Articolo metodologico

Fabbricazione dell'interfaccia nervo periferica rigenerativa composita (C-RPNI) nel ratto adulto

DOI:

10.3791/60841

⸱

25 febbraio 2020

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, Division of Plastic Surgery, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor

In questo articolo

Sommario

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Il seguente manoscritto descrive un nuovo metodo per lo sviluppo di un sistema biologico di feedback neurale a circuito chiuso chiamato interfaccia nervo periferica rigenerativa composita (C-RPNI). Questo costrutto ha la capacità di integrarsi con i nervi periferici per amplificare i segnali motori efferenti, fornendo allo stesso tempo un feedback sensoriale afferente.

Abstract

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Recenti progressi nella neuroprotesi hanno permesso a coloro che vivono con perdita di estremità di riprodurre molte funzioni native all'estremità assente, e questo è spesso realizzato attraverso l'integrazione con il sistema nervoso periferico. Purtroppo, i metodi attualmente impiegati sono spesso associati a danni significativi ai tessuti che impediscono un uso prolungato. Inoltre, questi dispositivi spesso mancano di alcun grado significativo di feedback sensoriale in quanto la loro costruzione complessa smorza eventuali vibrazioni o altre sensazioni da cui un utente potrebbe aver precedentemente dipeso quando utilizza protesi più semplici. L'interfaccia nervo periferica rigenerativa composita (C-RPNI) è stata sviluppata come costrutto biologico stabile con la capacità di amplificare i segnali nervomotori efferenti, fornendo al contempo un feedback sensoriale afferente simultaneo. Il C-RPNI è costituito da un segmento di innesto dermico e muscolare libero fissato intorno a un bersaglio nervoso sensoriale misto, con reinnervazione del nervo motorio preferenziale dell'innesto muscolare e reinnervazione del nervo sensoriale dell'innesto dermico. Nei ratti, questo costrutto ha dimostrato la generazione di potenziali di azione muscolare composti (CMAP), amplificando il segnale del nervo bersaglio dal livello di micro- mill-volt, con rapporti segnale-rumore in media circa 30-50. La stimolazione del componente dermico del costrutto genera potenziali composti di azione nervosa sensoriale (CSTR) al nervo prossimale. Come tale, questo costrutto ha promesso utilità futura verso la realizzazione della protesi ideale e intuitiva.

Introduzione

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Le amputazioni dell'estremità interessano quasi 1 su 190 americani1e si prevede che la loro prevalenza aumenterà da 1,6 milioni attuali a oltre 3,6 milioni entro il 20502. Nonostante l'uso documentato per oltre un millennio, la protesi ideale deve ancora essere realizzata3. Attualmente, esistono protesi complesse in grado di molteplici manipolazioni articolari con il potenziale di riprodurre molte funzioni motorie dell'estremità nativa4,5. Tuttavia, questi dispositivi non sono considerati intuitivi in quanto il movimento protesico desiderato è in genere funzionalmente separato dal segnale di controllo di ingresso. Gli utenti in genere considerano queste "protesi avanzate" difficili da imparare e quindi non adatte per l'uso quotidiano1,6. Inoltre, protesi complesse attualmente sul mercato non forniscono alcun grado apprezzabile di sottile feedback sensoriale per un controllo adeguato. Il senso del tatto e della propriocezione sono fondamentali per svolgere le attività quotidiane, e senza questi, semplici atti come raccogliere una tazza di caffè diventano gravosi in quanto si basa interamente su segnali visivi7,8,9. Per questi motivi, le protesi avanzate sono associate a un significativo grado di stanchezza mentale e sono spesso descritte come gravose e insoddisfacenti5,10,11. Per affrontare questo problema, alcuni laboratori di ricerca hanno sviluppato protesi in grado di fornire un limitato grado di feedback sensoriale tramite interazione neurale diretta12,13,14,15, ma il feedback è spesso limitato a piccole aree sparse sulle mani e sulle dita12,13, e le sensazioni sono state notate per essere dolorose e innaturali a volte15. Molti di questi studi purtroppo mancano di un notevole follow-up a lungo termine e dell'istologia dei nervi per delineare gli effetti dei tessuti locali, notando al contempo il fallimento dell'interfaccia sulla scala da settimane a mesi16.

