷ spermatozoi/mL.
      NOTA: Utilizzare punte di pipetta di taglio per pipettare spermatozoi per evitare di danneggiare le cellule.
   3. Centrifugare lo sperma per 3 min a 700 x g, rimuovere il supernatante e aggiungere 1 mL di buffer TYH. Ripetere la fase di centrifugazione, rimuovere il supernatante e trasferire ogni sospensione dello sperma in un tubo di centrifugazione da 5 mL con 3 mL di BSA/TYH.
   4. Collocare 180 lofribtizzato relè in ogni pozzo angolo (A1, A12, H1, H12) di una piastra rivestita con ConA. Mettere 180 l of spermatozoi in ogni pozzetto vuoto della piastra rivestita ConA (1,2 x 10⁶ spermatozoi/pozzo).
   5. Centrifugare la piastra dello sperma a 250 x g per 1 min, ruotare la piastra di 180 gradi e centrifugare di nuovo a 250 x g per 1 min (velocità di frenata più bassa 1).
   6. Rimuovere la piastra di calibrazione dall'analizzatore del flusso extracellulare e aggiungere la piastra di sperma. Continua il saggio.
7. Estrazione e analisi dei dati
   1. Dopo aver terminato il test, rimuovere la cartuccia, aprire il file dei risultati, fare clic sulla scheda Esporta ed esportare l'esecuzione completata come file GraphPad Prism (File supplementare 2: dati di esempio primari utilizzati per la Figura 3).
   2. Duplicare il file ECAR e OCR facendo clic sulla scheda Nuovo e quindi sulla scheda Duplica famiglia... (Figura 3A).
   3. Eliminare le prime 7 righe di dati (Figura 3B).
   4. Normalizzare al punto dati prima dell'iniezione cAMP/IBMX mediante la linea di base sottraendo la riga 1. Fare clic sulla scheda Analizza, quindi sulla scheda Rimuovi matematica linea di base e colonna. Evidenzia righe selezionate: Prima riga, Calcolo: Rapporto:Valore/Linea di basee Sottocolonne: Ignora sottocolonna. Fare clic su OK (Figura 3C).

Questo metodo utilizza un analizzatore di flusso extracellulare per monitorare i cambiamenti in tempo reale nel tasso di glicolisi e ophos durante la capitaneria dello sperma del mouse. La figura 4 mostra un esperimento esemplare in cui lo sperma era capacitato in presenza di glucosio come unico substrato energetico e 2 DG e antimicina e rotenone come modulatori farmacologici. Il substrato energetico nel buffer TYH dell'analizzatore di flusso extracellulare e i modulatori farmacologici possono essere liberamente selezionati a seconda dell'obiettivo dell'esperimento. Lo sperma del topo non condensato in BSA/TYH è stato attaccato alla parte inferiore di una microcamera transitoria rivestita con ConA attraverso la loro testa. In questo esempio, i valori eCAR e OCR basali in media tra tutti i pozzi rilevati erano rispettivamente 12,76 x 2,75 mpH/min e 23,64 x 2,78 pm/min.

Dopo una finta iniezione con tampone TYH, seguita da iniezione di 2-DG e formiche/rot per inibire la glicolisi e il fosforo ossidativo, rispettivamente, la capacitazione dello sperma è stata indotta mediante iniezione di db-cAMP/IBMX.

I risultati rappresentativi mostrano che in presenza di glucosio, la capatecitazione è accompagnata da un aumento di 7 volte del tasso di acidificazione extracellulare (ECAR), che è inibito dal blocco della glicolisi con 2-DG (Figura 4A). Lo sperma conmotorità mostra un aumento di 20 volte del tasso di consumo di ossigeno (OCR) rispetto allo sperma non condensato (Figura 4B), dimostrando che lo sperma topo migliora sia la glicolisi che la fosforolelazione ossidativa per sostenere l'aumento della domanda di energia durante la capacitazione. L'aumento di ECAR durante la capitalizzazione dello sperma è inibito dall'inibitore della glicolisi 2-DG, ma non è influenzato dagli inibitori ossidativi di fosforosolazione antimicina A e rotenone (Figura 4C), indicando che il cambiamento in ECAR è principalmente guidato da H- rilascio da glicolisi. L'aumento dell'OCR è, come previsto, bloccato dall'antimicina A e dal rotenone(Figura 4D),ma è anche inibito da 2-DG (Figura 4B) che rivelano che l'aumento di ophos durante la capazione dello sperma dipende dall'attività glicolitica.

