È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Test opsono-aderenza per valutare gli anticorpi funzionali nello sviluppo del vaccino contro bacillus anthracis e altri agenti patogeni incapsulati

3.1K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/60873

⸱

19 maggio 2020

 ,  ,  , 
1Bacteriology Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 2Headquarters Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 3Bioqual

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Il saggio opsono-aderenza è un metodo alternativo al saggio di uccisione opsono-fagocitica per valutare le funzioni opsoniche degli anticorpi nello sviluppo del vaccino.

Abstract

Il saggio opsono-aderenza è un saggio funzionale che enumera l'attaccamento di agenti patogeni batterici ai fagociti professionisti. Poiché l'aderenza è necessaria per la fagocitosi e l'uccisione, il saggio è un metodo alternativo ai test di uccisione opsono-fagocitica. Un vantaggio del saggio opsono-aderenza è la possibilità di utilizzare agenti patogeni inattivati e linee cellulari di mammiferi, che consente la standardizzazione in più esperimenti. L'uso di un agente patogeno inattivato nel saggio facilita anche il lavoro con agenti infettivi di livello di biosicurezza 3 e altri agenti patogeni virulenti. Nel nostro lavoro, il saggio opsono-aderenza è stato utilizzato per valutare la capacità funzionale degli anticorpi, dai sieri di animali immunizzati con un vaccino a base di capsula di antrace, per indurre l'aderenza del Bacillus anthracis fisso a una linea cellulare di macrofagi del topo, RAW 264.7. La microscopia a fluorescenza automatizzata è stata utilizzata per catturare immagini di bacilli che aderiscono ai macrofagi. L'aumento dell'aderenza è stato correlato con la presenza di anticorpi anti-capsula nel siero. I primati non umani che mostravano alte concentrazioni di anticorpi anti-capsula sierati erano protetti dalla sfida dell'antrace. Pertanto, il saggio opsono-aderenza può essere usato per chiarire le funzioni biologiche degli anticorpi specifici dell'antigene nei sieri, per valutare l'efficacia dei candidati al vaccino e di altre terapie e per servire come possibile correlato dell'immunità.

Introduzione

Riconoscimento, aderenza, internalizzazione e degradazione di un agente patogeno sono parte integrante della fagocitosi1, una via saliente nella risposta immunitaria innata dell'ospite descritta per la prima volta da Ilya Metchnikoff nel 18832,3. I leucociti fagocitici, così come altre cellule del sistema immunitario, sono altamente discriminatori nella loro selezione di bersagli; sono in grado di distinguere tra "non-sé infettivo" e "sé non infettivo" attraverso modelli molecolari associati agli agenti patogeni per il loro repertorio di recettori di riconoscimento dei modelli (PRR)4,5. Il riconoscimento dell'ospite di un agente patogeno può verificarsi anche con il legame delle opsonine ospiti, come complemento eanticorpi 6. Questo processo, chiamato opsonizzazione, ricopri l'agente patogeno con queste molecole, migliorando l'internalizzazione al legame con i recettori opsonici (ad esempio, complemento e recettori Fc) sulle cellule fagocitiche6. Affinché un agente patogeno aderisca a un fagocita, è necessario il legame collettivo di più recettori con i loro ligandi affini. Solo allora l'aderenza può attivare e sostenere le cascate di segnalazione all'interno della cella host per avviare l'internalizzazione6.

A causa dell'importanza della fagocitosi nella clearance degli agenti patogeni e nella prevenzione delle infezioni, gli agenti patogeni extracellulari hanno sviluppato numerosi modi per sovvertire questo processo per prolungarne la sopravvivenza. Una strategia importante è la produzione di una capsula polimerica anionica (ad esempio polisaccaride o poliaminoacido) che è anti-fagocitica in virtù della sua carica, è scarsamente immunogenica e protegge le molecole sull'involucro batterico dai PRR6,7. Agenti patogeni come Cryptococcus neoformans e Streptococcus pneumoniae hanno capsule composte da polimeri saccharide, mentre Staphylococcus epidermidis e alcune specie di Bacillus producono acido poli-ɣ-glutammico (PGGA)7,8. Tuttavia, altri agenti patogeni producono capsule che assomigliano all'io non infettivo. Ad esempio, lo Streptococcus pyogenes e un ceppo patogeno di B. cereus hanno una capsula di acido ialuronico che non è solo anti-fagocitico ma che potrebbe anche non essere riconosciuta come estranea dal sistema immunitario9,10.