Per questa popolazione, il dispositivo protesico ideale fornirebbe un controllo motorio ad alta fedeltà insieme a un feedback somatosensoriale significativo dall'ambiente dell'individuo per tutta la vita. Critico per la progettazione di tale protesi ideale è lo sviluppo di un'interfaccia stabile e affidabile che consentirebbe la trasmissione simultanea di informazioni somatosensoriali afferenti con segnali motori efferenti. Le attuali interfacce uomo-macchina sono quelle che interagiscono direttamente con il sistema nervoso periferico, e i recenti sviluppi nel campo delle protesi neuro-integrate hanno lavorato per colmare il divario tra segnali bioelettrici e meccanici17. Le interfacce attuali utilizzate includono: piastre nervose flessibili14,15,18, colidi anti-neuralielettrodi 13,19,20,21,22,23, elettrodi penetranti di tessuto24,25,31,32, ed elettrodi intrafascicolari26,27 ,28. Tuttavia, ognuno di questi metodi ha dimostrato limitazioni per quanto riguarda la specificità del nervo, lesione dei tessuti, la degenerazione assonale, l'esaurimento della mielina e/o la formazione di tessuto cicatriziale associati alla risposta cronica del corpo estraneo16,17,18,19. Più recentemente, è stato ipotizzato che un fattore alla base dell'eventuale insufficienza degli elettrodi impiantati sia la differenza significativa nella modulizzazione di Young tra materiale elettronico e tessuto neurale nativo. Il tessuto cerebrale è soggetto a micromozione significativa su base giornaliera, ed è stato teorizzato che lo stress da taglio indotto dalle differenze nella forma di Young provoca infiammazione ed eventuali cicatrici permanenti30,31,32. Questo effetto è spesso aggravato nelle estremità, dove i nervi periferici sono soggetti sia alla micromozione fisiologica che alla macromozione intenzionale dell'estremità. A causa di questo movimento costante, è ragionevole concludere che l'utilizzo di un'interfaccia nervosa periferica completamente abiotica non è l'ideale, e un'interfaccia con una componente biologica sarebbe più adatta.

Per rispondere a questa necessità di una componente biologica, il nostro laboratorio ha sviluppato un'interfaccia nervosa biotica definita Regenerative Peripheral Nerve Interface (RPNI) per integrare i nervi periferici transecpati in un arto residuo con un dispositivo protesico. La fabbricazione di RPNI comporta l'impiantazione chirurgica di un nervo periferico in un innesto muscolare muscolare libero autologo, che successivamente si riscolla e reinnervanti. Il nostro laboratorio ha sviluppato questa interfaccia nervosa biologica negli ultimi dieci anni, con successo nell'amplificare e trasmettere segnali motori quando combinato con elettrodi impiantati in prove sia animali che umane, consentendo un adeguato controllo protesico con molteplici gradi di libertà2,34. Inoltre, abbiamo dimostrato separatamente il feedback sensoriale attraverso l'uso di nervi periferici incorporati in innesti dermici, chiamato Dermal Sensory Interface (DSI)3,35. Nelle amputazioni più distali, l'utilizzo simultaneo di questi costrutti è fattibile in quanto i fascicoli motori e sensoriali all'interno del nervo periferico bersaglio possono essere separati chirurgicamente. Tuttavia, per amputazioni di livello più prossimale, questo non è fattibile a causa della mescolanza di fibre motorie e sensoriali. La Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI) è stata sviluppata per amputazioni più prossimali, e comporta l'impiantamento di un nervo sensoriale-motorio misto in un costrutto costituito da innesto muscolare libero fissato ad un segmento di innesto dermico (Figura 1). I nervi periferici dimostrano una reinnervazione mirata preferenziale, quindi le fibre sensoriali riinnerizzeranno l'innesto dermico e le fibre motorie, l'innesto muscolare. Questo costrutto ha così la capacità di amplificare contemporaneamente i segnali motori fornendo un feedback somatosensoriale36 (Figura 2),consentendo la realizzazione della protesi ideale, intuitiva e complessa.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali vengono eseguiti sotto l'approvazione del Comitato per l'uso e la cura degli animali dell'Università del Michigan.

