Interrogatorio parallelo del reclutamento di z-Arrestin2 per lo screening dei ligandi su una scala a livello GPCR utilizzando PRESTO-Tango Assay

Sommario

Dato che i GPCR sono interessanti obiettivi drogabili, lo screening dei ligandi GPCR è quindi indispensabile per l'identificazione dei composti di piombo e per gli studi di deorfanotrizzazione. A fronte di questi sforzi, descriviamo PRESTO-Tango, una piattaforma di risorse open source utilizzata per la profilazione simultanea del reclutamento transitorio di z-arrestin2 a circa 300 GPCR utilizzando un test reporter basato su TEV.

Abstract

Essendo la più grande e versatile superfamiglia genica e mediatori di una serie di vie di segnalazione cellulare, i recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) rappresentano uno degli obiettivi più promettenti per l'industria farmaceutica. Ergo, la progettazione, l'implementazione e l'ottimizzazione dei saggi di screening dei ligandi GPCR è fondamentale, in quanto rappresentano strumenti di controllo remoto per la scoperta di farmaci e per la manipolazione della farmacologia e dei risultati del GPCR. In passato, i saggi dipendenti dalla proteina G caratterizzavano quest'area di ricerca, rilevando eventi indotti dal ligando e quantificando la generazione di messaggeri secondari. Tuttavia, dall'avvento della selettività funzionale, così come una maggiore consapevolezza di diversi altri percorsi indipendenti dalla proteina G e dei limiti associati ai saggi dipendenti dalla proteina G, c'è una maggiore spinta verso la creazione di alternative saggi di screening dei ligandi GPCR. A questo scopo, descriviamo l'applicazione di una di queste risorse, la piattaforma PRESTO-Tango, un sistema di giornalista luciferata luciferasi che consente l'interrogatorio parallelo e simultaneo del GPCR-ome umano, un'impresa che in precedenza era considerata tecnicamente ed economicamente irrealizzabile. Sulla base di un saggio di reclutamento indipendente indipendente dalla proteina G-arrestin2, l'universalità della tratta mediata da z-arrestin2 e della segnalazione presso i GPCR rende PRESTO-TANGO uno strumento adatto per studiare circa 300 GPD umani non olfattivi, tra cui circa 100 recettori orfani. La sensibilità e la robustezza di PRESTO-Tango lo rendono adatto per schermi primari ad alto rendimento utilizzando librerie composte, impiegati per scoprire nuovi obiettivi GPCR per farmaci noti o per scoprire nuovi ligandi per i recettori orfani.

Introduzione

I recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) costituiscono la più grande e diversificata famiglia di proteine transmembrane, operando come interfacce di comunicazione tra una cellula e il suo ambiente¹. La versatilità dei GPR è evidenziata dalla loro capacità di rilevare una vasta gamma di ligandi – dai neurotrasmettitori ai nucleotidi, peptidi ai fotoni, e molti altri - così come la loro capacità di regolare numerose cascate di segnalazione a valle coinvolte nella crescita cellulare, migrazione, differenziazione, apoptosi, cottura cellulare, ecc^2,3. Considerando la loro ubiquità e il ....

Protocollo

1. Screening primario: coltura cellulare e semidici di placche

1. Per preparare piastre rivestite in poli-L-lisina (PLL), erogare 20 gradi/pozzetto di una soluzione di riserva di 25 g/mL di PLL in piastre ottiche bianche o nere con un pipetta multicanale elettronico o un dispenser reagente. Incubare le piastre a temperatura ambiente per 0,5–2 h.
   NOTA: Se si utilizzano le piastre nere 384-well, si aspettano che il segnale di sfondo sia inferiore rispetto alle piastre bianche. Si raccomanda nocedi nere per ridurre la smarginatura della luminescenza tra pozzi adiacenti.
2. Per conservare le piastre rivestite e lavare via il PLL in eccesso, rimuovere il P....

Risultati

Utilizzando il protocollo PRESTO-Tango presentato nel presente documento, un estratto di granulo cromaffina (CG) è stato esaminato contro 168 obiettivi GPCR non olfattivi, con la maggior parte dei quali sono recettori orfani. La profilazione di tale estratto è stata eseguita esaminando la mobilitazione di arresto z2 presso i recettori scelti, sulla base del principio progettato da Barnea et al.¹⁸ (Figura 1). Plasmid cDNA dei GPCR di interesse è stato preso dal kit PRE.......

Discussione

I GPCR conformazionalmente dinamici sono centrali elettriche di trasduzione del segnale. Le proprietà fisiochimiche delle tasche di legame di questi recettori eptahelici, così come la loro rilevanza fisiologica sottolineano la necessità di strumenti di screening dei ligandi GPCR. Come presentato in precedenza, l'analisi PRESTO-Tango è rapida, sensibile e user-friendly, prestandosi allo sviluppo di farmaci. Non solo questo saggio misura l'attivazione indotta dagli agonisti, ma può anche essere utilizzata per quantificare .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre di fondo ottiche a 384 pozzetti, base in polistirene polimerico, trattamento per colture cellulari, NERO, con coperchio, sterili	NUNC	12-566
Piastre ottiche inferiori a 384 pozzetti, base in polistirene polimerico, trattamento per colture cellulari, bianco, con coperchio, sterile	NUNC	12-566-1
384 pozzetti a fondo tondo, polipropilene, non trattato, blu, non sterile, senza coperchio	ThermoFisher	12-565-390
Antibiotico-Antimicotico	Wisent	450-115-EL
D-Luciferin, sale sodico	GoldBio	LUCNA
DMEM con L-Glutammina, 4,5 g/L di glucosio e piruvato di sodio	Corning	10-013-CV
Eppendorf Xplorer, 12 canali, variabile, 15– 300 µ L	Eppendorf	4861000155
Eppendorf Xplorer, 12 canali, variabile, 5– 100 µ L	Eppendorf	4861000139
Matrix Platemate 2x3	ThermoFisher	801-10001
MicroBeta 1450 Wallac	Perkin Elmer
Penicilina-Streptomicina	Wisent	450-201-EL
Poly-L-Lysine bromidrato	Millipore-Sigma	P2636-500MG
Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit	Addgene	Kit #1000000068