La coniugazione della capsula in proteine portanti li converte da antigeni poveri e indipendenti dalla T in antigeni altamente immunogenici dipendenti da T che possono indurre alti tigatori di anticorpi anti-capsula sierati11,12. Questa strategia viene utilizzata per i vaccini autorizzati contro S. pneumoniae, Haemophilus influenzaee Neisseria meningitides11. Le attività opsoniche degli anticorpi anti-capsula sono state comunemente valutate da test di uccisione opsono-fagocitica (OPKA)13,14,15,16. Questi test testano se gli anticorpi funzionali possono innescare la fagocitosi e uccidere14. Tuttavia, l'uso di OPKA con agenti patogeni infettivi, come agenti e tossine di selezione biologica di livello 1 (BSAT), tra cui B. anthracis17, è pericoloso e presenta rischi per la sicurezza; questi saggi richiedono un'ampia gestione di un agente selezionato. La manipolazione di agenti selezionati può essere effettuata solo in laboratori di livello di biosicurezza limitato 3 (BSL-3); il lavoro in questi settori richiede procedure operative prolungate a causa delle numerose precauzioni di sicurezza che devono essere seguite. Anche i laboratori BSL-3 in genere non sono dotati delle attrezzature specializzate utilizzate per il lavoro OPKA, come microscopi e citometri. Pertanto, abbiamo sviluppato un saggio alternativo basato sull'uso di batteri inattivati18,19. Ci riferiamo a questo come un saggio opsono-aderenza (OAA) che non dipende dall'internalizzazione e dall'uccisione delle uscite di saggio; invece, l'aderenza di agenti patogeni inattivati opsonizzati è usata come indice di fagocitosi. Meccanicamente, L'OAA è un sostituto adatto perché l'aderenza avviene a priori ed è intimamente intrecciata con l'internalizzazione e l'uccisione intracellulare. Dal punto di vista della biosicurezza, l'OAA è preferito perché richiede una manipolazione minima di un agente infettivo, è sperimentalmente di durata inferiore rispetto all'OPKA e può essere eseguito nei laboratori BSL-2 dopo che uno stock di agente patogeno inattivato è stato prodotto e trasferito.

Dimostriamo l'utilizzo dell'OAA per esaminare la funzione opsonica degli anticorpi anti-capsule trovati nei sieri di primati non umani (NMP) vaccinati con un coniugato a capsula [cioè PGGA da B. anthracis coniugato al complesso proteico della membrana esterna (OMPC) di Neisseria meningitides]20. I bacilli opsonizzati al siero sono stati incubati con una linea cellulare di macrofagi di topo aderente, RAW 264.7. Dopo la fissazione, il monostrato cellulare e i bacilli aderenti sono stati immaginiti dalla microscopia a fluorescenza. L'aderenza batterica è aumentata quando i bacilli sono stati incubati con siero da NSP vaccinati con il coniugato della capsula rispetto al siero di controllo20. Aderenza correlata alla sopravvivenza della sfida dell'antrace20,21. Pertanto, l'uso di OAA ha caratterizzato la funzione degli anticorpi anti-capsula e ha notevolmente facilitato il test del nostro candidato vaccino.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

In conformità con la legge sul benessere degli animali, la politica del servizio sanitario pubblico e altri statuti e regolamenti federali relativi agli animali e agli esperimenti che coinvolgono animali, la ricerca qui descritta è stata condotta nell'ambito di un protocollo approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. La struttura in cui è stata condotta questa ricerca è accreditata dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali di laboratorio, internazionale e aderisce ai principi indicati nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, Consiglio Nazionale delle Ricerche, 201124.

1. Coltura e manutenzione della linea cellulare, RAW 264.7

NOTA: Le seguenti procedure devono essere eseguite con tecniche asettiche.