NOTA: ai ratti donatori è consentito l'accesso gratuito al cibo e all'acqua prima delle procedure di donazione di pelle e muscoli. L'eutanasia viene eseguita in anestesia profonda seguita da iniezione di cloruro di potassio intra-cardiaco con un metodo secondario di pneumotorace bilaterale. Qualsiasi ceppo di ratto può teoricamente essere utilizzato con questo esperimento; tuttavia, il nostro laboratorio ha ottenuto risultati costanti sia nei ratti Fischer F344 maschi che femmine (200-250 g) a due o quattro mesi di età. I ratti donatori devono essere isogeni ai ratti sperimentali.

1. Preparazione dell'innesto dermico

  1. Anestesizzare il ratto donatore in una camera di induzione utilizzando una soluzione del 5% di isoflurane in ossigeno a 0,8-1 L/min. Una volta che il ratto è stato anestesizzato, rimuovere dalla camera di induzione e posizionare su un cono naso respirante, abbassando l'isoflurane al 2-2,5% per il mantenimento dell'anestesia.
  2. Somministrare una soluzione di Carprofen (50 mg/mL) di 0,2 mL di solina salina sterile sottocutaneamente tra le scapole per l'analgesia.
  3. Applicare unguento lacrime artificiali su entrambi gli occhi per prevenire ulcere corneali.
  4. Utilizzando i clipper, radete l'intero arto posteriore inferiore, la regione della caviglia e i lati delle zampe.
  5. Pulire l'arto posteriore scelto e la superficie plantare della zampa con l'alcol, seguita da soluzione iodopovidone, terminando con una pulizia finale con alcool per rimuovere lo iodopovidone residuo.
  6. Utilizzando un trapano ad alta velocità per micromotore portatile con una pietra di lucidatura a grana fine rotonda rimovibile (4000 rpm), burrare la superficie plantare della zampa per rimuovere l'epidermide. Durante la baviera, applicare gocce di salina per non bruciare la pelle. Il derma sottostante avrà un aspetto lucido con sanguinamento individuato.
  7. Applicare un laccio emostatico all'estremità inferiore per rallentare il flusso sanguigno.
  8. Rimuovere bruscamente la pelle plantare con un #15 bisturi e mettere in garza salina-umida per prevenire la disidratazione. Alcuni tessuti tendino sinosa e connettivo saranno intrinsecamente rimossi con la pelle in questo passaggio e saranno rimossi in seguito.
  9. Applicare l'involucro di garza sul piede sanguinante per rallentare l'emorragia. Ripetere i passaggi da 1.5-1.9 se si esegue due costrutti.
  10. Sotto un microscopio (20 volte l'ingrandimento), rimuovere il tessuto tendino sosia e connettivo dallo strato profondo dell'innesto cutaneo utilizzando micro-forbici. Fare attenzione a non fare buchi nell'innesto. L'innesto dermico assottigliato deve essere leggermente opaco contenente solo derma, misurando circa 0,5 cm x 1,0 cm di dimensione.
  11. Mettere in garza salina-umida fino a quando pronto per C-RPNI costruire la fabbricazione. Gli innesti devono essere utilizzati entro 2 ore dal raccolto.

2. Preparazione dell'innesto muscolare

  1. Fare un'incisione longitudinale lungo l'aspetto anteriore dell'arto posteriore inferiore da appena sopra la caviglia a appena sotto il ginocchio con un #15 bisturi. Disseta attraverso il tessuto sottocutaneo per esporre la muscolatura sottostante.
  2. All'aspetto distale dell'incisione, esporre gli inserimenti tendino della muscolatura degli arti inferiori. Tibialis anterior (TA) è tipicamente il più grande e più anteriore dei muscoli, e appena sotto e posteriore a questo muscolo si trova l'estensore digitorum longus (EDL). Isolare il tendine EDL distale dagli altri tendini della zona, facendo attenzione a non incise il suo inserimento in questo punto.
  3. Garantire l'isolamento del tendine corretto inserendo entrambe le tine di una forza sotto il tendine ed esercitando una pressione verso l'alto aprendo le pinze per causare escursione tendina. Manipolazione di questo tendine dovrebbe causare tutte le diciture per estendere contemporaneamente.
  4. Eseguire una tenotomia distale con forbici aride e separare il muscolo dai tessuti circostanti senza mezzi termini con tenotomie (o altre forbici con punta smussata) lavorando proporzionalmente per trovare l'origine tendinosa.
  5. Una volta visualizzato il tendine prossimale, eseguire nuovamente una tenotomia utilizzando forbici acute. Mettere l'innesto muscolare in una garza salina-inumidita per prevenire la disidratazione.
  6. Una volta che tutti gli innesti desiderati sono stati rimossi da un ratto donatore, eutanasia principalmente per iniezione intra-cardiaca di KCl (1-2 mEq K/kg) seguito da eutanasia secondaria con pneumothorax foratura bilaterale con una lama #15.