Figura 1: Principio dell'analizzatore del flusso extracellulare. (A) A causa della ripartizione del glucosio al lattato durante la glicolisi e della generazione di CO2 attraverso il ciclo TCA, i cambiamenti nella glicolisi e nell'ophos sono accompagnati da escrezioni H nei mezzi extracellulari. L'analizzatore XFe96 rileva questi cambiamenti nella concentrazione extracellulare Hcome ECAR. Parallelamente, i cambiamenti nella concentrazione extracellulare di O2 dovuti al consumo di O2 mediante fosforilazione ossidativa vengono misurati come OCR. Bloccare la glicolisi con 2-deossiglucosio (2-DG) o respirazione con il complesso I e complessi inibitori III rotenone e antimicina A rivela che le vie metaboliche supportano la crescente domanda di energia durante la capatanza dello sperma. (B) Lo sperma del topo è attaccato tramite le loro teste sul fondo di una microcamera rivestita con ConA; i loro flagelli si muovono liberamente. Mentre i cambiamenti nella concentrazione extracellulare He O2 vengono rilevati da fluorofori sensibili H - e O2immobilizzati su una sonda del sensore, fino a quattro diversi composti possono essere iniettati in sequenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Rappresentazione schematica dell'esperimento esemplare. I cambiamenti in ECAR (mpH/min) e OCR (pmol O2/min) vengono rilevati nello sperma non-capacitate e capacitante utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Ciclo 1: valori ECAR e OCR di basale. Cicli 2-5: stabilizzazione del sistema dopo l'iniezione fittizia TYH. Cicli 6-8: Incubazione di farmaci. Cicli 9-27: Capitanto dello sperma. Le frecce indicano iniezioni. 2-DG: concentrazione finale 50 mM, AntA/Rot: concentrazione finale 0,5 m, db-cAMP: concentrazione finale 1 mM, IBMX: concentrazione finale 500 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 3: Analisi dei dati. (A) Dati grezzi delle modifiche in ECAR durante la capitaneria dello sperma del mouse. (B) Dati dopo la rimozione dei primi 7 punti dati. (C) Dati normalizzati al punto dati prima dell'iniezione cAMP/IBMX. I dati sono mostrati come media di 7-8 pozzi - Iniezioni S.E.M. sono indicati con una freccia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Cambiamenti nella glicolisi e nel fosforilazione ossidativa durante la capatazione dello sperma del topo. (A) ECAR normalizzato in spermatozoi di topo non concapacitati e capacitanti in presenza e assenza di 50 mM 2-DG. (B) OCR normalizzato in spermatozoi di topo non concapacitati e capacitazione in presenza e assenza di 50 mM 2-DG. (C) ECAR normalizzato in spermatozoi di topo non condensati e capacitati in presenza e assenza di 0,5 antimicino A e rotenone. (D) OCR normalizzato in spermatozoi di topo non condensati e capacitanti in presenza e assenza di 0,5 antimicino A e rotenone. I dati vengono visualizzati come media: S.E.M normalizzato al punto dati prima dell'iniezione db-cAMP/IBMX; n n - 6. Le iniezioni sono indicate con una freccia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Dettagli misurazione.

Figura supplementare Figura 1: Capitanacitazione dello sperma del topo nell'analizzatore di flusso extracellulare TYH buffer. Fosfolalazione dei residui di tirosina di spermatozoi di topo rilevati in diversi momenti durante la continenza (0 - 90 min) dopo l'incubazione in (A) TYH con 25 mM HCO3-, 3 mg/mL BSA e 20 mM HEPES o in (B) extracellulare flux TYH con 5 mM db-cAMP, 500 IBMX, e 1 mM HEPES, rilevati con un anticorpo z-fosforostirosina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Modello di saggio onda per rilevare i cambiamenti nella glicolisi e nel fosforo ossidativo durante la capatacitazione dello sperma del topo. Il software desktop wave può essere scaricato gratuitamente dopo aver compilato un modulo di registrazione (www.agilent.com/en/products/cell-analysis/cell-analysis-software/data-analysis/wave-desktop-2-6) e installato su Windows 7, 8 o 10, (Mac OSx 10.11 (o superiore) con Parallels 12 (o superiore). Di seguito, i modelli di onda possono essere generati indipendentemente dall'analizzatore del flusso extracellulare, esportati e quindi importati nel software onda di qualsiasi analizzatore di flusso extracellulare. Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

File supplementare 2: File prisma Graph pad esportato dal software wave con analisi dei dati esemplari. Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

Gli autori non hanno nulla da rivelare.