  1. Scaldare il siero bovino fetale (FBS) in un bagno d'acqua a 56 °C per 30 minuti per inattivare il complemento.
    NOTA: Il tempo di inattivazione di 30 minuti inizia quando FBS raggiunge i 56 °C. Per monitorare la temperatura, riscaldare un volume simile di acqua in un becher nello stesso bagno d'acqua. Una volta che l'acqua raggiunge i 56 °C, inizia il conto alla rovescia di 30 minuti per FBS. In alternativa, FBS che è stato inattivato dal calore è anche disponibile in commercio.
  2. Preparare il mezzo per raw 264.7 cellule combinando il 90% di DMEM con glucosio alto e FBS inattivato al calore al 10% (v/v). Aggiungere L-glutammina ad una concentrazione finale di 6 mM.
    NOTA: DMEM con alto glucosio è formulato con 4 mM L-glutammina. L'integrazione della L-glutammina a 6 mM favorisce una crescita cellulare costante. 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina possono essere aggiunti per prevenire la contaminazione. Un'altra linea cellulare murina comune, J774A.1, può anche essere utilizzata ed è coltivata in condizioni simili.
  3. Scongelare una fiala congelata di cellule in un bagno d'acqua a 37 °C e rimuovere dal bagno non appena si scioglie. Aggiungere il contenuto aseticamente a un mezzo completo da 5 ml in un tubo conico. Invertire due volte il tubo conico e ruotare a 300 x g per 5 min per le celle a pellet.
  4. Aspirare il mezzo utilizzando un pipetto Pasteur sterile attaccato a un vuoto per rimuovere l'agente congelante. Resuspend cell pellet in 5 mL di mezzo fresco.
  5. Trasferire la sospensione in un pallone o piatto trattato con coltura tissutale. Aggiungere abbastanza mezzo per coprire completamente il fondo del pallone e ruotare per distribuire uniformemente le cellule. Indicare il numero di passaggio a partire da "1".
  6. Incubare le cellule a 37 °C in presenza del 5% di CO2 e dell'umidità fino a raggiungere la confluenza dal 95% al 100%. Controllare le cellule ogni giorno al microscopio a partire dal secondo giorno di incubazione. Non permettere alle celle di raggiungere la confluenza >100% in quanto ciò causerà il decollo e la morte delle cellule.
    NOTA: Il tempo necessario per raggiungere la confluenza dipende dal numero di cellule vive placcate e dall'area di crescita del pallone. Pertanto, è prudente controllare le cellule ogni giorno.
  7. Cellule di sottocoltura raschiando e diluendo il patrimonio cellulare in mezzo fresco consentendo almeno due giorni di crescita tra i raschiamenti. Aumentare il numero di passaggio di 1 con ogni sottocultura.
    NOTA: Il passaggio e la raschiatura immediata il giorno successivo si tradurranno in una perdita più rapida dell'aderenza generale delle cellule nel tempo. Raw 264.7 cellule devono essere utilizzate solo fino a circa il passaggio 15.
  8. Per placcare RAW 264.7 celle per il saggio OAA, sostituire con mezzo fresco e utilizzare un raschietto cellulare per raschiare delicatamente le cellule dal pallone. Pipetta su e giù per rompere i grumi cellulari per un più facile conteggio delle celle.
    NOTA: Il metodo tradizionale per la subcultura di RAW 264.7 è la raschiatura. Nella nostra esperienza, l'uso della tripside fa sì che le cellule RAW 264.7 perdano aderenza nel tempo più velocemente rispetto alla raschiatura.
  9. Per contare le celle, diluire volumi uguali di celle e cercare una soluzione blu. Caricare 10 μL su un emocitometro. Osservare e contare il numero di cellule vive che escludono il colorante utilizzando un microscopio composto invertito con una lente obiettivo 10x.
  10. Piastra 1,4 x 104 celle vitali per pozzo in una piastra inferiore piatta di vetro spessa 96 ben 0,15 μm (piastra #1). Consentire alle cellule di crescere per 3 giorni. Sostituire il mezzo trascorso un giorno prima di eseguire OAA.
    NOTA: Dopo 3 giorni di incubazione, il numero di cellule dovrebbe essere di circa 5 x 104/ bene.

2. Coltura e preparati batterici

NOTA: La specie batterica utilizzata in questo protocollo è un ceppo virulento incapsulato, B. anthracis Ames. Tutte le manipolazioni con questa specie richiedono adeguate autorizzazioni di biosicurezza e sicurezza e devono essere eseguite in un armadio di sicurezza biologica di classe II o classe III situato in un laboratorio BSL-3. Seguire le procedure operative istituzionali per il lavoro BSL-3 e per l'uso di dispositivi di protezione individuale durante la manipolazione dei batteri.