3. Isolamento e preparazione del nervo peroneale comune

  1. Anestesia e fornire analgesia al ratto sperimentale secondo il protocollo descritto nei passaggi 1.1-1.3.
  2. Rasare la coscia desiderata e pulire con alcool, betadine, terminando con l'alcol per rimuovere le tracce di betadine.
  3. Spostare l'animale dalla tabella di preparazione chirurgica al tavolo chirurgico al microscopio e posizionarlo sul pad di riscaldamento con sonda di temperatura per il mantenimento della temperatura corporea. Mantenere l'isoflurane al 2-2,5% e l'ossigeno a 0,8-1 L/min.
  4. Contrassegnare l'incisione, che si estende da appena distale a tacca sciatica alla parte inferiore del ginocchio. Questa marcatura deve essere inferiore e inclinata lontano dal femore. Fare l'incisione con una lama #15 incisivo attraverso il bicipite sottostante femoris fascia.
  5. Sezionate con cura attraverso il muscolo bicipiti femoris con un emotologo o microforbici con punta smussata nello spazio sottostante bicipiti femoris.
    NOTA: Il nervo sciatico viaggia approssimativamente nella stessa direzione dell'incisione iniziale che è stata fatta. Ci sono tre rami, tipicamente con nervo salare posteriore e comune nervo peroneale e tibiale che viaggiano superficiale e profondo al ginocchio, rispettivamente.
  6. Dopo l'identificazione del nervo peroneale comune (CP), utilizzando un paio di pinze micro-, con punta fine e micro-forbici, isolare attentamente il nervo CP dagli altri rami sciatici e rimuovere qualsiasi distally del tessuto connettivo persistente.
  7. Nel punto in cui il nervo attraversa la superficie del ginocchio, transeggiare bruscamente il nervo con un paio di micro-forbici.
    NOTA: L'uso di forbici affilate è estremamente importante in questa fase in quanto causare traumi significativi al nervo potrebbe aumentare il rischio di formazione di neuroma.
  8. Liberare con cura qualsiasi tessuto connettivo rimanente dal nervo CP e lavorare in modo approssimativo per liberare il nervo a una lunghezza di circa 2 cm.

4. Fabbricazione costrutto Costrutto C-RPNI

  1. Rimuovere l'innesto muscolare dalla garza salina-umida e rimuovere tutto il tessuto tendinoso centrale, nonché un piccolo segmento centrale di epimysium. Lasciare intatte le estremità tendine.
  2. Utilizzando un 8-0 sutura di nylon, fissare l'epineurium dell'estremità transeclata del nervo CP all'area dell'innesto muscolare priva di epimysio con due punti interrotti su entrambi i lati del nervo.
  3. Fissare l'innesto muscolare al periosteo del femore con un singolo punto interrotto di nylon 6-0 sia a livello proximo che distatuante con la giunzione nervo-muscolare rivolta lontano dal femore.
    NOTA: Fissare il muscolo in modo che sia a normale lunghezza rilassata. Cercate di non allungare il muscolo in modo significativo o lasciare troppo lassismo durante la sicurezza.
  4. Posizionare un 8-0 punto di nylon al margine centrale inferiore dell'epimysio dell'innesto muscolare, fissandolo all'epineurio del nervo CP in modo da creare lassità nel nervo all'interno dell'innesto muscolare e contribuire ad alleviare qualsiasi tensione futura a cui può essere esposto con successiva ambulation.
  5. Rimuovere l'innesto cutaneo dalla garza salina-umida e disporlo sull'innesto muscolare in modo tale da coprire completamente il nervo e la maggior parte del muscolo. Assicurarsi che il margine profondo del derma sia appoggiato sul muscolo. Tagliare qualsiasi derma che si estende oltre il bordo del muscolo.
  6. Fissare l'innesto cutaneo all'innesto muscolare circonferenzalmente con 8-0 suture interrotte in nylon. In genere, vengono utilizzate 4-8 suture totali a seconda delle dimensioni del costrutto.
  7. Chiudere la fascia bicipite femoris sopra il costrutto in modo da corsa con 5-0 sutura cromica.
  8. Chiudere la pelle sovrastante con 4-0 sutura cromica in modo da correre.
  9. Swab l'area chirurgica con un alcoltto e applicare unguento antibiotico.
  10. Cessate l'anestesia inalazionale e permettete al ratto di recuperare con cibo e fonti d'acqua separate dai compagni di gabbia.

