Glicoconi coniugato omogeneo prodotto dall'incorporazione combinata di aminoacidi innaturali e dalla click-chemistry a scopo vaccinale

Sommario

L'espansione del codice genetico viene applicata per l'introduzione di un amminoacido innaturale che porta un gruppo funzionale biorthogonale su una proteina portante in un sito definito. La funzione biorthogonale viene ulteriormente utilizzata per l'accoppiamento site-selective di un antigene di carboidrati per fornire un vaccino glicoconi coniugato omogeneo.

Abstract

L'espansione del codice genetico è un potente strumento per introdurre amminoacidi innaturali (UAA) nelle proteine per modificarne le caratteristiche, studiare o creare nuove funzioni proteiche o avere accesso ai coniugati proteici. Fermare la soppressione del codone, in particolare la soppressione del codone ambrato, è emerso come il metodo più popolare per introdurre geneticamente gli UAA in posizioni definite. Questa metodologia è applicata alla preparazione di una proteina portante contenente una UAA che ospita un gruppo funzionale bioorthogonale. Questo manico reattivo può essere successivamente utilizzato per innestare in modo specifico ed efficiente un oligosaccaride sintetico hapten per fornire un vaccino omogeneo glicoconi coniugato. Il protocollo è limitato alla sintesi dei glicoconi coniugati in un rapporto 1:1 di carboidrati hapten/proteina portante ma suscettibile a numerose coppie di gruppi funzionali biorthogonali. L'omogeneità del vaccino glicoconi coniugato è un criterio importante per garantire una caratterizzazione fisico-chimica completa, soddisfacendo così sempre più esigenti le raccomandazioni delle agenzie di regolamentazione dei farmaci, un criterio che non è soddisfatto dalle classiche strategie di coniugazione. Inoltre, questo protocollo consente di ottimizzare finemente la struttura dell'attuale vaccino coniugato, dando origine a strumenti per affrontare le relazioni struttura-immunogenicità.

Introduzione

I vaccini glicoconi coniugati sono elementi essenziali dell'arsenale vaccinale disponibile per il trattamento profilattico delle malattie infettive. Sono sicuri, ben tollerati ed efficienti in un'ampia fascia d'età, compresi i bambini piccoli. Forniscono la difesa ottimale contro le infezioni causate da batteri capsulati come meningococco, pneumococco o Haemophilus influenzae di tipo b¹. I vaccini glicoconi coniugati sono fatti di polisaccaridi batterici purificati che formano le capsule di batteri o oligosaccaridi sintetici che imitano questi polisaccaridi espressi in^{superficie 2}, che sono covalentemente colleg....

Protocollo

1. Sintesi della UAA: propargil-llysina (PrK)

1. Sintesi di N^α-Boc-propargil-llysina¹⁸
   1. Sciogliere 500 mg di Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) in una miscela acquosa 1 M NaOH (5 mL) e THF (5 mL) in un pallone e montare il pallone con un setto di silicio.
   2. Raffreddare il pallone in un bagno di ghiaccio e quindi aggiungere 158 μL di propargil cloroformato (1,62 mmol) dropwise (per un periodo di 2-3 minuti) utilizzando una microsiringa durante l'agitazione.
   3. Riscaldare la miscela di reazione a temperatura ambiente e continuare a mescolare per 10 ore.
   4. Raffreddare soluzioni di 50 mL di etere di....

Risultati

In questo progetto è stato preparato un vaccino omogeneo glicoconi coniugato utilizzando la strategia di soppressione del codone amber stop per introdurre un UAA in un sito definito (Figura 1). L'adessina superficiale pneumoccocale A è stata selezionata come proteina portante. Questa proteina è altamente conservata ed espressa da tutti i ceppi di Streptococcus pneumoniae²². È altamente immunogenico e precedentemente utilizzato.......

Discussione

La mutagenesi site-directed è una strategia semplice per incorporare aminoacidi specifici in una posizione definita di una proteina che rimane a malapena utilizzata con l'obiettivo di preparare vaccini glicoconi coniugati^7,8,14. La mutagenesi classica basata sull'approccio dei 20 amminoacidi naturali è altamente efficiente poiché non è richiesta alcuna modifica della macchina di traslazione. Le mutazioni della cisteina sono soli.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
AIM (autoinductif medium)	Formedium	AIMLB0210	Solid powder
Boc-Lys-OH	Alfa-Aesar	H63859	Solid powder
BL21(DE3)	Merck Novagen	69450	E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ (DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λ S)Membrana
			per dialisi
Filtro DNAseI
0,45 &; m
L-arabinosio
lisozima
Resina Ni-NTA	Machery Nagel	Protino	Ni-NTA perle in sospensione in etanolo al 20%
			centrifugo Pall
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH	questo studio		è lo stesso di pET24d-mPsaA-WT ma con una mutazione K32TAG nel Gene mPsaA
pET24d-mPsaA-WT	questo studio		Plasmide pET24d con il gene Wt mPsaA clonato tra i siti di restrizione BamHI e XhoI con una sequenza di proteasi TEV seguita da un tag His6 all'estremità C-terminale del gene mPsaA e portante il gene di resistenza alla Kanamicina
pEVOL	plasmide dono da Edward Lemke EMBL (ref 19)		con origine p15A, due copie di MmPylRS (una sotto il promotore GlnS e una sotto il promotore pAra), una copia del tRNACUA sotto il promotore ProK, il gene di resistenza al cloramfenicolo
Propargyl cloroformiato	Sigma-Aldrich	460923
Liquid Sonicator	Thermo Fisher	FB120-220

Dispositivo