  1. Preparare il brodo di infusione di cuore cerebrale (BHI) sciogliendo 37 g di polvere BHI in acqua da 1 L e autoclave a 121 °C per 15 minuti. Conservare il brodo a temperatura ambiente.
  2. Preparare la soluzione di bicarbonato di sodio all'8% in acqua e sterilizzare utilizzando una siringa filtrante da 0,20 μm. Conservare la soluzione a 4 °C e utilizzarla entro 1 giorno.
  3. Mescolare 8 g di brodo nutriente, 3 g di estratto di lievito e 15 g di agar in 1 L di acqua per preparare piatti di agar NBY. Autoclave a 121 °C per 15 min. Versare nelle piastre di Petri e lasciare solidificare. Conservare le lastre a 4 °C.
    NOTA: Le piastre di agar NBY possono essere fatte con o senza bicarbonato di sodio. L'aggiunta di bicarbonato di sodio alle placche di brodo e agar induce la crescita di colonie di mucoidi costituite da bacilli incapsulati. La concentrazione finale di bicarbonato di sodio sia in mezzi liquidi che solidi è dello 0,8%.
  4. Preparare il brodo di coltura per B. anthracis mescolando il 50% di brodo BHI autoclavato, il 40% di FBS e la soluzione di bicarbonato di sodio al 10% (v/v).
    NOTA: Questo brodo è formulato per produrre brevi catene di bacilli incapsulati.
  5. Preparare un piatto principale di B. anthracis strizzandolo per l'isolamento su una piastra di agar NBY da uno stock di spore un giorno prima di coltivare in brodo. Incubare a 37 °C.
  6. Inoculare 30 ml di brodo di coltura in un pallone ventilato da 250 ml con diverse colonie di B. anthracis.
    NOTA: È necessario uno specifico rapporto volume/superficie del brodo, come specificato qui, per produrre bacilli incapsulati al massimo.
  7. Agitare la coltura del brodo a 125 giri/min, 37 °C con 20% di CO2 e umidità per 18-24 ore.
    NOTA: La coltivazione di B. anthracis a temperature superiori a 37 °C può inibire la produzione di capsule.
  8. Utilizzare la colorazione negativa con inchiostro indiano per garantire un incapsulamento sufficiente e che i bacilli siano in catene corte (1-5 bacilli/catena) prima della fissazione (vedere la sezione 3).
  9. Per determinare le unità di formazione delle colonie (CFU), diluire serialmente 100 μL di coltura 1:10 nella soluzione di soluzione di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e diluizioni di coltura delle placche sulle piastre di agar del sangue di pecora. Incubare per 12-18 h a 37 °C. Contare i CFC e determinare il numero di batteri per mL di coltura.
    NOTA: Il conteggio può anche essere eseguito utilizzando un emocitometro al microscopio una volta che i batteri sono stati riparato. Tuttavia, questo non è raccomandato perché i bacilli sono difficili da vedere sotto basso ingrandimento.
  10. Aggiungere il 16% di paraformaldeide (PF) all'intero volume della coltura batterica ad una concentrazione finale del 4% di PF per fissare i bacilli. Agitare lentamente su uno shaker a temperatura ambiente per 7 giorni.
    NOTA: Sette giorni di incubazione nel 4% di PF si basano sulla procedura operativa standard istituzionale USAMRIID per la fissazione dei bacilli vegetativi.
  11. Per rimuovere il fissativo e testare la sterilità, lavare tre volte 4 ml (10% di volume) di sospensione batterica fissa in un tubo conico da 50 ml per centrifugazione a ≥3000 x g per 45 min e utilizzando un 30 mL/lavaggio con PBS. Conservare il campione rimanente in PF al 4% a 4 °C.
    NOTA: Dopo la pellettizzazione, il pellet batterico è soffice a causa della presenza di capsula. Fare attenzione a non disturbare il pellet durante il lavaggio. È necessario rimuovere tutto il fissatore in modo che non interferisca con il test di fattibilità. Se necessario, aumentare il numero di lavaggi.
  12. Per le prove di vitalità, inoculare 40 mL di un mezzo di crescita batterico (ad esempio brodo BHI) con 4 mL di sospensione lavata (≤ 10% del volume di brodo) e incubare a 37 °C per 7 giorni. Controllare la densità ottica a 600 nm prima e dopo 7 giorni per misurare la torbidità.
  13. Dopo 7 giorni di incubazione nella coltura del brodo, ≥100 μL di brodo su una piastra di agar e incubare per altri 7 giorni. Se non si vede alcun aumento della torbidità e nessuna crescita sulle piastre, la coltura originale è considerata sterile e può essere trasferita in un laboratorio BSL-2.
    NOTA: Il Federal Select Agent Program22 impone che l'inattivazione di B. anthracis possa essere trasferita solo dai laboratori BSL-3 dopo aver dimostrato la completa sterilità del campione. Il test di vitalità per l'inattivazione B. anthracis consiste nel coltivare il 10% del campione in brodo per 7 giorni seguito da una coltura su terreno solido per altri 7giorni 22,23. Segui le linee guida istituzionali per ricevere l'approvazione del trasferimento una volta stabilita la sterilità.

3. Colorazione negativa e microscopia leggera per osservare catene di incapsulamento e bacilli

  1. Mescolare sospensioni batteriche da 5 μL con 2 μL di inchiostro indiano su uno scivolo al microscopio. Posizionare un vetro di copertura spesso 1 o 1,5 μm sopra la sospensione senza creare bolle.
    NOTA: Lo smalto per unghie può essere utilizzato per sigillare il vetro di copertura sullo scivolo.
  2. Osservare le sospensioni batteriche utilizzando una lente obiettivo olio da 40x a 100x su un microscopio leggero. Assicurarsi che i bacilli siano incapsulati osservando una zona di gioco (la capsula esclude l'inchiostro indiano) che circonda ogni batterio e che le catene di bacilli siano corte.