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Risultati

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La fabbricazione del costrutto è considerata infruttuosa se i ratti sviluppano un'infezione o non sopravvivono all'anestesia chirurgica. Ricerche precedenti hanno indicato che questi costrutti richiedono circa tre mesi per riscolitare e reinnervare2,3,17,36. Dopo il periodo di recupero di tre mesi, è possibile eseguire il test di costruzione per esaminare la fat...

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Discussione

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Il C-RPNI è un nuovo costrutto che fornisce l'amplificazione simultanea dei segnali motori di un nervo bersaglio con fornitura di feedback sensoriale afferente. In particolare, il C-RPNI ha un'utilità unica per coloro che vivono con amputazioni prossimali in quanto i loro fascicoli motori e sensoriali non possono essere facilmente separati meccanicamente durante l'intervento chirurgico. Invece, il C-RPNI utilizza le proprietà di reinnervazione preferenziale intrinseche del nervo stesso per incoraggiare la reinnervazione ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno divulgazioni.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare Jana Moon per l'assistenza tecnica esperta. Gli studi presentati in questo documento sono stati finanziati attraverso una sovvenzione R21 (R21NS104584) a SK.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
#15 BisturiAspen Surgical, IncRef 371115Lame chirurgiche in acciaio al carbonio Rib-Back (#15)
Sutura cromica 4-0EthiconSKU# 1654GP-3 Ago da taglio inverso
5-0 Sutura cromicaEthiconSKU# 687GP-3 Ago da taglio inverso
6-0 Sutura EthilonEthiconSKU# 697GP-1 Ago da taglio inverso (sutura in nylon)
8-0 Sutura monofilamentoAROSurgicaT06A08N14-13Sutura monofilamento in poliammide nera su ago conico filettato
Ratti sperimentaliEnvigoF344-NH-sdI ratti sono Fischer F344 Ceppo
Fluriso (isofluorano)VetOne13985-528-40anestetico per inalazione
Trapano ad alta velocità con StoneMaster MechanicModello 151369Utensile rotante portatile; il kit viene fornito con più pietre a grana fine
OssigenoGas criogeniciUN1072Bombole di ossigeno standard per uso medico
Cloruro di potassioAPP Pharmaceuticals63323-965-20Forma iniettabile, 2 mEq/mL
Iodio povidone USPMediChoice65517-0009-1topica al 10%, può utilizzare un flacone per più preparazioni chirurgiche
Unguento oftalmico Puralube VetDechra17033-211-38Unguento protettivo corneale da utilizzare durante
la procedura Rimadyl (Caprofen)Zoetis, Inc.NADA# 141-199Stereomicroscopio in forma iniettabile, 50 mg/mL
LeicaM60L'utente può regolare l'ingrandimento in base alle proprie preferenze
Strumenti chirurgiciStrumenti per le scienze finiVariL'utente può scegliere gli strumenti in base alle preferenze personali o tra quelli attualmente disponibili nel proprio laboratorio
Unguento antibiotico triploMediChoice39892-0830-2L'unguento viene fornito in bustine sterili e usa e getta VaporStick
3SurgivetV7015Torre per anestesia con spazio per isofluorane e bomboletta di ossigeno
Webcol Alcohol PrepCovidenRef 6818Salviette per la preparazione dell'alcol; utilizzare una nuova salvietta per ogni preparazione
Micromotore Soluzione Modello

Riferimenti

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