4. Etichettatura FITC dei batteri

  1. Sciogliere l'isotiocianato di fluoresceina (FITC) nel solfossido di dimetile ad una concentrazione di 2 mg/mL.
  2. Misurare il volume di stock batterico inattivato.
  3. Lavare il materiale 3 volte in PBS per rimuovere il fissatore.
  4. Aggiungere la soluzione FITC ad una concentrazione finale di 75 μg/mL. Agitare lentamente la miscela per 18-24 ore a 4 °C.
  5. Lavare tre volte i batteri pellettizzazione a ≥3000 x g, 45 min e utilizzando 30 mL PBS/lavaggio per rimuovere il FITC in eccesso. Assicurarsi che il pellet soffice non sia disturbato durante il lavaggio. Riutilizza i bacilli in PBS nello stesso volume iniziale.
  6. Aliquota e conservare i bacilli in microtubi a -20 °C fino all'uso. Non congelare/scongelare i bacilli più volte in quanto i bacilli potrebbero perdere capsula.

5. Opsonizzazione batterica

  1. Il calore inattiva un piccolo volume di sieri di prova (da SMP) a 56 °C per 30 minuti in un blocco termico.
  2. Scongelare e lavare i batteri marcati FITC con PBS 2x mediante pellettizzazione a 15000 x g per 3-5 minuti. Resuspend in PBS nello stesso volume iniziale.
  3. In una piastra inferiore ben rotonda 96 (piastra #2), diluire serialmente i sieri di prova in mezzo cellulare. In un'altra piastra inferiore ben rotonda (piastra #3), aggiungere 10 μL di sieri di prova diluiti in ogni pozzo.
    NOTA: In ogni piatto, PBS e normali sieri di scimmie sono stati inclusi al posto dei sieri di prova diluiti come controlli negativi. Abbiamo anche scelto un siero di prova come controllo positivo per generare una curva standard per normalizzare tutti i test eseguiti in giorni diversi. Il siero del test di controllo positivo è stato scelto arbitrariamente perché abbondante.
  4. Per placcare #3, aggiungere 10 μL di complemento di coniglio appena ricostituito.
    NOTA: Una volta ricostituito, scartare il complemento di coniglio rimanente; non ricongelare e scongelare.
  5. Per placcare #3, aggiungere il volume appropriato di bacilli etichettati FITC per una molteplicità di infezione di 1:20. Ad esempio, aggiungere il volume che contiene 5 x 104 x 20 bacilli per 5 x 104 celle. Completa ogni pozzo in lamiera #3 con il volume appropriato di cellulare medio-totale 105 μL.
    NOTA: La #1, che contiene cellule, riceve 100 μL di batteri opsonizzati con i restanti 5 μL come volume vuoto. Abbiamo testato ogni diluizione dei sieri di prova in duplice copia.
  6. Incubare la #3 a 37 °C per 30 min in presenza del 5% di CO2 con umidità per opsonizzare i bacilli.

6. Saggio di aderenza ed etichettatura fluorescente delle cellule di mammifero

  1. Mantenere tutti i reagenti a 37 °C prima dell'uso.
  2. Posizionare la #1, che contiene cellule aderenti, su un blocco termico a 37 °C.
  3. Utilizzare un pipettor multicanale per rimuovere il mezzo trascorso dai pozzi e sostituire rapidamente con 100 μL di batteri opsonizzati dalla piastra #3. Assicurarsi che non siano state generate bolle nei pozzi durante la pipettazione. Incubare la piastra #1 a 37 °C con 5% di CO2 e umidità per 30 minuti per aderenza.
  4. Lavare ogni pozzo 5x con PBS da 150 μL sopra un blocco termico a 37 °C per rimuovere i bacilli non attaccati.
    NOTA: Fare attenzione a garantire che le cellule non vengano disperse accidentalmente durante il lavaggio.
  5. Diluire il 16% di PF con PBS 1:4 per fare il 4% di PF. Fissare le celle con 4% di PF per 1 h aggiungendo 150 μL ad ogni pozzo. Lavare le celle 2 volte con PBS.
  6. Mescolare 2 μL HCS (screening ad alto contenuto) Orange Cell Stain in 10 mL PBS. Aggiungere 150 μL di questa soluzione di colorazione a cellule fisse e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
  7. Lavare i pozzi 2 volte con PBS.
  8. Conservare a 4 °C fino alla microscopia.

7. Microscopia

NOTA: In generale, un microscopio a fluorescenza automatizzata ad alta produttività faciliterà l'imaging per l'OAA. Se non è disponibile un sistema automatizzato, le immagini fluorescenti dei bacilli aderenti possono essere prese manualmente21. In questo studio20,bacilli aderenti e monostrati cellulari sono stati coniati utilizzando il sistema di microscopia a scansione laser Zeiss 700 con apparecchiature specializzate; il nostro sistema era composto dal microscopio invertito Zeiss Axio Observer Z1 dotato di uno stadio automatizzato, dal modulo Definite Focus, dall'obiettivo 40 x NA 0.6, dalla telecamera Axio Cam HRc e dal software Zen 2012 (Blue Edition). Le immagini acquisite sono immagini widefield, non immagini confocali. Il seguente protocollo è inteso come una configurazione al microscopio di base applicabile a una varietà di sistemi di microscopia automatizzati.

  1. Incubare la #1 a temperatura ambiente per 30 minuti. Accendere il microscopio e le relative apparecchiature.
    NOTA: L'acclimatazione a temperatura ambiente impedisce la formazione di condensa sulla piastra di vetro durante l'imaging. Inoltre, impedisce la sfocatizzazione a causa dello spostamento della temperatura.
  2. Posizionare la piastra sul palco e concentrarsi sulle celle utilizzando il campo luminoso o il contrasto di fase.
  3. Selezionare il formato 96 e l'impostazione della piastra. Selezionare le impostazioni del canale.
    NOTA: L'eccitazione di picco e la lunghezza d'onda di emissione di FITC sono di 495/519 nm; la macchia di cellule arancioni HCS è di 556 e 572 nm. Altri fluorofori possono essere utilizzati a seconda dei filtri disponibili al microscopio.
  4. Selezionare l'impostazione per la modalità riquadro. Indicare il numero di immagini da acquisire.
    NOTA: la funzione di piastrellatura consente l'acquisizione di più posizioni in un pozzo campione e può essere impostata per acquisire immagini in un accodamento o in un formato casuale. Abbiamo immaginato 10 aree casuali per pozzo.
  5. Cambia la modalità di acquisizione in "bianco e nero" o "monocromatico" e binning ≥ 2x2.
    NOTA: L'impostazione del binning da 1x1 a 2x2 o 4x4 aumenterebbe la velocità della microscopia, ma comporterebbe anche una risoluzione inferiore dell'immagine. Per l'OAA, è sufficiente utilizzare queste impostazioni poiché il saggio enumera sia i macrofagi che i batteri aderenti.
  6. Attivare il modulo di messa a fuoco automatica o di messa a fuoco. Indicare la frequenza con cui deve essere eseguita la funzione di messa a fuoco automatica. Attivare la funzione Z stack, se disponibile. Indicare il numero di pile Z che cattureranno lo spessore del monostrato di cellule e dei bacilli aderenti.
    NOTA: il numero di pile Z scelte aumenterà il tempo di microscopia, ma assicurerà che un'immagine con lo stato attivo corretto sia scattata in ogni pila Z.
  7. Designare una cartella di file in cui salvare le immagini. Eseguire il programma di imaging automatizzato.

8. Raccolta e analisi dei dati

  1. Contare il numero di bacilli aderenti e cellule di mammiferi per immagine. Contare ogni catena di bacilli come un batterio.
  2. Tracciare i bacilli/cellule del siero e del titolo del test di controllo positivo (ad esempio, la diluizione 1:10 è di 10 unità di titolo) per generare una curva standard in un programma statistico appropriato.
  3. Analizzare il siero di prova del controllo positivo utilizzando il raccordo della curva di regressione non lineare. Quindi analizzare i campioni rimanenti utilizzando la curva standard del siero di prova di controllo positivo per determinare i titer corrispondenti.
    NOTA: Di solito è più accurato scegliere le diluizioni del campione vicino al centro della curva standard quando si determinano i titolori.
  4. Calcola la media geometrica dei campioni di ogni gruppo di vaccini. Calcolare i valori P- dei formicolii trasformati di log in base all'analisi ANOVA della differenza meno significativa.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Questa sezione mostra le micrografie rappresentative raccolte durante un esperimento OAA insieme ai risultati che mostrano che l'OAA può essere utilizzato per esaminare la funzione biologica degli anticorpi. Qui, il test è stato utilizzato con successo per valutare l'efficacia di un candidato al vaccino contro l'antrace. È fondamentale verificare lo stato di incapsulamento sui bacilli poiché il poco o nessun incapsulamento li fa aderire alle cellule ospiti, producendo uno sfondo elevato. La figura 1<...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

I vaccini a base di capsule hanno dimostrato di essere efficaci contro numerosi agenti patogeni batterici e molti sono autorizzati perl'uso nell'uomo 25,26,27. Questi vaccini funzionano generando anticorpi mirati alla capsula e molti di questi studi utilizzano l'OPKA per mostrare le funzioni opsono-fagocitichedegli anticorpi 13,14,16,

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno un'associazione commerciale o di altro tipo che potrebbe rappresentare un conflitto di interessi.

Ringraziamenti

J. Chua, D. Chabot e A. Friedlander disegnano le procedure descritte nel manoscritto. J. Chua e T. Putmon-Taylor eseguirono gli esperimenti. D. Chabot ha eseguito l'analisi dei dati. J. Chua scrisse il manoscritto.

Gli autori ringraziano Kyle J. Fitts per l'eccellente assistenza tecnica.

Il lavoro è stato supportato dalla concessione della Defense Threat Reduction Agency CBM. VAXBT.03.10.RD.015, piano numero 921175.

Opinioni, interpretazioni, conclusioni e raccomandazioni sono quelle degli autori e non sono necessariamente approvate dall'esercito degli Stati Uniti. Il contenuto di questa pubblicazione non riflette necessariamente le opinioni o le politiche del Dipartimento della Difesa, né la menzione di nomi commerciali, prodotti commerciali o organizzazioni implica l'approvazione da parte del governo degli Stati Uniti.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,20 & micro; m filtro per siringa (25 mm, cellulosa rigenerata)Corning, Corning, NY431222
10 ml (punta Luer-Lok)BD, Franklin Lakes, NJ302995
15µ 96 pozzetti piastre nere (piastra #1 per imaging)In Vitro Scientific, Sunnyvale, CAP96-1-N
16% paraformaldeideMicroscopia elettronica, Hatfield, PA15710
Pallone trattato con coltura tissutale di 75 cmquadrati Corning, Corning, NY430641
Agar (polvere)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOA1296
Baby Rabbit ComplementCedarlane Labs, Burlington, NCCL3441
Estratto di lievito BactoBD, Sparks, MD288620
BBL Brain Heart Infusion (BHI)BD, Sparks, MD211059
Piastre Blood Agar (TSA con sangue di pecora)Remel, Lenexa, KSR01198
Raschietto cellulareSarstedt, Newton, NC83.183
Costar Piastre per colture cellulari a 96 pozzetti (piastre #2 e 3 per diluizioni)Corning, Corning, NY3596
Vetro di coperturaMicroscopia elettronica Science, Hatfield, PA72200-10
Brodo nutrienteDifco BD, Sparks, MD234000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), alto glucosioGibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA11965-092contiene 4500 mg/L di glucosio, 4 mM di L-glutammina, Phenol Red
EVOS FL Auto Cell Imaging System (microscopio a fluorescenza)Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAAMAFD1000
Sierofetale bovinoHyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UTSH30071.03non irradiato con raggi gamma, non inattivato dal calore
Isotiocianato di fluoresceinaInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAF143
HCS Cell Mask Orange Cell StainInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAEmocitometro H32713
(Neubauer migliorato)Hausser Scientific, Horsham, PA3900
Soluzione di inchiostro di chinaBD, Sparks, MD261194
L-glutammina (200 mM)Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA25030081integrare il terreno con 2 mM di L-glutammina aggiuntiva
Nikon Eclipse TE2000-U (microscopio composto invertito)Nikon Instruments, Melville, NYTE2000
PBS senza calcio o magnesioLonza, Walkersville, MD17-516F
Soluzione di penicillina-streptomicina, 100xHyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UTSV30010
piastre di Petri (100 x 15 mm)Falcon, Corning, Durham, NC351029per piastre di agar
RAW 264.7 linea cellulare di macrofagi (Tib47)ATCC, Manassas, VAATCC TIB-71
VetriniVWR, Radnor, PA16004-422
Bicarbonato di sodioSigma-Aldrich, St. Louis, MOS5761
Soluzione di blu di tripano (0,4%)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOT8154
Microscopia a scansione laser Zeiss 700 (microscopio confocale)Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY4109001865956000
siringa da

Riferimenti

  1. Walters, M. N., Papadimitriou, J. M. Phagocytosis: a review. CRC Critical Reviews in Toxicology. 5 (4), 377-421 (1978).
  2. Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoologischen Instituten der Universität Wien. 5, 144(1883).
  3. Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
  4. Janeway, C. A. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunology Today. 13 (1), 11-16 (1992).
  5. Kumagai, Y., Akira, S. Identification and functions of pattern-recognition receptors. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (5), 985-992 (2010).
  6. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review of Pathology. 7, 61-98 (2012).
  7. Candela, T., Fouet, A. Poly-gamma-glutamate in bacteria. Molecular Microbiology. 60 (5), 1091-1098 (2006).
  8. Kocianova, S., et al. Key role of poly-gamma-DL-glutamic acid in immune evasion and virulence of Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 688-694 (2005).
  9. Rothbard, S. Protective effect of hyaluronidase and type-specific anti-M serum on experimental group A Streptococcus infection in mice. Journal of Experimental Medicine. 88 (3), 325-342 (1948).
  10. Oh, S. Y., Budzik, J. M., Garufi, G., Schneewind, O. Two capsular polysaccharides enable Bacillus cereus G9241 to cause anthrax-like disease. Molecular Microbiology. 80 (2), 455-470 (2011).
  11. Knuf, M., Kowalzik, F., Kieninger, D. Comparative effects of carrier proteins on vaccine-induced immune response. Vaccine. 29 (31), 4881-4890 (2011).
  12. Wang, T. T., Lucas, A. H. The capsule of Bacillus anthracis behaves as a thymus-independent type 2 antigen. Infection & Immunity. 72 (9), 5460-5463 (2004).
  13. Vogel, L., et al. Quantitative flow cytometric analysis of opsonophagocytosis and killing of nonencapsulated Haemophilus influenzae by human polymorphonuclear leukocytes. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1 (4), 394-400 (1994).
  14. Salehi, S., Hohn, C. M., Penfound, T. A., Dale, J. B. Development of an Opsonophagocytic Killing Assay Using HL-60 Cells for Detection of Functional Antibodies against Streptococcus pyogenes. mSphere. 3 (6), 00617-00618 (2018).
  15. Wang, Y., et al. Novel Immunoprotective Proteins of Streptococcus pneumoniae Identified by Opsonophagocytosis Killing Screen. Infection & Immunity. 86 (9), (2018).
  16. Humphries, H. E., et al. Seroprevalence of Antibody-Mediated, Complement-Dependent Opsonophagocytic Activity against Neisseria meningitidis Serogroup B in England. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (5), 503-509 (2015).
  17. List of Tier 1 BSAT. , Available from: www.selectagents.gov/ohp-app1.html (2017).
  18. Jansen, W. T., et al. Use of highly encapsulated Streptococcus pneumoniae strains in a flow-cytometric assay for assessment of the phagocytic capacity of serotype-specific antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 5 (5), 703-710 (1998).
  19. Wang, T. T., Fellows, P. F., Leighton, T. J., Lucas, A. H. Induction of opsonic antibodies to the gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis by immunization with a synthetic peptide-carrier protein conjugate. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (3), 231-237 (2004).
  20. Chabot, D. J., et al. Protection of rhesus macaques against inhalational anthrax with a Bacillus anthracis capsule conjugate vaccine. Vaccine. 34 (34), 4012-4016 (2016).
  21. Chabot, D. J., et al. Efficacy of a capsule conjugate vaccine against inhalational anthrax in rabbits and monkeys. Vaccine. 30 (5), 846-852 (2012).
  22. Revised FSAP Policy Statement: Inactivated Bacillus anthracis and Bacillus cereus Biovar anthracis. , Available from: www.selectagents.gov/policystatement_bacillus.html (2017).
  23. Chua, J., et al. Formaldehyde and Glutaraldehyde Inactivation of Bacterial Tier 1 Select Agents in Tissues. Emerging Infectious Diseases. 25 (5), 919-926 (2019).
  24. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition). , Available from: https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
  25. Durando, P., et al. Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults. Clinical Microbiology and Infection. 19, Suppl 1 1-9 (2013).
  26. Adams, W. G., et al. Decline of childhood Haemophilus influenzae type b (Hib) disease in the Hib vaccine era. JAMA. 269 (2), 221-226 (1993).
  27. Balmer, P., Borrow, R., Miller, E. Impact of meningococcal C conjugate vaccine in the UK. Journal of Medical Microbiology. 51 (9), 717-722 (2002).
  28. Chen, M., et al. Induction of opsonophagocytic killing activity with pneumococcal conjugate vaccine in human immunodeficiency virus-infected Ugandan adults. Vaccine. 26 (38), 4962-4968 (2008).
  29. Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (146), e59400(2019).
  30. Ezzell, J. W., Welkos, S. L. The capsule of Bacillus anthracis, a review. Journal of Applied Microbiology. 87 (2), 250(1999).
  31. Hanna, P. C., Acosta, D., Collier, R. J. On the role of macrophages in anthrax. Proceedings of the National Academies of Sciences of the United States of America. 90 (21), 10198-10201 (1993).
  32. Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
  33. Chua, J., Deretic, V. Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36982-36992 (2004).
  34. Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infection & Immunity. 85 (1), (2017).
  35. Ober, R. J., Radu, C. G., Ghetie, V., Ward, E. S. Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies. International Immunology. 13 (12), 1551-1559 (2001).
  36. Sorman, A., Zhang, L., Ding, Z., Heyman, B. How antibodies use complement to regulate antibody responses. Molecular Immunology. 61 (2), 79-88 (2014).
  37. Henckaerts, I., Durant, N., De Grave, D., Schuerman, L., Poolman, J. Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children. Vaccine. 25 (13), 2518-2527 (2007).
  38. Wolf, J. J. Special Considerations for the Nonclinical Safety Assessment of Vaccines. , Elsevier. 243-255 (2013).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Cellule RAW 264.7Microscopia a fluorescenzaMarcatura con FITCOpsonizzazione del complementoImaging automatizzatoVerifica dell'incapsulamentoTest di sterilitàEfficacia del vaccino
Test opsono-aderenza per valutare gli anticorpi funzionali nello sviluppo del vaccino contro bacillus anthracis e altri agenti patogeni incapsulati
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.